第3節　燒傷和膿毒癥代謝紊亂機制初探

對嚴重燒傷和膿毒癥中代謝紊亂的發生發展規律和相關機制的研究，大致可劃分為糖、蛋白、脂類代謝的細胞和分子機制研究及其對機體整體代謝影響的分析等幾個側面。

一、骨骼肌“有氧糖酵解”

近年來的研究提示，燒傷和膿毒癥中組織細胞存在糖酵解增強的現象。基于經典的糖代謝理論，有氧氧化的供能效率（38mol ATP/1mol葡萄糖）遠高于糖酵解（2mol ATP/1mol葡萄糖），生物組織細胞在氧供充分的條件下總是利用有氧氧化代謝供能，而不利用低效的糖酵解供能方式。因此，通常認為，高乳酸血癥的發生主要機制：①組織缺血缺氧導致糖酵解過程增強；②組織細胞功能紊亂，能量代謝機制障礙。然而，近年來有關膿毒癥病理過程的深入研究提示：①膿毒癥動物中，組織乳酸生成的增加先于組織缺氧的發生；②充分的復蘇治療，可以維持有效循環和足夠的組織氧供，從而防止細胞缺氧，卻無法避免高乳酸血癥的發生；③應用核素示蹤代謝底物監測法，磁共振光譜分析法等對燒傷及膿毒癥動物細胞代謝過程的監測和分析顯示，在燒傷休克及膿毒癥狀態下，組織細胞的線粒體功能及有氧氧化過程并無障礙。

據此提出有氧糖酵解的概念，即組織細胞在氧供充分的條件下依然存在糖酵解過程增強、乳酸產生量增加的病理生理狀態。

在某些情況下，糖酵解增強有積極的病理意義。例如，創面組織細胞的糖酵解增強所導致的局部乳酸濃度升高是局部酸性環境產生和維持的重要因素，這一方面有利于控制細菌的生長和繁殖；另一方面可刺激膠原代謝，對組織修復和重塑有積極意義。

然而，對有氧糖酵解發生發展過程和機制的研究尚處于起步階段。國內少見相關報道。國外有關領域的研究，已在多種病理過程導致的膿毒癥中，觀察到有氧糖酵解增強的現象；而目前研究的焦點則集中于對膿毒癥狀態糖代謝整體動力學的分析，而對糖代謝機制發生變化的細胞生理學基礎研究則很少開展。

我們在這一領域開展了初步的研究。考慮到骨骼肌細胞在機體組織細胞中占有相當大的比重（40%），對機體整體代謝水平影響巨大，因此我們的研究主要以骨骼肌為對象。借助大鼠燒傷和膿毒癥模型，建立肌肉的充分供氧離體孵育系統，選擇含60%紅肌纖維、30%中間肌纖維的比目魚肌和含45%白肌、45%中間肌纖維的趾長伸肌，進行了較為系統的觀察和分析。

1．嚴重燒傷、膿毒癥時不同的肌纖維類型在“有氧糖酵解”中的特點

研究表明，兩種骨骼肌在正常、燒傷后和膿毒癥狀態下，其有氧糖酵解的變化幅度有顯著不同（圖10-1、圖10-2）。這提示不同的肌纖維具有各自不同的糖酵解特點。以紅肌為主的比目魚肌與以白肌為主的趾長伸肌相比，其有氧糖酵解水平偏低，燒傷后有氧糖酵解增強的幅度亦較小，而在膿毒癥狀態下，兩種肌肉組織的有氧糖酵解則均有顯著的增強。

2．嚴重燒傷、膿毒癥時骨骼肌“有氧糖酵解”的發生機制

利用特異性Na＋-K＋-ATP酶抑制劑——毒毛旋花苷G，干預細胞膜鈉鉀泵的活性，觀察細胞膜有關能量代謝狀態的改變對正常及膿毒癥大鼠的不同類型骨骼肌乳酸產生量的影響，結果提示，白肌纖維較多的趾長伸肌，不僅在正常狀態下乳酸的產生量仍較比目魚肌為多，而且對毒毛旋花苷G的反應性亦較為敏感（圖10-3、圖10-4）。

這提示與紅肌纖維相比，白肌纖維的有氧糖酵解過程在其細胞生理活動中具有更為重要的意義。同時，膿毒癥肌肉組織的乳酸產生量顯著高于正常對照，而膿毒癥對肌肉細胞有氧糖酵解的這種刺激作用能明顯地被Na＋- K＋-ATP酶抑制劑所阻斷。這表明Na＋-K＋-ATP酶活性的增加以及與之相關的細胞生理活動的增強是膿毒癥刺激肌肉細胞有氧糖酵解增強的重要原因。

利用鈉離子載體——莫能霉素（monensin）干預細胞內外的鈉離子分布狀態，我們分析和觀察了細胞內鈉離子濃度變化對正常及膿毒癥大鼠的不同類型骨骼肌乳酸產生量的影響（表10-11、圖10-5）。

研究顯示，肌肉組織細胞膜Na＋通透性的改變以及細胞內Na＋濃度的增加可誘導肌肉組織有氧糖酵解過程的增強。這一機制在膿毒癥所導致的肌肉組織有氧糖酵解過程的增強中有重要意義。同時，含白肌纖維較多的趾長伸肌對莫能霉素的敏感性高于比目魚肌。而且，在正常孵育狀態和高濃度的莫能霉素環境下，趾長伸肌的乳酸產生量均高于比目魚肌。這提示白肌纖維的有氧糖酵解水平和潛力均高于紅肌纖維（圖10-6、圖10-7）。

二、嚴重燒傷、膿毒癥骨骼肌蛋白分解代謝的機制及意義

高代謝或高分解代謝是嚴重創傷、燒傷、大手術等應激病理狀態下物質與能量代謝改變的顯著特點，這種高分解代謝在膿毒癥時具有“自噬性”和“強制性”特點，因為這種強烈的促體內蛋白分解，抑制糖和脂類利用的高代謝反應，可使機體迅速陷入負氮平衡和營養不良，導致并發癥的發生。針對高度應激病理狀態下的高分解代謝，臨床上主要采取的措施是營養支持、促進合成代謝等，雖然這些措施改善了營養代謝狀態，但在嚴重燒傷膿毒癥狀態下單純支持、促合成措施有其片面性，臨床效果往往不佳。隨著研究的深入，人們逐漸意識到分解代謝在這一病理過程中的重要性，尤其是嚴重燒傷膿毒癥等病理應激狀態下的高分解代謝，特別是占機體細胞總重量50%的骨骼肌，可能對整體代謝產生深遠影響。骨骼肌蛋白分解機制的闡明有可能使人們不僅僅認識到，氨基酸從骨骼肌蛋白中釋放有益于急性期患者，提供機體用于糖異生、新蛋白合成和產生能量所必需的氨基酸，支持了重要器官的結構和功能等，同時更重要的是將有助于人們從理論上闡明，高度應激狀態下骨骼肌蛋白高分解代謝的機制，以便于在疾病的某階段進行干預或調控，獲得降低其高分解消耗的“自噬性”和“強制性”突破性措施。

（一）骨骼肌蛋白高分解代謝的危害性

蛋白質是細胞組織的主要成分之一。正常的氮平衡是維持組織細胞生長、更新的前提。此外，體內有多種特殊功能的蛋白質，例如酶、多肽類激素、抗體和調節蛋白等。肌肉收縮、氧氣運輸、血液凝固等均由功能蛋白來實現。氨基酸代謝還可產生胺類、神經介質等含氮化合物。蛋白質降解成氨基酸后，經脫氨基作用生成的α-酮酸可以直接或間接參加三羧酸循環氧化分解、供能。一般來說，成人每日約有18%的能量來自蛋白質，但是供能是蛋白質的次要功能。嚴重燒傷和膿毒癥早期，機體抗脂解激素的分泌導致脂類的利用受到限制。燒傷膿毒癥時骨骼肌細胞內有氧糖酵解增強，蛋白降解率明顯升高。這提示燒傷膿毒癥時糖和脂類的供能利用遠不能滿足機體高代謝的需求。由于骨骼肌占機體細胞干重的50%以上，是機體最大的含氮庫，如果大量的結構蛋白被分解供能，不僅導致負氮平衡，還會引發并發癥。從目的論來講骨骼肌的這種分解代謝反應在嚴重燒傷膿毒癥早期對機體是有利的，如向重要器官提供了游離氨基酸，有利于機體保護性調節反應，如供肝臟合成急性期蛋白及糖異生，供給免疫系統細胞和腸上皮細胞大量谷氨酸以適應其需要量的明顯增加等。但由于機體中沒有供儲備的蛋白質，所有蛋白均被認為是有功能的。骨骼肌分解代謝增強主要表現為肌纖維蛋白分解的增強，而單純靠補充營養素并不能有效改善骨骼肌蛋白的高分解代謝。肌纖維蛋白的過度消耗，長期負氮平衡的后果是嚴重的。如果是四肢肌肉，尤其是小腿肌肉萎縮和消耗，靜脈血栓形成和器官栓塞的危險性就會明顯增加；患者的呼吸肌一旦受到影響，將會有肺部并發癥的出現。事實上因嚴重肌肉蛋白分解代謝而死亡的患者，多是由于不能清除肺內分泌物和由此引發的肺部感染所致。既然骨骼肌蛋白分解代謝對機體整體代謝產生如此深遠的影響，那么，是什么機制在控制著骨骼肌蛋白分解過程？影響因素是什么？這些基本問題的闡明將有助于臨床采取措施調控骨骼肌蛋白高分解代謝。

（二）骨骼肌蛋白降解途徑-泛素-蛋白酶體途徑

骨骼肌細胞和其他機體細胞一樣具有多種蛋白降解途徑，如溶酶體蛋白降解途徑、鈣依賴蛋白酶（calpain）系統、泛素-蛋白酶體途徑，但究竟是哪種途徑在骨骼肌蛋白降解中占主導地位呢？新近的研究發現，將膿毒癥動物骨骼肌孵育液中添加泛素-蛋白酶體能量依賴途徑的ATP，結果是反映骨骼肌總蛋白降解率的酪氨酸（Tyr）增加了172%和反映骨骼肌肌纖維蛋白降解率的3-甲基組氨酸（3-MH）增加了4倍多；應用溶酶體的半胱氨酸酶抑制劑leupeptin和E64來阻斷溶酶體蛋白降解途徑后，骨骼肌蛋白降解率未見明顯變化；應用鈣依賴途徑的抑制劑阻斷鈣依賴性途徑后，骨骼肌蛋白降解率較對照組無差異。新近我們的研究也證實了抑制溶酶體蛋白降解途徑和阻斷鈣依賴性蛋白降解途徑后，骨骼肌蛋白降解率未見明顯變化，相反，使用MG132阻斷泛素-蛋白酶體途徑后，骨骼肌蛋白降解率顯著降低。以上研究結果表明膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白降解增加可能不是經由溶酶體蛋白降解途徑和鈣依賴性途徑介導，而是泛素-蛋白酶體途徑。

泛素-蛋白酶體途徑從發現至今已有20年的歷史，其主要特點是高度選擇性和能量依賴性。泛素-蛋白酶體途徑由泛素（ubiquitin）、泛素相關酶、蛋白酶體和輔助酶四部分組成。泛素是泛素-蛋白酶體蛋白降解途徑中重要的組成部分，由76個氨基酸殘基組成的、相對分子質量約為8500的高度保守熱穩定多肽，它存在于所有有核細胞中。相關酶包括泛素活化酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛素偶聯酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2s）、泛素-蛋白連接酶E3s（ubiquitin-protein ligating enzymes）、泛素碳末端水解酶（ubiquitin-end hydrolysis）或異肽酶（isopeptidase）和蛋白酶體（proteasome）。E1是催化泛素與蛋白底物結合所需的第一個酶，細胞內含量豐富，為細胞的活性和生存所必需。E2s是泛素與蛋白底物結合所需的第二個酶，多數E2s為小相對分子質量蛋白質，E3s是泛素與蛋白底物結合所需的第三個酶。E3s在決定泛素介導底物蛋白降解的選擇性方面具有重要意義。泛素碳末端水解酶或異肽酶能夠使游離泛素再循環，對泛素系統的正常運行必不可少。20s蛋白酶體和26s蛋白酶體作為多亞基高相對分子質量復合體是催化泛素與底物蛋白偶聯體降解的關鍵酶。我們新近的研究結果顯示，泛素-蛋白酶體途徑在嚴重燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白高分解代謝過程中確實發生了變化，而其改變與嚴重燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白代謝有著本質的聯系，并有多種因素調節著骨骼肌蛋白的高分解代謝過程。

（三）泛素-蛋白酶體途徑在嚴重燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白降解中的作用

研究表明，肌細胞胞質很少，大部分由肌纖維蛋白構成，而肌纖維蛋白主要由肌動蛋白（actin）和肌凝蛋白（myosin）組成。3-甲基組氨酸（3-MH）是一種只存在于肌肉肌動蛋白和肌凝蛋白的氨基酸，釋放產生的3-MH由于不再參與骨骼肌細胞新蛋白的合成，故其釋放量可間接反映肌纖維蛋白的降解，而酪氨酸（tyrosine, Tyr）存在于肌細胞所有蛋白中，故其釋放量可間接反映總蛋白的降解。我們新近的研究表明，燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥的大鼠，無論是反映骨骼肌總蛋白降解率的酪氨酸還是反映肌纖維蛋白降解率的三甲基組氨酸（3-MH），都較無燒傷組顯著增加，尤其是肌纖維蛋白的降解率增加更顯著。同時隨著燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥傷情的加重，骨骼肌蛋白降解率增加更明顯。有趣的是在上述3種動物模型情況下比目魚肌總蛋白降解率和肌纖維蛋白降解率變化不明顯。這與我們以往有關骨骼肌“有氧糖酵解”的研究結果是一致的。不同的肌纖維類型（比目魚肌含60%的紅肌纖維和30%中間肌纖維，趾長伸肌含45%白肌纖維和45%中間肌纖維）各有其不同的代謝特點。進一步的研究發現，在骨骼肌組織中Tyr和3-MH增加的同時，泛素2.4kb的mRNA表達上調，說明骨骼肌蛋白降解增強與泛素-蛋白酶體蛋白降解途徑在轉錄水平被激活密切相關。我們所做的相關性分析亦證實，泛素mRNA表達增加與Tyr和3-MH增加量之間均呈顯著正相關。

在另外一組實驗中，我們專門研究了燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥大鼠泛素-蛋白酶體降解途徑中重要組成成分泛素、E2-14K、RC2亞基轉錄表達，結果發現在上述3種不同病理狀態下，①大鼠趾長伸肌組織泛素mRNA在2.4kb和1.2kb相對分子質量區域條帶表達明顯，尤以2.4kb條帶泛素mRNA表達上調顯著，燒傷組增加310%，膿毒癥組增加470%，燒傷合并膿毒癥組增加679%。提示傷情越重，泛素基因表達增強越顯著。②E2-14kb含有2種mRNA片段，長度分別為1.8kb、1.2kb，兩者起源于同一基因，只是堿基對和編碼區不同，我們的研究結果顯示，在燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥3種不同的刺激條件下，骨骼肌組織E2-14kb在1.2kb條帶基因轉錄水平出現不同程度的表達增強。而1.8kb條帶無明顯變化。結果說明，在骨骼肌蛋白降解中，發生了某種基因轉錄失控，使1.2kb mRNA轉錄增多，以滿足機體的需要，但其轉錄失控的確切機制和調控因子尚不清楚，兩種轉錄片段的不同表達能否推斷兩者在骨骼肌蛋白降解中具有不同的功能還有待進一步研究。③20s蛋白酶體亞基RC2在燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥不同刺激條件下，大鼠骨骼肌組織中mRNA表達，均出現顯著增強，其中燒傷組增加121%，膿毒癥組增加168%。燒傷合并膿毒癥組增加238%。20s蛋白酶體亞基RC2在轉錄水平的表達增強更進一步說明泛素-蛋白酶體途徑參與燒傷，尤其是燒傷合并膿毒癥時骨骼肌蛋白的降解，這為了解分解狀態下骨骼肌蛋白高消耗的分子機制提供了證據。

游離泛素及泛素化蛋白在燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥大鼠趾長伸肌組織中均發生了不同程度的變化，如燒傷組游離泛素2h、6h、12h、24h分別增加15%、17%、33%、30%，泛素化蛋白分別增加46%、52%、186%、163%；膿毒癥組2h、6h游離泛素分別增加21%、46%，12h和24h較對照組無明顯差異。泛素化蛋白2h增加140%，6h增加240%，12h和24h泛素化蛋白較正常對照組無統計學意義。燒傷合并膿毒癥組游離泛素分別增加45%、76%、38%、29%；泛素化蛋白分別增加191%、335%、168%、127%，提示在嚴重燒傷膿毒癥幾種病理狀態下，泛素蛋白水平表達增強和流經該途徑的底物蛋白也顯著增加。

隨著燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥傷情的加重，泛素蛋白在大鼠趾長伸肌胞質中淡黃色顆粒狀泛素陽性物質異常分布越明顯。這說明泛素-蛋白酶體途徑中的泛素在骨骼肌組織中蛋白表達出現明顯增加，結合與骨骼肌蛋白降解率增加間的關系，更進一步說明在燒傷、膿毒癥、燒傷合并膿毒癥狀態下泛素-蛋白酶體途徑在骨骼肌蛋白降解中具有重要作用。

（四）激活泛素-蛋白酶體途徑導致骨骼肌蛋白降解增強中的調節因子

既往的研究表明，嚴重燒傷膿毒癥時常伴有炎癥介質的大量釋放，是誘發高代謝的重要原因之一。參與調節骨骼肌蛋白分解代謝的細胞因子可能主要是IL-1、IL-6、TNF和糖皮質激素。

1．激素調節

臨床觀察顯示，嚴重燒傷膿毒癥患者外周血皮質醇濃度明顯升高，24h尿內3-MH排出量顯著增加，3-MH排出量與外周血皮質醇濃度變化呈顯著正相關；股四頭肌泛素-蛋白酶體組分mRNA表達顯著增加，說明重癥燒傷膿毒癥患者體內糖皮質激素增加，從基因水平激活泛素-蛋白酶體途徑，導致骨骼肌蛋白降解增強。我們在動物實驗中也發現，燒傷后大鼠趾長伸肌總蛋白降解率明顯增加，更以肌纖維蛋白為顯著，泛素-蛋白酶體途徑中的20s蛋白酶體亞基RC2mRNA表達上調，且與肌纖維蛋白降解率呈顯著正相關。在另一組的研究中發現，燒傷后血漿糖皮質激素水平，與肌纖維蛋白降解率和RC2 mRNA表達呈高度正相關。進一步研究發現，地塞米松是通過糖皮質激素受體在基因水平增強泛素蛋白酶體途徑活性的，從而導致嚴重燒傷、膿毒癥大鼠骨骼肌總蛋白，特別是肌纖維蛋白降解增強，而給予糖皮質激素受體拮抗劑干預可有效阻斷泛素-蛋白酶體多種組分的表達，同時可有效抑制骨骼肌蛋白降解率。這些研究結果說明，燒傷膿毒癥時骨骼肌蛋白降解增強與泛素-蛋白酶體組分高表達有關，糖皮質激素參與了骨骼肌蛋白降解過程。

2．細胞因子調節

我們新近的研究結果表明，燒傷膿毒癥大鼠趾長伸肌蛋白降解率與血漿內TNF-α濃度呈顯著正相關，同時骨骼肌泛素組分2.4kb mRNA和C2 mRNA的表達均升高，而變化趨勢與血漿TNF-α的含量變化趨勢是一致的；TNF-α亦能使離體孵育骨骼肌泛素系統組分mRNA表達上調；靜脈注射TNF-α骨骼肌重量減輕，蛋白降解增強，糖皮質激素受體拮抗劑可有效抑制骨骼肌蛋白降解。于體外培養的骨骼肌肌管中加于TNF-α，能顯著增強骨骼肌蛋白降解率。而使用蛋白酶體抑制劑可顯著降低骨骼肌蛋白降解率，這些研究結果說明，TNF-α能與骨骼肌細胞間接或直接發生作用，增強泛素蛋白降解途徑的活性，參與骨骼肌蛋白降解過程。

最近的研究發現，泛素-蛋白酶體系統的活化與轉錄因子的活化有著密切關系。燒傷膿毒癥狀態下骨骼肌NF-κB活性明顯增加，而使用NF-κB的抑制劑PDTC（二硫代氨基甲酸吡咯烷）可明顯降低NF-κB在骨骼肌中的活性，與此同時骨骼肌總蛋白及纖維蛋白的降解率明顯下降，說明通過使用NF-κB抑制劑確能起到調控膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白分解代謝的作用，也說明炎癥介質過度釋放是導致燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白降解增強的重要原因。

3．治療與研究展望

嚴重燒傷膿毒癥狀態下的骨骼肌高分解代謝，目前尚無一種有效的防治措施。單純增加熱量和蛋白供給并不能較好地改善負氮平衡，只是增加了尿中氮源性廢物。給予生長激素、類胰島素樣生長因子等激素類治療，盡管骨骼肌蛋白降解可減少，但同時有很多副作用。泛素-蛋白酶體途徑研究的進展，使我們對骨骼肌消耗的分子機制有了較好了解，它是嚴重燒傷膿毒癥時骨骼肌蛋白降解的重要途徑。糖皮質激素、TNF等介質是直接或間接導致骨骼肌蛋白降解的重要誘導或調節因子。抑制炎癥介質NF-κB途徑可有效降低膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白降解率。早期切除燒傷的焦痂導致泛素轉錄表達、蛋白表達下降，骨骼肌蛋白降解減少。應用泛素-蛋白酶體抑制劑可減少實驗動物骨骼肌蛋白降解率，但其臨床應用的可行性尚未得到證實。初步的研究結果說明，防治嚴重燒傷膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白高分解消耗的有效方法，首先是消除其根源，防治膿毒癥，即治病；其次是針對泛素-蛋白酶體途徑的作用機制和調節機制進行調控，這將是減少機體骨骼肌蛋白高分解消耗的有效措施之一。

然而，有關泛素-蛋白酶體途徑在嚴重燒傷膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白降解中的作用研究尚處于探索階段，仍有許多問題需要澄清。例如嚴重燒傷膿毒癥狀態下炎癥介質是如何相互作用導致骨骼肌蛋白消耗，骨骼肌蛋白降解的分子機制中哪些蛋白被泛素化，具體識別機制是什么，這些蛋白與泛素偶聯通過哪些具體酶的催化，泛素-蛋白偶聯體如何被26s蛋白酶體識別、降解等問題還需廣泛地研究。相信隨著嚴重燒傷膿毒癥狀態下骨骼肌蛋白降解機制和調節機制研究的深入，這些問題都會找到答案。

（柴家科　吳焱秋　申傳安）