1.4.3　DNA組裝

DNA組裝（DNA assembly）是指通過(guò)特定技術(shù)實(shí)現(xiàn)DNA序列的“切”和“連”，其是合成生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)之一。在合成生物學(xué)和生物工程領(lǐng)域，遺傳元件無(wú)縫拼接以及重復(fù)DNA序列串聯(lián)，都需要用到高效的 DNA 組裝技術(shù)，只有這樣，才能滿足發(fā)展迅速的基因組設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域的需求。

基于酶切連接策略的DNA組裝方法廣泛應(yīng)用于迭代DNA組裝，主要有寡核苷酸組裝方法、BioBrick方法、Golden Gate方法、Gibson方法以及TPA方法。現(xiàn)有的DNA合成方法較為有限，無(wú)法直接準(zhǔn)確合成長(zhǎng)片段DNA。對(duì)此，我們可以采用分級(jí)的體外與體內(nèi)組裝技術(shù)，將分段合成的寡核苷酸片段組配成長(zhǎng)片段DNA，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段基因甚至基因組的合成。

（1）寡核苷酸組裝方法。寡核苷酸組裝方法主要應(yīng)用于長(zhǎng)片段基因或基因組的合成。目前應(yīng)用得較為廣泛的寡核苷酸組裝方法有連接酶組裝法（ligase chain reaction，LCR）和聚合酶組裝法（polymerase cycling assembly，PCA）兩種。LCR通過(guò)DNA連接酶將首尾相連、重疊雜交的5′磷酸化寡核苷酸片段連接成雙鏈DNA；PCA則利用DNA聚合酶延伸雜交的重疊寡核苷酸片段獲得不同長(zhǎng)度的混合物，最后用引物擴(kuò)增出成功組裝的基因全長(zhǎng)片段。PCA具有良好的兼容性，也被應(yīng)用于芯片合成的寡核苷酸組裝。

（2）BioBrick方法。雙鏈 DNA的拼接是依靠限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端來(lái)串聯(lián)DNA片段。基于這一方法發(fā)展而來(lái)的BioBrick技術(shù)由Knight研究組于2003年提出。該方法通過(guò)一對(duì)同尾酶和兩個(gè)非同尾酶將載體和DNA元件標(biāo)準(zhǔn)化并形成元件庫(kù)，隨后標(biāo)準(zhǔn)化的元件通過(guò)DNA連接酶作用根據(jù)順序依次組裝起來(lái)。基于作用位點(diǎn)的不同，BioBrick技術(shù)可以使用不同的同尾酶發(fā)揮不同的作用。雖然該方法實(shí)現(xiàn)了元件的標(biāo)準(zhǔn)化和DNA組裝的便捷化，但由于兩個(gè)DNA元件之間有6個(gè)堿基對(duì)的殘痕，元件組裝通量較低。之后出現(xiàn)的BglBrick方法和ePathBrick方法通過(guò)將殘痕轉(zhuǎn)化為融合蛋白的連接肽，成功解決了這個(gè)問(wèn)題，推動(dòng)了組裝技術(shù)的發(fā)展。

（3）Golden Gate方法。Golden Gate 方法采用IIS型限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的黏性末端來(lái)實(shí)現(xiàn)組裝，由于IIS型限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)有所不同，Golden Gate 技術(shù)可以自由地設(shè)計(jì)黏性末端，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)組裝多個(gè)DNA片段，大大提高了DNA組裝的效率。例如，Engler 等人用Golden Gate方法進(jìn)行一步酶切連接，結(jié)合基因改組（gene shuffling）技術(shù)，一次性完成了3個(gè)片段與載體的拼接，構(gòu)建了理論上可達(dá)19683種不同的重組胰蛋白酶原基因，得以篩選高效表達(dá)的胰蛋白酶突變體。

（4）Gibson方法。Gibson方法由Gibson于2009 年開(kāi)發(fā)，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向無(wú)縫克隆技術(shù)，可將插入片段（PCR產(chǎn)物）定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。Gibson方法的原理可以概括為三步反應(yīng)：首先，T5核酸外切酶從DNA片段的5′端切割一條鏈，產(chǎn)生的單鏈DNA末端（overhang）兩兩配對(duì)，形成一個(gè)有間隙（gap）的環(huán)狀DNA；其次，Phusion DNA聚合酶通過(guò)DNA合成填補(bǔ)間隙，產(chǎn)生一個(gè)只有缺刻（nick）的環(huán)狀DNA；最后，Taq DNA連接酶通過(guò)形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺刻，得到一個(gè)完整的雙鏈DNA或質(zhì)粒。相比其他DNA組裝方法，Gibson方法連接利用的是片段間的長(zhǎng)重疊區(qū)域，更特異性地確保了連接順序，同時(shí)做到了無(wú)縫拼接，使得組裝尺度擴(kuò)大到了百kb級(jí)左右。

（5）TPA（Twin-Primer Assembly）方法。與上述幾種酶依賴性DNA組裝方法不同，TPA方法不需要酶的參與。TPA方法是由趙惠民團(tuán)隊(duì)于2017年提出的一項(xiàng)雙引物非酶促DNA組裝的高效準(zhǔn)確的多片段DNA組裝方法。其原理可分為兩步：首先，設(shè)計(jì)出長(zhǎng)短、上下不同的4種引物，并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分別對(duì)設(shè)計(jì)的片段進(jìn)行擴(kuò)增；其次，將得到的正確的擴(kuò)增片段通過(guò)退火組裝成一個(gè)質(zhì)粒，驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)化到菌內(nèi)即可。TPA方法在不使用酶的條件下，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的片段組裝成質(zhì)粒，具有廣闊的應(yīng)用前景。