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1.4.2 DNA測序

測序是重建DNA樣本中核苷酸原始順序的過程。DNA測序(DNA sequencing)技術分為一代Sanger測序、二代以Illumina測序平臺為代表的高通量測序和三代單分子測序。1977年,Maxam和Gilbert等發明的化學降解法與Sanger等發明的雙脫氧核苷酸末端終止法,標志著一代測序技術的誕生。Sanger測序技術是通過核酸模板在核酸聚合酶、引物、4種單脫氧核苷酸存在的條件下,在4管反應體系中分別按比例引入4種脫氧核苷酸,反應終止后用凝膠電泳分離大小不同的片段。其技術流程為文庫制備、測序反應、測序示蹤和計算機分析。

目前普遍使用的是二代測序技術,即以大規模并行方式讀取相對較短的序列(片段),其步驟如下。

(1)將長序列切割為片段并使用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增。

(2)將DNA接頭序列連接到擴增完成后的各條DNA鏈的兩端。

(3)將雙鏈DNA分離成單鏈并加入玻璃流動池,接頭序列與流動池表面上的互補片段結合,并局部復制以產生相同DNA克隆簇。

(4)將被熒光標記的互補核苷酸加到每個克隆簇中的單鏈DNA末端,記錄熒光顏色對每個克隆簇中的DNA進行測序。

(5)被熒光識別到的堿基結果會以文本格式存儲。

二代測序技術具有成本低廉、快速和準確等特點,但其使用的短讀長測序方式對片段長度具有嚴格限制。

以Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術和Pacific Biosciences公司的single molecule real-time(SMRT)測序技術為代表的三代單分子測序技術近年來受到了學術界的廣泛關注。與前兩代測序技術相比,三代測序技術的特點是通過單分子測序實現長片段測序,從根本上改變測序數據的結構,提高測序能力。其中,SMRT測序技術利用熒光信號進行測序,而納米孔單分子測序技術則利用不同堿基產生的電信號進行測序。納米孔單分子測序技術的儀器小巧便攜、成本較低且無須復雜的建庫過程,使其可應用于快速、實時的基因測序中,在科學研究和臨床應用中都有著非常重要的意義,具有廣闊的應用前景。

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