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1.4.2 DNA測(cè)序

測(cè)序是重建DNA樣本中核苷酸原始順序的過(guò)程。DNA測(cè)序(DNA sequencing)技術(shù)分為一代Sanger測(cè)序、二代以Illumina測(cè)序平臺(tái)為代表的高通量測(cè)序和三代單分子測(cè)序。1977年,Maxam和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法與Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法,標(biāo)志著一代測(cè)序技術(shù)的誕生。Sanger測(cè)序技術(shù)是通過(guò)核酸模板在核酸聚合酶、引物、4種單脫氧核苷酸存在的條件下,在4管反應(yīng)體系中分別按比例引入4種脫氧核苷酸,反應(yīng)終止后用凝膠電泳分離大小不同的片段。其技術(shù)流程為文庫(kù)制備、測(cè)序反應(yīng)、測(cè)序示蹤和計(jì)算機(jī)分析。

目前普遍使用的是二代測(cè)序技術(shù),即以大規(guī)模并行方式讀取相對(duì)較短的序列(片段),其步驟如下。

(1)將長(zhǎng)序列切割為片段并使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。

(2)將DNA接頭序列連接到擴(kuò)增完成后的各條DNA鏈的兩端。

(3)將雙鏈DNA分離成單鏈并加入玻璃流動(dòng)池,接頭序列與流動(dòng)池表面上的互補(bǔ)片段結(jié)合,并局部復(fù)制以產(chǎn)生相同DNA克隆簇。

(4)將被熒光標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸加到每個(gè)克隆簇中的單鏈DNA末端,記錄熒光顏色對(duì)每個(gè)克隆簇中的DNA進(jìn)行測(cè)序。

(5)被熒光識(shí)別到的堿基結(jié)果會(huì)以文本格式存儲(chǔ)。

二代測(cè)序技術(shù)具有成本低廉、快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn),但其使用的短讀長(zhǎng)測(cè)序方式對(duì)片段長(zhǎng)度具有嚴(yán)格限制。

以O(shè)xford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)和Pacific Biosciences公司的single molecule real-time(SMRT)測(cè)序技術(shù)為代表的三代單分子測(cè)序技術(shù)近年來(lái)受到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。與前兩代測(cè)序技術(shù)相比,三代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)是通過(guò)單分子測(cè)序?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)片段測(cè)序,從根本上改變測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu),提高測(cè)序能力。其中,SMRT測(cè)序技術(shù)利用熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序,而納米孔單分子測(cè)序技術(shù)則利用不同堿基產(chǎn)生的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序。納米孔單分子測(cè)序技術(shù)的儀器小巧便攜、成本較低且無(wú)須復(fù)雜的建庫(kù)過(guò)程,使其可應(yīng)用于快速、實(shí)時(shí)的基因測(cè)序中,在科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中都有著非常重要的意義,具有廣闊的應(yīng)用前景。

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