1.4.4　基因編輯

基因編輯技術(shù)（gene editing technology）又稱為基因組編輯（genome editing），是一種以特異性改變遺傳物質(zhì)靶向序列為目標(biāo)基因，通過刪除、替換、插入等操作，獲得新的功能或表型，甚至創(chuàng)造新的物種。

從最初的基因打靶技術(shù)到鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）以及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9系統(tǒng)，再到以堿基編輯技術(shù)為代表的新興技術(shù)的出現(xiàn)，基因編輯技術(shù)經(jīng)過不斷的發(fā)展和完善，變得更加靈活、高效。基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用在農(nóng)業(yè)育種和作物改良以及人類疾病的基因治療方面展現(xiàn)出巨大的潛力，開創(chuàng)了全球生命科學(xué)研究的新時代。

（1）ZFN。作為第一代基因編輯技術(shù)，ZFN使用同時包含DNA識別結(jié)合域（鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域）和DNA裂解域的核酸酶（限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的核酸酶切活性區(qū)域）形成的能夠產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DSB的系統(tǒng)來執(zhí)行基因編輯功能。ZFN由Chandrasegaran團(tuán)隊(duì)于1996年提出。ZFN的α螺旋中的1、3、6位的氨基酸分別特異性地識別并結(jié)合DNA序列中的3個連續(xù)的堿基，這也使得鋅指核酸酶能定位于復(fù)雜基因組內(nèi)的獨(dú)特的靶向序列。利用內(nèi)源DNA修復(fù)機(jī)制，鋅指核酸酶可用于精確修飾高等生物的基因組。然而，ZFN的序列特異性也使得其具有目標(biāo)識別率低、成本高等特點(diǎn)，限制了它的大范圍應(yīng)用。

（2）TALEN。TALEN同樣使用同時包含DNA識別結(jié)合域和DNA裂解域的核酸酶。與ZFN不同的是，TALEN將TALE蛋白與FokⅠ內(nèi)切酶區(qū)域加以結(jié)合。由于4種堿基都有各自對應(yīng)的TALE模塊，因此TALEN可以通過目標(biāo)序列的不同組裝不同的TALE識別模塊，加強(qiáng)了其設(shè)計(jì)的簡便性。但其目標(biāo)識別率低、成本高、脫靶概率高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等問題仍未得到解決。

（3）CRISPR/Cas9系統(tǒng)。學(xué)術(shù)界對于便捷、識別率高的基因編輯技術(shù)的渴望推動了新一代基因編輯技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)源于細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可直接用于基因突變或基因敲除。CRISPR/Cas9的基本原理是利用向?qū)?RNA介導(dǎo) Cas 蛋白在特定的靶標(biāo)序列處引起 dsDNA的斷裂，然后利用同源重組方法進(jìn)行精準(zhǔn)的 DNA序列替換或利用非同源末端連接方法進(jìn)行靶標(biāo)基因的中斷。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過CRISPR RNA（crRNA）和trans-activating crRNA（tracrRNA）以及Cas9蛋白組成的復(fù)合體抵御外源性DNA的入侵。Cas9是一種與sgRNA結(jié)合的核酸酶，通過sgRNA中存在的一個20 bp的核苷酸序列，將Cas9激活并靶向到一個特定的基因組位點(diǎn)（稱為原間隔子鄰近基序或PAM位點(diǎn)）。Cas9隨后催化一個靠近PAM位點(diǎn)的DSB，NHEJ修復(fù)低保真度的DSB將在酶切位點(diǎn)形成一個小的插入/刪除，從而在目標(biāo)位點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行突變。與ZFN和TALENs相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、編輯位點(diǎn)精確、脫靶率低等特點(diǎn)，其基因編輯效率超過30%，大大降低了基因編輯的時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。其在抗生素耐藥菌、COVID-19檢測、癌癥治療、高產(chǎn)水稻品種的生產(chǎn)等方面皆有大量的應(yīng)用。

（4）堿基編輯器。單堿基編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對單堿基的精準(zhǔn)編輯，大大降低了編輯過程中對靶基因功能的影響。2016年，美國哈佛大學(xué)David Liu的實(shí)驗(yàn)室使用專門設(shè)計(jì)的Cas9融合蛋白開發(fā)了一個單堿基編輯器，即胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）。2017年，David Liu還公布了其開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE），該編輯器通過使用腺嘌呤脫氨酶促進(jìn)腺嘌呤（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G）。當(dāng)含有腺嘌呤脫氨酶的Cas9融合蛋白被sgRNA靶向到基因組DNA時，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤脫氨生成肌苷（I），肌苷被讀取并復(fù)制為鳥嘌呤殘基。因此，在DNA復(fù)制后，A-T堿基對直接取代了G-C堿基對。目前，單堿基編輯器已應(yīng)用于基因編輯、基因治療、生成相關(guān)動物模型和功能基因篩選。

2020年，Dali Li團(tuán)隊(duì)通過融合激活誘導(dǎo)的人胞嘧啶脫氨酶、腺嘌呤脫氨酶和nCas9，開發(fā)了一種新型的雙功能、高活性堿基編輯器，并將其命名為A&C-BEmax。A&C-BEmax可以有效地轉(zhuǎn)化同一等位基因內(nèi)目標(biāo)序列上的C > T和A > G，雙堿基編輯技術(shù)由此應(yīng)運(yùn)而生。同時，中國科學(xué)院遺傳學(xué)研究所的Caixia Gao和Jiayang Li在nCas9的N端融合了胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ABE7.10，并通過此種方法成功構(gòu)建了4種新型的飽和靶向內(nèi)源性基因突變編輯器（saturated targeted endogenous mutagenesis editor，STEME），依次將其命名為STEME-1～STEME-4。這些堿基編輯器具有在單一sgRNA的引導(dǎo)下誘導(dǎo)C > T和A > G靶位點(diǎn)同時突變的明顯優(yōu)勢，還顯著提高了靶基因的飽和度和突變類型的多樣性。

單堿基編輯器只能催化單一堿基類型的轉(zhuǎn)換，限制了其廣泛的應(yīng)用。使用雙堿基編輯技術(shù)可以同時有效地產(chǎn)生兩種不同的堿基突變，極大地豐富了堿基編輯的手段，使得基因編輯過程在不失精準(zhǔn)性的條件下更加快捷。

（5）轉(zhuǎn)座子類編輯技術(shù)。一般來講，基因編輯技術(shù)依賴于DNA斷裂，這通常會導(dǎo)致錯誤被放置在鏈斷裂修復(fù)部位的DNA中，同時會觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)，從而導(dǎo)致其他不良的細(xì)胞反應(yīng)。因此，研究人員試圖利用轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，在不破壞目標(biāo)位點(diǎn)的情況下插入所需的DNA序列，而不破壞細(xì)胞。轉(zhuǎn)座子可以整合到細(xì)菌基因組的特定位點(diǎn)，而不需要消化DNA。重要的是，整合酶插入DNA的位點(diǎn)完全由它們相關(guān)的CRISPR系統(tǒng)控制。采用轉(zhuǎn)座子類編輯技術(shù)，可以將任何DNA序列插入細(xì)菌基因組中的任何位置。對編輯后的細(xì)菌進(jìn)行測序，在非目標(biāo)位置沒有額外的拷貝的條件下，證實(shí)了整合可以實(shí)現(xiàn)精確的插入。2019年6月，張鋒的團(tuán)隊(duì)從一種藍(lán)細(xì)菌——賀氏偽枝藻（Scytonema hofmanni）中獲得了與CRISPR效應(yīng)蛋白Cas12k相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶，并構(gòu)建了名為CAST的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將nCas9與單鏈DNA轉(zhuǎn)座子TNPA偶聯(lián)，然后檢測大腸桿菌基因組中的蛋白復(fù)合物，促進(jìn)了外源DNA的位點(diǎn)特異性整合。