1.4.5　定向進化

從生物化學(xué)和分子生物學(xué)的角度來講，定向進化（directed evolution）是指模仿自然進化過程，通過基因多樣化和突變庫篩選的迭代循環(huán)，加速實現(xiàn)在胞內(nèi)或胞外進行的自然進化過程。定向進化可以在不了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和作用機制的前提下，獲得期望功能或全新功能的蛋白質(zhì)。“定向進化”這一概念于20世紀90年代由生物工程學(xué)家Frances Arnold教授提出，在酶工程領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。

近年來，包括高效構(gòu)建基因突變庫的方法、高通量篩選突變庫的方法、連續(xù)定向進化策略、自動化生物合成平臺助力定向進化在內(nèi)的策略，提升了定向進化的效率，使得突變庫的篩選速率提高了百倍以上。

（1）高效基因突變庫構(gòu)建方法。構(gòu)建高效、多樣化的基因突變庫是定向進化的基礎(chǔ)。目前主要的構(gòu)建方法有體外突變法和體內(nèi)突變法。體外突變法主要包括可以產(chǎn)生隨機突變的易錯PCR、DNA改組等。通過將這些傳統(tǒng)方法與基因高通量合成技術(shù)及 DNA 測序技術(shù)相結(jié)合，傳統(tǒng)的體外突變法存在的共有缺陷（如密碼子缺乏控制、具有序列偏好性等）在一定程度上得到了改善。例如，通過采用半理性設(shè)計突變氨基酸的方法，將PCR 反擴載體與 T5 介導(dǎo)的克隆方法聯(lián)用，構(gòu)建了突變效率高達81.25%的檸檬烯環(huán)氧水解酶4個位點組合突變體庫，成功實現(xiàn)了對定點飽和突變庫構(gòu)建方法的改進。體內(nèi)突變法則通過基于CRISPR-Cas 系統(tǒng)的高效胞內(nèi)蛋白質(zhì)定向進化工具，對參與同一代謝途徑的多個蛋白進行定向進化。

（2）新型高通量篩選技術(shù)。開發(fā)更快速、靈敏、準確的高通量篩選技術(shù)，可以最大程度地創(chuàng)建序列覆蓋率高、多樣性強的突變庫，同時能最大程度地發(fā)掘不同氨基酸序列與其對應(yīng)表型之間的關(guān)系。例如，利用文庫展示技術(shù)進行突變庫的高通量篩選，在蛋白質(zhì)工程中得到了廣泛的應(yīng)用，包括噬菌體展示技術(shù)、細胞表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及mRNA展示技術(shù)。

文庫展示技術(shù)（library-based display）將突變的目標蛋白展示于不同的生物體表面，并對蛋白質(zhì)進行直接干擾，使蛋白質(zhì)與外部環(huán)境接觸，從而影響蛋白質(zhì)的降解程度和折疊狀態(tài)，之后通過一定的方法富集、篩選蛋白質(zhì)檢測出相關(guān)的基因信息。其中，噬菌體展示技術(shù)有力地促進了蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，其將蛋白基因插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，隨著噬菌體的傳代，融合蛋白會展示在噬菌體的表面，對應(yīng)的編碼基因則位于病毒顆粒內(nèi)，大量蛋白由此與其 DNA編碼序列建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶等）的配體通過“吸附、洗脫、擴增”得到快速鑒定。除此之外，細胞表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及mRNA展示技術(shù)也可應(yīng)用于突變庫的篩選。一些微型化、自動化和集成化的新型技術(shù)體系也為一些代謝途徑關(guān)鍵酶、優(yōu)勢菌株、催化元件在定向進化過程中的高通量篩選和選擇提供了優(yōu)良的解決方案。

（3）連續(xù)定向進化。連續(xù)定向進化旨在無人為干預(yù)的情況下完成基因突變、蛋白表達、表型選擇與篩選的迭代實驗，其通過縮短每輪的進化時間來增加迭代次數(shù)，利用可自我復(fù)制的生物體，提高獲得目標性狀突變體的概率，在其基因組復(fù)制過程引入突變并利用突變后該生物體復(fù)制擴增能力的差異性變化來實現(xiàn)建庫與篩選這兩個步驟的自動連接和迭代循環(huán)，從而減少人力勞動，使定向進化快速進行。例如，David Liu團隊開發(fā)了噬菌體輔助的連續(xù)進化系統(tǒng)（phage-assisted continuous evolution，PACE），通過設(shè)計特定的基因回路，將 pⅢ的表達與目標蛋白的活性相偶聯(lián)，再通過控制系統(tǒng)使得含有目標活性突變體的噬菌體迭代富集，從而實現(xiàn)進化與篩選自動循環(huán)——可以在24h內(nèi)完成30輪以上的蛋白質(zhì)進化。

（4）計算機輔助定向進化。如果說定向進化的關(guān)鍵在于對突變庫的高效篩選，那么計算機輔助定向進化（主要是采用機器學(xué)習技術(shù)）可以通過構(gòu)建輸入數(shù)據(jù)到輸出數(shù)據(jù)的復(fù)雜函數(shù)關(guān)系，并通過相關(guān)訓(xùn)練模型對訓(xùn)練集以外的序列空間進行探索，因此在篩選和收集正向突變方面有著巨大的優(yōu)勢。不同的算法及軟件，如Modeller、Rosetta以及AlphaFold 2等在內(nèi)的多種方法已廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。其中，AlphaFold 2采用了生物信息學(xué)和物理方法相結(jié)合的雙重預(yù)測方法。例如，George Carman課題組利用 AlphaFold 2預(yù)測了突變的釀酒酵母磷脂酸磷酸酶的結(jié)構(gòu)，通過其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了其催化關(guān)鍵位點并推測了其催化活性機理。盡管計算機輔助定向進化受到用于訓(xùn)練模型的數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量的限制，但大量的研究已證明這的確是定向進化方向頗具發(fā)展前景的方法。計算機輔助定向進化已應(yīng)用于酶結(jié)構(gòu)與底物屬性的預(yù)測、反應(yīng)最佳微環(huán)境的預(yù)測以及酶最佳催化位點的預(yù)測。可以說，隨著計算機技術(shù)和生物技術(shù)的進步，以及序列-功能對數(shù)據(jù)的不斷增長，在酶分子的定向進化過程中，機器學(xué)習技術(shù)會在探索未知酶序列信息以及空間結(jié)構(gòu)中發(fā)揮越來越重要的作用。