第七節 基于微球的多重免疫分析：Luminex?xMAP?技術的發展和應用

多重分析是指能夠同時檢測多種分析物的技術，與傳統的單一分析物檢測技術相比，它具有多種優勢并逐漸成為研究和診斷實驗室的首選檢測方法。通過使用不同染色的功能化微球，Luminex? xMAP?技術平臺能夠快速地對同一個樣本進行多重檢測和定量分析。與單一靶標檢測技術相比，Luminex? xMAP?技術更經濟且檢測性能更好。由于標準品是以共價方式包被于xMAP微球上，因此該方法可廣泛應用于包括蛋白質、核酸、多糖類和磷脂類在內的多種生物分子的檢測中。基于微球的多重分析平臺迅速流行，目前已超過9 000臺儀器在全球投放，同時Luminex公司及其合作伙伴提供了豐富的檢測項目清單。

除了適用于xMAP平臺的諸多商品化檢測項目，該技術框架開放，用戶還可以根據自身需求快速開發、優化和驗證某些定制項目。目前有超過14 000篇同行評議刊物報道基于xMAP技術的檢測方法在研究和診斷中的應用和/或開發，表明該技術具有廣泛的用途（Luminex Corporation，2010a）。在本節中，重點介紹xMAP技術在免疫檢測中的應用，包括檢測方法的開發、優化以及不同免疫學方法的樣本處理流程，并提供一些儀器、項目清單以及推薦的參考文獻。

一、xMAP技術

xMAP分析系統是由懸濁液陣列（液態芯片）組成。微陣列中特異性捕獲分子共價偶聯于染色的微球表面，分析物與捕獲分子的結合反應發生于微球的表面。根據所使用的Luminex分析儀，微球可制成能夠檢測100～500個分析物的陣列。分析物的結合能夠通過熒光報告基團進行檢測。藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光量子產率高，多數情況下被選作熒光報告基團。Luminex分析儀根據微球自身的熒光信號識別、鑒定、分類微球，并通過PE的發射強度定量測定微球表面結合的分析物。與傳統的二維檢測模式相比，該方法具有幾大優勢，包括由良好的近液相結合動力學所致的較短孵育時間、重復性高、靈敏度和特異性好、樣本用量少且通量高等（Nolan and Mandy，2001；Nolan and Sklar，2002；Kellar and Iannone，2002；Kellar，2003）。

二、xMAP微球

xMAP技術的關鍵部分是聚苯乙烯微球，利用兩種或三種光譜差異大的熒光染料按精確比例混合，對微球進行染色。每種類型的多重分析微球大小一致，但微球內部的熒光染料之間的比例不同。盡管這些熒光染料的激發條件相似，但是其發射光譜特征獨特。因此，每個或每種微球的光譜特征是獨一無二的，從而使多重分析中每個或每種微球能夠與其他微球區分開來。由于每個或每種微球都共價偶聯了一種特定的捕獲試劑，并可通過熒光報告基團的信號進行區分，因此每個或每種微球都對應一種特定的分析物。當這些微球混合在一起，可在同一個反應體系中同時檢測多種分析物。分析時，通過熒光報告基團可以定量檢測分析物，微球內部熒光可從多重數據中去卷積。

為了滿足各種應用需求，目前已經研發出多種商品化xMAP微球并可用于免疫檢測應用開發。第一代xMAP微球是根據內部兩種熒光染料的光譜特征進行區分，它可以提供100種光譜不同的微球陣列。如果使用三種熒光染料可以將微球陣列擴增至500種（圖2-7-1）。原始未包被的MicroPlex?（裸球）是直徑為5.6μm的聚苯乙烯微球，攜帶的羧基可以共價結合捕獲分子，并可提供500種不同的顏色組合。LumAvidin?微球表面包被抗生物素蛋白，它能夠結合生物素化的捕獲試劑。這種檢測技術使分析物由于生物素和抗生物素蛋白的間隔遠離微球表面，使反應保留足夠的空間。通常，對于小分子或多肽類分析物的檢測，這種方式具備更優的反應性能。然而，如果使用LumAvidin?微球，就不能使用生物素-親和素檢測系統。SeroMAP?是針對血清學檢測中出現的高背景而專門研發的微球。SeroMAP?是直徑為5.6μm的羧基化微球，可提供100種不同的顏色組合。其設計可減少非特異性結合，在血清檢測中具有出色的表現（Waterboer等，2006）。MagPlex?是直徑為6.5μm的超順磁性微球，表面具有羧基功能基團，可提供500種不同的顏色組合。MagPlex微球可以通過磁力作用與溶液分離，因此更易于自動化和便于洗滌。與SeroMAP?微球的組成相似，MagPlex微球可減少非特異性結合，背景更低，它在血清學檢測中具有優異的檢測性能（Luminex Corporation，2008a）。目前，市面上已有MagPlex微球和商品化磁力洗板儀聯用的方案，Luminex和其他供應商也提供手持式磁力架用于手工洗滌MagPlex微球（Luminex Corporation，2007b，2010b）。

三、Luminex分析儀

Luminex 100/200?和FLEXMAP 3D? 是兩種基于流式細胞術的儀器（圖2-7-2）。在這些檢測系統中，樣品探針從96孔板或者384孔板中吸取包含微球的反應體系，樣本在流體動力學驅動下聚焦成一束快速流動的液流。當液流通過成像室時，每個微球都會受到兩種激光的照射。波長635nm、10mW的紅色激光器激發每個微球內部的熒光染料，發射的熒光經由雪崩光電二極管進行檢測，側向散射光用于濾除空氣和磁珠聚集，鑒別每一個微球，并排除氣泡和微球聚集體。波長532nm、13mW的釔鋁石榴石激光器激發微球表面捕獲的報告熒光基團（PE），其發射光經由光電倍增管（PMT）進行檢測。高速數字信號處理器通過微球內部熒光信號判定微球的熒光編碼，而微球表面的熒光報告基團信號強度可以實現對待測物的定量測定。每一種微球都要進行多次讀數以確保結果穩定可靠。報告通道讀數取自微球液滴周圍的信號并通過專門的減數計算而作為背景被扣除。通常情況下，每孔每個區至少檢測50或100個微球，結果以熒光強度中位數（MFI）報告。當每個樣本每個區域吸取的微球足夠少時，使用中位數統計可以很好地避免孔間的攜帶污染。

Luminex 100/200?分析儀在診斷和研究領域都有廣泛的應用，其擁有超過50個510（k）許可的試劑盒以及許多終端用戶實驗室研發的測試（laboratory-developed test，LDT）。在Luminex 100/200?上，MicroPlex微球可以檢測高達100種不同的分析物，MagPlex微球可檢測的分析物也多達80種。該系統穩定靈活，應用廣泛，可用于免疫檢測、基因分型、基因表達、酶學分析和感染性疾病檢測等領域。通常，這一技術只需幾微升的樣品就能檢測多達100種分析物，因此該技術尤其適用于稀有樣本或者體積有限的樣品。這種方法的檢測結果與其他方法如酶聯免疫分析（ELISA）高度一致，而且可以對超過3～4數量級濃度范圍的分析物進行定量測定。Luminex系統自帶的xPONENT軟件十分直觀，使得自定義檢測和商品化檢測試劑盒的檢測設置、反應板讀數和數據分析非常便捷。每個項目都有特定的實驗方案，而且可重復用于新批次的測定。美國《聯邦法規21章》（美國——譯者注）第11款規定的兼容升級可以提供多級用戶管理、全程追蹤、電子檔案和電子簽名，該系統也被批準用于體外診斷（IVD）。

FLEXMAP 3D系統是Luminex研發的第二款基于流式的分析平臺，它的靈敏度更高，檢測范圍更廣，通量高達500種分析物，工作效率更高。此外，這款儀器的設計更易于自動化，且可連接實驗室信息管理系統（LIMS），而且同時兼容96孔板和384孔板。該系統還能自動調整樣品探針的高度并具穿刺功能，能夠分析密封的反應板。它可以設計雙進樣系統提高工作效率，分析速度是Luminex 200的2～3倍。在該系統中，96孔板的檢測時間大約為20min，384孔板的檢測時間約75min。FLEXMAP 3D系統還帶有方便的校準程序以及日常維護功能。由于濃度檢測范圍提高至4.5個數量級，之前由于水平差異巨大而需要分孔檢測的分析物現在可以在同一個檢測中進行多重分析。FLEXMAP 3D這種特性和能力成為快速和高通量檢測的理想方法。

第三種系統MAGPIX?使用磁性微球，并采用流式細胞和CCD 光學成像技術，一次可檢測多達50種分析物（圖2-7-2c）。在MAGPIX系統中，已結合靶標的磁性微球通過鞘流池進入成像室，在磁場的作用下，磁性微球被吸附固定并與液體分離，以進行光學分析。紅色激光器（630nm）激發微球內部熒光染料，綠色激光器（515～521nm）激發磁珠表面的熒光報告基團。CCD成像儀識別微球和定量分析報告基團。MAGPIX分析儀的xPONENT操作系統，既可用于商品試劑盒的操作，又可用于LDT項目的檢測。由于成本低、體積小（僅需64.8cm的工作臺空間），MAGPIX是中小實驗室最理想的多重檢測平臺，也可用于偏遠地區實驗室。

四、檢測項目開發

xMAP技術為用戶提供了一個靈活、開放的平臺，用戶可以構建自定義檢測項目，也可以使用Luminex與合作伙伴開發的商品化或定制檢測試劑盒。Luminex網站上的技術支持提供樣本操作流程、建議以及各種信息以幫助用戶的項目開發（Luminex Corporation，2011d）。Luminex向用戶提供現場版和網絡版xMAP項目開發教程。許多出版刊物也對特定xMAP應用的項目開發提供了詳細說明，下面介紹xMAP用于免疫學項目開發的通用流程和建議。

檢測項目開發首先必須準備所需試劑，包括抗體、分析物、標準品/質控品和基質等。如有必要，偶聯劑可以采用（外源性）純化的伯胺（如載體蛋白、三羥甲基氨基甲烷等）。通常，采用公價方式使微球與捕獲試劑（如抗體、蛋白質等）結合，而未結合的試劑則會被除去。微球的結合反應必須在緩沖溶液中進行，并選用適當的檢測試劑（如偶聯鼠源性單克隆抗體的微球應該使用抗小鼠IgG）。在檢測前，需對檢測系統基質效應進行分析以評估非特異性結合和交叉反應性，同時使用與樣本類似的陽性對照，以評估陽性反應、方法學的靈敏度和特異性。

通常，其他品牌的單靶標免疫學試劑在xMAP平臺上也具有良好的性能，且能夠提供足夠的靈敏度和特異性。此外，除了含氨基化合物的緩沖液不能用于偶聯微球（如Tris），其余標準的免疫緩沖液也能用于xMAP平臺。 表2-7-1列舉了用于偶聯微球和xMAP免疫檢測的各種緩沖液（Luminex Corporation，2007a）。Luminex網站提供有經過驗證的試劑、材料和設備的綜合清單，其均可與xMAP技術平臺兼容（Luminex Corporation，2011b）。

（一）微球偶聯

抗體或者蛋白質上的伯胺可以通過標準的碳二亞胺二步偶聯法與微球表面的羧基基團共價結合。某些常用的蛋白質添加劑會影響偶聯反應，如一些含氨基化合物包括Tris、BSA、疊氮化物以及某些表面活性劑、甘油、尿素和咪唑等。這些化合物可以通過透析或者脫鹽的方式從蛋白質制品中除去。在某些情況下，干擾物質如表面活性劑或尿素不能去除，那么必須充分稀釋偶聯蛋白以提高偶聯效率。碳二亞胺偶聯反應在低pH（如pH 5～6）時效率最高，但是它必須儲存在低pH的緩沖液中才能確保其穩定和功能構象。當使用單克隆抗體將待測物捕獲至微球表面時，檢測系統可以獲得最佳的靈敏度和特異性。如果使用多克隆抗體進行捕獲，它必須是單特異性的并且經過親和純化。捕獲抗體的最適用量取決于其自身的效價，一般每100萬個微球使用3～5μg時抗體達到最優效能。

下面概述如何使用二步碳二亞胺偶聯法將蛋白偶聯至（500萬個）MagPlex微球上。MicroPlex微球或SeroMAP微球操作方案與MagPlex微球操作相同，只是在洗滌時不同微球分離純化方式存在差異，其中前兩者利用離心法（≥8 000g，離心1～2min）分離，而MagPlex微球使用磁分離。表2-7-2列舉了MagPlex微球在偶聯和洗滌過程中所使用的磁力分離器和96孔板（Luminex Corporation，2007b）。偶聯微球的穩定性取決于偶聯蛋白的穩定性，通常在適當條件下，偶聯的微球可穩定保存1年以上（Luminex Corporation，2008b）。

1.MagPlex?微球碳二亞胺蛋白偶聯兩步法的操作步驟

（1）根據微球產品操作說明，重懸未偶聯的微球。

（2）將5.0×106個微球轉移至微量離心管［如USA Scientific（1415-2500）或Eppendorf Protein LoBind（022431081）］中。

（3）將微量離心管放置于磁力分離器上，分離30～60s。

（4）磁分離完全后在磁分離器上去除離心管中的上清液，當心不要攪動微球。

（5）將離心管從磁力分離器上取下，用100μl去離子水重懸微球，渦旋混勻，超聲約20s。

（6）將微量離心管放置于磁力分離器上，分離30～60s。

（7）磁分離完全后在磁分離器上去除離心管中的上清液，當心不要攪動微球。

（8）將離心管從磁力分離器上取下，用80μl活化緩沖液（100mM磷酸二氫鈉，pH 6.2）重懸微球，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（9）加入10μl 50mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS，用去離子水或者偶聯緩沖液稀釋），輕輕渦旋混勻。

（10）加入10μl 50mg/ml EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽），用去離子水或者偶聯緩沖液稀釋），輕輕渦旋混勻。

（11）室溫孵育20min，每隔10min進行輕輕渦旋混勻。

（12）將微量離心管放置于磁力分離器，分離30～60s。

（13）磁分離完全后在磁分離器上去除離心管中的上清，當心不要攪動微球。

（14）將離心管從磁力分離器上取下，用250μl偶聯緩沖液（50mM MES，pH 5.0）重懸微球，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（15）重復步驟（12）和步驟（13），再偶聯重復1次。

（16）將離心管從磁力分離器上取下，用100μl偶聯緩沖液重懸已經活化和洗滌的微球，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（17）將蛋白質加入重懸的微球中。蛋白質量取決于自身的效價，一般每100萬個微球偶聯1～25μg蛋白質，最適量為每100萬個微球偶聯3～5μg蛋白質。

（18）加入偶聯緩沖液補充至500μl。

（19）渦旋混勻。

（20）將微量離心管放于搖床上旋轉混勻，室溫孵育2h。

（21）將微量離心管放置于磁力分離器，分離30～60s。

（22）磁分離完全后在磁分離器上去除離心管中的上清，當心不要攪動微球。

（23）取出微量離心管，加入500μl PBS-T洗液或者PBS-TBN緩沖液，渦旋混勻，超聲處理約20s。如果選用步驟（24），則這一步驟使用PBSTBN緩沖液。

（24）放于搖床上，室溫孵育30min（注意：如果當天使用微球則選用本步驟）。

（25）將微量離心管放置于磁力分離器，分離30～60s。

（26）磁分離完全后在磁分離器上去除離心管中的上清，當心不要攪動微球。

（27）取出磁力分離器中的微量離心管，使用1ml封閉液/儲存液（PBS-BN或者PBS-TBN）重懸微球，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（28）重復步驟（25）和步驟（26）。用1ml封閉液/儲存液洗滌2遍。

（29）移除磁力分離器中的微量離心管，用250～1 000μl封閉液/儲存液重懸偶聯和洗滌的微球。

（30）將偶聯的微球放置于2～8℃，避光保存。

注意事項：

① 在整個操作過程中，微球應該避免長時間的光照。

② 緩沖液的信息詳見表2-7-1。

③ 磁力分離器的信息詳見表2-7-2。

通常，利用小規模的偶聯反應（250萬～500萬個微球）優化蛋白偶聯的最佳條件，如偶聯反應中抗原或者抗體的量。偶聯反應的規模根據需要可以擴大或者縮小；但是每100萬個微球中捕獲試劑的比例應該是恒定的。活化緩沖液的體積、Sulfo-NHS和EDC的用量、偶聯反應的總體積可根據偶聯反應的規模和反應管的大小進行調整（Luminex Corporation，2007h）。以下是（2.5～200）×106個微球偶聯反應的常規建議：①偶聯（2.5～12.5）×106個微球需要活化緩沖液的體積是100μl，（50～200）×106個微球活化緩沖液的體積是500μl；②（2.5～12.5）×106個微球需要Sulfo-NHS和EDC是0.5mg（50mg/ml樣品10μl），（10～50）×106個微球需要2.5mg（50mg/ml樣品50μl），以及（100～200）×106個微球需要5mg（50mg/ml樣品100μl）；③（2.5～5）×106偶聯個微球偶聯反應體系體積是0.5ml，（10～12.5）×106個微球反應體系體積是1ml，而（50～200）×106個微球是2ml；④0.5～1ml偶聯反應體系的偶聯可以在1.5ml離心管進行，2ml偶聯反應可以使用4ml離心管或15ml聚丙烯管。

未偶聯的微球黏性大，可黏附于大多數離心管管壁上。USA Scientific公司（貨號#1415-2500）和Eppendorf Protein LoBind的離心管（貨號#022431081）在偶聯反應后微球回收率最好。此外，將偶聯反應置于滾筒式搖床混勻器（VWR公司，貨號56264-302）上可獲得最佳偶聯效率。在15ml聚丙烯管中進行的較大規模偶聯反應，可將離心管傾斜置于轉速300r/min的軌道微量滴定板搖床上。

用于偶聯的其他化學物質，包括偶聯蛋白和多糖，如4-（4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉（DMTMM）可作為一步法偶聯試劑代替EDC和Sulfo-NHS偶聯。DMTMM比EDC和Sulfo-NHS更加穩定，因此它是一種微球偶聯的穩健方法（Schlottmann等，2006）。其他用于偶聯的化學物質，包括酰肼和馬來酰亞胺也可將蛋白質共價偶聯至微球表面。

肽類、磷脂和其他小分子可以直接偶聯至微球表面（Komatsu等，2004；Shichijo等，2004），但是如果對這些小分子或偶聯的微球進行修飾使微球表面有足夠的空間可提高偶聯的效率。該方法是利用接頭序列或者載體蛋白連接小分子，再通過標準的碳二亞胺兩步法將其偶聯至微球表面。生物素化小分子可以結合到LumAvidin微球，其上偶聯的抗生物素蛋白為微球表面提供結合的空間（Iannone等，2001；Drummond等，2008；Gu等，2008）。下文將講述生物素化分子結合LumAvidin微球的實驗方案（Luminex Corporation，2007c）。然而，這種生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統不能用于標記熒光報告基團，這種情況下可能需要選擇其他標記方法，比如將PE直接連接于檢測試劑。

2.生物素標記分子結合LumAvidin微球的操作步驟

（1）根據微球產品說明，重懸LumAvidin微球懸液。

（2）將1.0×105個微球轉移至USA Scientific（1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（022431081）微量離心管。

（3）離心（≥8 000g）1～2min，收集微球。

（4）去除上清液，用250μl PBS-BSA重懸微球，渦旋振蕩混勻和超聲處理約20s。

（5）用PBS-BSA稀釋生物素標記分子，采用滴定法確認最佳稀釋濃度，滴定范圍為4～4 000nM。

（6）將250μl生物素標記的分子加入微球懸液，立即渦旋混勻。

（7）室溫旋轉混勻、孵育30min。

（8）離心（≥8 000g）1～2min，收集結合的微球。

（9）移除上清液，用500μl封閉液/儲存液（PBS-BN或者PBS-TBN）重懸，渦旋混勻。

（10）離心（≥8 000g）1～2min，收集微球。

（11）重復步驟（9）和步驟（10）兩遍。

（12）移除上清液，用250～1 000μl封閉液/儲存液重懸，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（13）將結合的LumAvidin的微球放置于2～8℃，避光保存。

注意事項：

① 在整個操作過程中，微球應避免長時間的光照。

② 緩沖液的信息詳見表2-7-1。

另一種連接小分子的方法是將功能性的接頭序列偶聯至微球表面。這種交聯試劑具有不同的功能基團，它們充當小分子和微球表面的間隔物。己二酸二酰肼（adipic acid dihydrazide，ADH）中的酰肼為偶聯羧基基團提供10個原子的間隔序列，而4-（4-N-馬來酰亞胺苯基）丁酸酰肼鹽酸鹽（4-（4-N-maleimidophenyl）butyric acid hydrazide hydrochloride，MPBH）為巰基基團提供8個原子的間隔序列。下文將講述用ADH和MPBH羧基化修飾微球的實驗方案。微球修飾后可用EDC一步法將捕獲試劑偶聯至修飾微球。

3.ADH修飾羧基化微球的操作步驟

（1）根據微球產品說明重懸微球懸液。

（2）吸取25×106個微球，離心（≥4 000g）2min。

（3）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 6.0）重懸微球，渦旋混勻，超聲處理約20s。

（4）將重懸的微球移至USA Scientific（ 1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（ 022431081）微量離心管，離心（≥8 000g）1～2min。

（5）移除上清液，用1ml 35mg/ml ADH（ 用0.1M MES，pH 6.0配制）重懸微球，渦旋混勻。

（6）加入200μl 200mg/ml EDC（用0.1M MES，pH 6.0配制，現配現用），渦旋混勻。

（7）室溫下旋轉孵育1h。

（8）離心（≥8 000g）1～2min收集微球。

（9）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重懸微球，渦旋混勻。

（10）離心（≥8 000g）1～2min收集微球。

（11）重復步驟（9）和步驟（10）兩遍。共洗3遍。

（12）用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重懸微球，置于2～8℃，避光保存。

注意事項：

在整個操作過程中，微球應該避免長時間的光照。

4.MPBH修飾羧基化微球的操作步驟

（1）根據微球產品說明重懸微球懸液。

（2）取出25×106個微球，離心（≥4 000g）2min收集微球。

（3）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 6.0）重懸微球，渦旋振蕩混勻，超聲處理約20s。

（4）將重懸的微球移至USA Scientific（ 1415-2500）或者Eppendorf Protein LoBind（ 022431081）微量離心管，離心（≥8 000g）1～2min。

（5）移除上清液。

（6）用DMSO配制80mM MPBH（28.3mg/ml）溶液。

（7）用0.1M MES（pH 6.0）稀釋MPBH溶液至16mM（5.7mg/ml）。

（8）取250μl稀釋的MPBH重懸微球，渦旋混勻。

（9）向微球懸液中加入100μl 20mg/ml EDC（用0.1M MES，pH 6.0配制，現配現用），渦旋混勻。

（10）室溫旋轉孵育1h。

（11）加入1ml 0.1M MES（pH 4.5），渦旋混勻。

（12）離心（≥8 000g）1-2min收集微球。

（13）移除上清液，用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重懸微球，渦旋混勻。

（14）離心（≥8 000g）1～2min收集結合的微球。

（15）重復步驟（9）和步驟（10）。共洗2遍。

（16）用1ml 0.1M MES（pH 4.5）重懸MPBH修飾的微球，置于2～8℃，避光保存。

注意事項：

在整個操作過程中，微球應該避免長時間的光照。

多糖抗原也可以通過抗原或者微球表面修飾與羧基化的微球偶聯。例如，三聚氯氰（cyanuric chloride）交聯修飾的多聚-L-賴氨酸與標準的EDC介導的化合物偶聯方法聯用，可以將肺炎球菌血清型多糖偶聯至微球表面的羧基基團（Pickering等，2002）。高碘酸鈉氧化肺炎球菌多糖已經成功地偶聯至ADH-功能性微球（Biagini等，2003）。DMTMM也可用于肺炎球菌多糖與羧基化微球的偶聯（Schlottmann等，2006）。

（二）偶聯確認

捕獲試劑與微球偶聯后應檢測兩者之間共價結合的效率（Luminex Corporation，2006c）。偶聯抗體的效價可以通過PE標記的抗種屬特異性抗體確定，而偶聯抗原的滴度可以用標記的特異性抗體檢測。下面舉例說明抗體偶聯確認的操作方案。該方案的洗滌步驟使用了真空抽濾裝置；對MagPlex微球而言，洗滌可以選用磁分離法。值得注意的是，當使用真空過濾時，在抽真空的過程中不要讓過濾器干燥，否則會導致微球粘在濾膜上。濾膜上的微球可以通過輕輕吹打重懸下來。MFI應隨著標記的檢測抗體的濃度增加而增加。通常情況下，抗體偶聯在飽和時的MFI至少達到10 000才能在免疫學分析中取得最佳的效果（Luminex Corporation，2006g）。

抗體偶聯的確認實驗方案：

（1）選擇合適的抗體偶聯微球簇。

（2）渦旋混勻重懸微球，超聲處理約20s。

（3）制備微球工作液：用試驗緩沖液將偶聯微球稀釋至終濃度為每微升每套微球100個。每次反應需要50μl微球工作液。

（4）用試驗緩沖液以倍比稀釋法將PE標記的抗種屬IgG抗體從4μg/ml稀釋至0.062 5μg/ml。每次反應需要50μl稀釋抗體。

（5）預濕濾膜孔徑1.2μm的濾板（Millipore，MABVN1250）：每孔加入100μl試驗緩沖液，用真空歧管吸出。

（6）每孔加入50μl微球工作液至濾板相應孔中。

（7）每孔加入50μl稀釋的檢測抗體至濾板對應孔中。

（8）用多通道移液器輕輕吹吸混勻。

（9）封板，在板式振動器上室溫孵育30min。

（10）用真空歧管吸走上清液。

（11）用100μl試驗緩沖液洗2遍，真空歧管吸干。

（12）加入100μl試驗緩沖液重懸微球，用多通道移液器輕輕吹吸混勻5遍。

（13）取出50～75μl微球懸液在Luminex分析儀中進行檢測。

注意事項：

① 在整個操作過程中，微球應該避免長時間的光照。

② 緩沖液的信息詳見表2-7-1。

（三）方法學優化

確認微球成功偶聯后，選擇性能最優的試劑與標準品或質控品進行下一步檢測。通常，選擇重組蛋白或者已知的陰陽性標本，并采用合適的基質將其溶解以盡可能地使之與測試樣品的成分一致。多重分析的優點是可以篩選候選的捕獲試劑和檢測試劑。例如，偶聯針對一個待測物的幾種不同捕獲抗體先分別偶聯至不同種微球，然后利用多重分析對各自候選的檢測抗體及待測物進行檢測，可以快速鑒定出針對該待測物的最佳捕獲抗體和檢測抗體。多克隆抗體和單克隆抗體都能用于檢測，但是單克隆抗體作為檢測抗體時與捕獲抗體針對的是不同的抗原表位，或者它們是針對待測物上重復的相同表位。檢測抗體通常是生物素化抗體，與鏈霉抗生物素蛋白 -R-藻紅蛋白（SAPE）聯用作為報告基團。檢測抗體也可以直接標記PE，這樣在分析時不需要再標記其他報告基團。一旦確定了最佳的抗體組合，偶聯的微球微陣列應該與每一個分析物和每一個檢測抗體進行測試，以評估檢測性能和特異性。如果抗體與不同的待測物存在交叉反應，那么起初篩選鑒定的捕獲抗體或檢測抗體必須替換。

然后，用單個待測物和多重檢測抗體測試多重分析微球的靈敏度，用不同檢測抗體檢測微球的干擾物。檢測抗體的最佳濃度隨所用試劑的變化而變化，其效價應該用滴定法確定（如倍比稀釋從4μg/ml稀釋至1μg/ml），但是通常情況下，2～4μg/ml的抗體濃度即已足量。與單一分析相比，多重分析由于不同的檢測抗體之間會發生相互作用，因此檢測抗體的濃度應該相應增加。同樣，如果多重分析的通量數（測試項目數）增加，那么每種檢測抗體所需的量也應該相應增加。在免洗的方法學測定中，檢測抗體的濃度應該增加高至5倍，以中和上清液中過多的未結合的待測物。通常情況下，報告熒光基團（SAPE）的濃度應該是檢測抗體的1.5～2倍。SAPE的濃度超過4μg/ml需要在標記后進行洗滌以降低背景，而終濃度超過8μg/ml可能會干擾分析儀的背景消除。

最后，由于多重分析中待測物和試劑種類眾多，為了檢測多重分析方法的靈敏度和抗干擾特性，必須進行全面和完善的多重分析法的性能驗證。多重分析方法的研發是一個迭代過程，由于檢測組分間相互作用復雜，優化試驗需要不斷重復。根據方法學的特異性，所有的試驗條件都需要進行優化以達到最優設計結果，包括緩沖系統、封閉試劑、樣本體積和稀釋度、反應總體積、每個反應所需的微球數量（每孔每個區域2 000～5 000個微球）、偶聯捕獲試劑的濃度、檢測抗體和報告基團的濃度、方法特點（洗滌或免洗）和孵育時間等。檢測方法的性能需要用已知的標本來評估和驗證。濃縮樣品和組成非常復雜的樣品至少1∶5稀釋，如血清、血漿或者組織裂解物，以避免干擾或微球凝集，防止基質效應的產生。任何能夠引起干擾、交叉反應或者效能不佳的試劑都應該被替換。

當開發多重分析方法時，應該考慮檢測性能的優化、方法學的靈敏度、檢測范圍、操作簡便性以及報告時間。為了提高靈敏度和增強檢測信號強度，可使用多種信號放大技術，包括調整Luminex 100/200和FLEXMAP 3D分析儀的PMT設置、篩選SAPE報告基團的類別、選取樹狀大分子、滾環擴增技術和增加標記額外的報告基團等。減少微球和樣本的初始孵育體積和/或增加初始的孵育時間，可以提高待測物的結合動力學，從而提高試驗的靈敏度。雖然看似矛盾，但有些時候通過減少偶聯至微球的捕獲試劑可以提高試驗靈敏度。盡管這可能會導致在待測物濃度很低的情況下就會出現飽和現象而降低信號峰值，但它可能會改善低濃度時的線性，因此提高檢測限（圖2-7-3（a））。無論是捕獲抗體還是檢測抗體，高親和力的抗體也能提高檢測靈敏度。當待測物濃度很高時，增加偶聯至微球的捕獲試劑的量，可以獲得更高的檢測信號和擴大檢測范圍（圖2-7-3（a））。有時通過對不同顏色的微球偶聯不同親和力的捕獲抗體，并將它們組合可建立多重分析的標準曲線，有助于提高檢測靈敏度和擴大檢測范圍（圖2-7-3（b））。將不同濃度的同一種抗體偶聯至不同顏色的微球也能獲得相同的效果。

將含有洗滌步驟的實驗改為免洗的實驗可以減少手工操作時間并減少總測定時間。如果改為免洗模式，那么可能需要減少樣本體積和/或增加檢測抗體和SAPE的濃度以中和反應體系中高濃度的未結合待測物和檢測抗體。與含有洗滌步驟的方法相比，免洗法增加檢測抗體和檢測前稀釋樣本可以克服干擾物質引起的基質效應。在某些情況下，添加標記后的洗滌步驟可以減少背景信號和提高方法學的總體效能和靈敏度。

五、免疫檢測構架

（一）免疫計量分析法

xMAP技術靈活性高，該系統與多種檢測方法兼容，應用于其他平臺的常用免疫檢測方法也適用于Luminex分析儀。常用于ELISA的免疫計量分析法（或夾心捕獲法）同樣適用于xMAP平臺，兩者差別在于ELISA使用酶報告系統而xMAP平臺使用的是固定且穩定的熒光報告系統。xMAP技術是將特異性捕獲抗體共價包被在具有多重標記的微球上，微球與樣品進行孵育（圖2-7-4）。樣品中各種待測物與對應的微球特異性結合，然后加入常用的生物素和鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白標記的特異性檢測抗體，即可對待測物進行檢測分析。實驗過程是否需要洗滌取決于試驗性能與時間需求、樣本基質和所使用試劑的性質。洗滌可手工操作，也可通過真空抽濾或磁性分離（用MagPlex微球時）由自動洗板機來完成。目前已有一些應用Microplex或MagPlex微球的免疫測定法（夾心法）的操作步驟可供參考（Luminex Corporation，2006e，f，2007g）。對于需洗滌的（MagPlex微球法）和免洗的免疫分析方法，本節分別列舉了具有代表性的操作步驟，具體如下。

1.使用MagPlex微球的免疫分析法（夾心法）的操作步驟

（1）選擇合適的抗體偶聯微球組合。

（2）渦旋震蕩和超聲約20s以重懸微球。

（3）配制微球工作液，用檢測緩沖液將每組偶聯的貯存微球稀釋到終濃度為100個微球/μl，每個反應需要50μl微球工作液。

（4）分裝微球工作液到圓底孔板的相應孔中反應（CoStar 3789），每孔50μl。

（5）空白孔加50μl檢測緩沖液。

（6）加50μl標準品或樣本至相應孔中。

（7）用排槍輕輕吹打反應液數次以混勻。

（8）反應封板，于搖床上室溫孵育30min，轉速約為800r/min。

（9）將反應板置于磁珠分離器上分離30～60s。

（10）用排槍小心地吸出上清液，注意不要吸到微球。

（11）將反應板置于分離器上繼續進行以下步驟：

① 各孔加入100μl檢測緩沖液；

② 使用排槍小心吸出各孔上清液，或使用手工倒置去除上清液，注意不要觸到微球；

③ 重復上述步驟a和b。

（12）從磁性分離器上取下反應板，用排槍吸取50μl檢測緩沖液重懸微球，輕輕吹打數次混勻。

（13）用檢測緩沖液稀釋生物素化檢測抗體到4μg /ml，每個反應需要稀釋后的檢測抗體50μl。

（14）在各孔中加入50μl稀釋后的檢測抗體。

（15）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（16）反應封板，于搖床上室溫孵育30min，轉速約為800r/min。

（17）將反應板置于磁性分離器中，30～60s內完成分離。

（18）用排槍小心吸出各孔上清，或手工倒置去除上清液，注意不要觸到微球。

（19）將反應板置于分離器上繼續進行以下步驟：

① 各孔加100μl檢測緩沖液；

② 用排槍小心吸出各孔上清液，或手工倒置去除上清液，注意不要觸到微球；

③ 重復上述步驟a和b。

（20）從磁性分離器上取下反應板，用排槍吸取50μl檢測緩沖液重懸微球，輕輕吹打數次混勻。

（21）用檢測緩沖液稀釋SAPE到4μg /ml，每個反應需要稀釋后的SAPE 50μl。

（22）加入50μl稀釋后的SAPE到各孔中。

（23）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（24）反應封板，于搖床上室溫孵育30min，轉速約為800r/min。

（25）將反應板置于磁性分離器中，30～60s內完成分離。

（26）用排槍小心吸出各孔上清液，注意不要觸到微球。

（27）將反應板置于分離器上繼續進行以下步驟：

① 各孔加入100μl檢測緩沖液；

② 用排槍小心吸出各孔上清液，或人工倒置去除上清液，注意不要觸到微球；

③ 重復上述步驟a和b。

（28）從磁性分離器上取下反應板，用排槍吸取100μl檢測緩沖液重懸微球，輕輕吹打數次混。

（29）按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

① 在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露；

② 緩沖液信息見表2-7-1；

③ 磁性分選器信息見表2-7-2。

2.免洗免疫分析法（夾心法）的操作步驟

（1）選擇合適抗體偶聯的微球組合。

（2）渦旋振蕩和超聲混勻約20s以重懸微球。

（3）配制微球工作液，用檢測緩沖液將偶聯的微球稀釋到終濃度為200個/μl，每個反應需要25μl微球工作液。

（4）分裝微球工作液到圓底反應板相應的孔中（CoStar 3789），每孔25μl。

（5）加入25μl檢測緩沖液至空白孔中。

（6）加入25μl標準品或樣本至相應的孔中。

（7）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（8）封板，于搖床上室溫孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（9）用檢測緩沖液稀釋生物素化的檢測抗體到合適的濃度，每個反應需要稀釋后的檢測抗體25μl。

（10）每孔加入稀釋后的檢測抗體25μl。

（11）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（12）封板，于搖床上室溫孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（13）用檢測緩沖液稀釋SAPE到合適的濃度（一般≥4μg/ml），每個反應需要稀釋后的SAPE 25μl。

（14）加25μl稀釋后的SAPE到各孔中。

（15）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（16）封板，室溫下在搖床上孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（17）按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

① 在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露；

② 緩沖液信息見表2-7-1；

③ 檢測抗體和SAPE濃度應優化至最佳濃度，最佳濃度一般高于洗滌法中的濃度；

④ 如果背景較高，則需在分析前增加一次標記后的洗滌步驟。洗滌方法參考真空過濾或磁性分離洗滌法。

（二）間接免疫分析法

xMAP技術也可應用于間接（血清學）免疫分析法，即待測樣品中特異性抗體通過與微球表面偶聯的抗原結合而被檢測（圖2-7-5）。如前文所述，抗原的偶聯可通過多種化合物來實現。偶聯抗原的最佳濃度取決于抗原分子大小，其應通過滴定法進行確定，但是在血清學檢測中，通常以0.04～5μg/100萬個微球為宜。利用標記的抗種屬特異性的檢測抗體（二抗）來檢測微球表面捕獲的抗原特異性抗體（一抗）。抗種屬特異性檢測抗體通常用PE熒光報告基團直接標記或用生物素-SAPE標記。血清學免疫檢測通常需要洗滌，以去除未結合的抗體和其他復雜基質蛋白，以免引起干擾和增加背景信號（Luminex Corporation，2006d，2011c）。使用Mag-Plex微球和磁性分離器可以簡化清洗步驟。下面詳細介紹應用MagPlex微球的間接免疫測定法的操作步驟。

間接（抗體捕獲）免疫分析法操作步驟

1.選擇合適的抗原偶聯的微球陣列。

2.渦旋振蕩和超聲混勻約20s以重懸微球。

3.配制微球工作液，用檢測緩沖液將偶聯的微球稀釋到終濃度為100個微球/μl，每個反應需要50μl微球工作液。

4.分裝微球工作液到圓底反應板（CoStar 3789），每孔50μl。

5.加50μl檢測緩沖液到各空白孔中。

6.加50μl標準品或樣本到相應分析孔中。

7.用排槍輕輕吹打數次以混勻。

8.封板，并在室溫下于搖床上孵育30～60min（MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

9.將反應板置于磁性分離器上30～60s。

10.用排槍小心吸出各孔上清液，注意不要觸到微球。

11.將反應板置于分離器中繼續以下步驟：

（1）加100μl檢測緩沖液到各孔中；

（2）使用排槍小心吸出各孔上清液，或手工倒置去除上清液，注意不要觸到微球；

（3）重復上述步驟a和b。

12.從磁性分離器上取下反應板，用排槍吸取50μl檢測緩沖液重懸微球，輕輕吹打數次混勻。

13.用檢測緩沖液稀釋PE標記的抗種屬IgG檢測抗體濃度至4μg/ml，每個反應需要稀釋后的檢測抗體50μl。

14.加50μl稀釋后的檢測抗體到各孔中。

15.用排槍輕輕吹打數次以混勻。

16.封板，室溫下于搖床上孵育30min（MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

17.將反應板置于磁性分離器上30～60s。

18.用排槍小心吸出各孔上清液，注意不要觸到微球。

19.將反應板置于磁性分離器上繼續以下步驟。

（1）加100μl檢測緩沖液到各孔中；

（2）使用排槍小心吸出各孔上清液，或人工倒置去除上清液，注意不要觸到微球；

（3）重復上述步驟a和b。

20.從磁性分離器上取下反應板，用排槍吸取100μl檢測緩沖液重懸微球，輕輕吹打數次混勻。

21.按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

（1）在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露；

（2）緩沖液信息見表2-7-1；

（3）磁性分離器信息見表2-7-2。

（三）競爭免疫分析法

競爭免疫分析法特別適用于小分子待測物檢測，這些小分子僅含有一個或幾個抗原表位，可獲得的抗體也僅有一種或幾種。該方法中由于存在競爭性分析物，MFI信號隨著待測物濃度的增加而降低。圖2-7-6顯示的是xMAP技術平臺的兩種競爭免疫分析法。模式1：將待測物特異的抗體偶聯到微球表面，樣品中的待測物與試劑中標記的待測物會競爭結合微球表面偶聯的抗體。模式2：微球表面偶聯的待測物，與樣本中的待測物競爭結合標記的檢測抗體（模式2）。對于這兩種模式，標記的檢測試劑的濃度應達到最大信號強度的70%～80%（［IC₇₀］或［IC₈₀］），以避免結合達到飽和狀態，并且確保在標準曲線的最陡部分進行測量。 ［IC₇₀］或［IC₈₀］的測定是通過在沒有樣品的情況下用微球偶聯的標記檢測試劑來滴定完成的。以下介紹兩種模式（免洗滌）的操作步驟，兩種模式的主要差別是加入試劑的順序不一樣（Luminex Corporation，2006b，2007d）。

1.微球偶聯抗體的競爭免疫分析法操作步驟

（1）選擇合適的抗體偶聯的微球陣列。

（2）渦旋和超聲混勻20s以重懸微球。

（3）配制微球工作液，用檢測緩沖液將偶聯的微球稀釋到終濃度為200個微球/μl，每個反應孔需要加入25μl的微球工作液。

（4）用檢測緩沖液將生物素化的競爭抗原試劑稀釋到 ［IC₇₀］或［IC₈₀］，每個反應需要25μl稀釋后的生物素化的競爭抗原試劑。

（5）加25μl檢測緩沖液到圓底反應板（CoStar3789）的各空白孔中。

（6）在相應孔中加25μl標準品或樣本。

（7）每孔中加入25μl稀釋后的生物素化競爭抗原。

（8）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（9）各孔加25μl微球工作液。

（10）用排槍輕輕吹打反應液數次以混勻。

（11）封板，室溫下在平板搖床上孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（12）用檢測緩沖液稀釋SAPE到適當的濃度（通常≥4μg/ml），每個反應需要25μl稀釋后的SAPE。

（13）每孔中加25μl稀釋的SAPE。

（14）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（15）封板，室溫下在平板搖床上孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（16）按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

① 在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露。

② 緩沖液信息見表2-7-1。

③ ［IC₇₀］和［IC₈₀］分別指獲取最大捕獲信號強度的70%和80%的生物素化競爭性抗原的濃度，［IC₇₀］和［IC₈₀］需要用檢測緩沖液滴定來確定。

④ SAPE濃度應優化至最佳濃度，最佳濃度一般高于洗滌法中的濃度。

⑤ 如果背景較高，則需在分析前增加一次洗滌的步驟，可參考洗滌檢測方法中真空過濾或磁性分離洗滌法的步驟。

2.微球偶聯抗原的競爭免疫分析法操作步驟

（1）選擇合適的抗原偶聯的微球陣列。

（2）渦旋振蕩和超聲混勻20s以重懸微球。

（3）配制微球工作液，用檢測緩沖液將偶聯的微球稀釋到終濃度為200個微球/μl，每個反應需要25μl微球工作液。

（4）用檢測緩沖液將生物素化的檢測抗體稀釋到 ［IC₇₀］或［IC₈₀］，每個反應需要25μl稀釋后的生物素化的檢測抗體。

（5）加25μl檢測緩沖液到圓底反應板（CoStar3789）各空白孔。

（6）在相應孔中加25μl標準品或樣本。

（7）每孔加25μl微球工作液。

（8）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（9）每孔加25μl生物素化的檢測抗體。

（10）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（11）封板，室溫下在平板搖床上孵育60min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（12）用檢測緩沖液稀釋SAPE到適當的濃度（通常≥4μg /ml），每個反應需要25μl稀釋后的SAPE。

（13）每孔加25μl稀釋的SAPE。

（14）用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

（15）封板，室溫下在平板搖床上孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

（16）按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

① 在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露。

② 緩沖液信息見表2-7-1。

③ ［IC₇₀］和［IC₈₀］分別指獲取最大捕獲信號強度的70%和80%的檢測抗體的濃度，［IC₇₀］和［IC₈₀］需要用檢測緩沖液滴定來確定。

④ 檢測抗體和SAPE的濃度應優化至最佳濃度，最佳濃度一般應高于洗滌法中的濃度。

⑤ 如果背景很高，則需在分析前增加一次洗滌的步驟，可參考經洗滌法中真空過濾或磁性分離洗滌法的步驟。

（四）直接免疫測定和競爭免疫分析法的聯合應用

競爭免疫分析法也可與免疫計量分析法（夾心法）聯用進行多重分析（Luminex Corporation，2006a）。這個聯合應用策略（免洗）的操作步驟如下。

直接免疫測定法和競爭抑制免疫分析法聯用操作步驟

1.選擇合適的抗體和（或）抗原偶聯的微球試劑。

2.渦旋振蕩和超聲混勻20s以重懸微球。

3.配制微球工作液，用檢測緩沖液將偶聯的微球稀釋到終濃度為1 000個微球/μl，每個反應需要5μl微球工作液。

4.用檢測緩沖液將生物素化的競爭物稀釋到 ［IC₇₀］或［IC₈₀］，每個反應需要5μl稀釋后的生物素化的競爭物。

5.加10μl檢測緩沖液到圓底反應板（CoStar 3789）的各空白孔中。

6.在相應孔中加入10μl標準品或樣本。

7.每孔加5μl稀釋的競爭物。

8.用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

9.每孔加入5μl微球工作液。

10.用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

11.封板，室溫下在平板搖床上孵育60min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

12.用檢測緩沖液將生物素化的檢測抗體稀釋到適當的濃度，每個反應需要10μl稀釋后的生物素化檢測抗體。

13.每孔加入10μl稀釋的檢測抗體。

14.用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

15.封板，室溫下在平板搖床上孵育60min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

16.用檢測緩沖液稀釋SAPE到適當的濃度（通常≥10-12μg /ml），每個反應需要10μl稀釋的SAPE。

17.各孔加入10μl稀釋的SAPE。

18.用排槍輕輕吹打反應物數次以混勻。

19.封板，室溫下在平板搖床上孵育30min（非磁性微球時轉速約為400r/min，MagPlex微球時轉速約為800r/min）。

20.每孔中加入檢測緩沖液至終體積為100μl。

21.按系統操作手冊，取50～75μl樣品于Luminex分析儀中檢測。

注意事項：

（1）在操作過程中避免微球在光線中長時間暴露。

（2）緩沖液信息見表2-7-1。

（3）［IC₇₀］和［IC₈₀］分別指獲取最大捕獲信號強度的70%和80%時的檢測抗體的濃度，［IC₇₀］和［IC₈₀］需要用檢測緩沖液滴定來確定。

（4）生物素化的競爭物、檢測抗體和SAPE的濃度應優化至最佳濃度，最佳濃度一般應高于洗滌法中的濃度。

（5）如果背景很高，則需在分析前增加一次洗滌的步驟。可參考經洗滌的檢測方法中真空過濾或磁性分離洗滌法的步驟。

六、商品化免疫檢測應用和檢測平臺

xMAP技術的廣泛應用促進了一系列科研產品和平臺的開發，并獲準用于免疫診斷實驗室的體外診斷。這些產品包括人類白細胞抗原（HLA）和組織配型的蛋白和抗體檢測、自身免疫性疾病分析、感染性疾病的血清學檢測、神經退行性變以及過敏原篩查（Luminex Corporation，2011a）。表2-7-3介紹了Luminex合作伙伴提供的各種免疫診斷平臺、應用領域和相關服務。列出的參考文獻是最近（2013年，譯者注）發表的論文，這些論文描述了相關產品在免疫診斷中的應用和性能。

七、結語

Luminex xMAP 系統可在一個反應體系中同時檢測多達500種待測物，通量高，性能佳。xMAP技術所需儀器、實驗方法學和軟件容易獲得，因此廣泛用于免疫診斷、臨床前期試驗/臨床試驗以及研究領域，是一種快速、經濟、高通量的生物檢測平臺。同時，涉及該方法的實驗方案和出版物也容易獲得，進一步促進了該技術的發展和推廣應用。目前，已發表的文獻也證明了該技術平臺的靈活性和通用性。雖然本章節主要介紹xMAP技術的免疫檢測方法、診斷應用及相關產品，但是該技術同樣廣泛應用于核酸檢測，包括單核苷酸多態性基因分析、分子遺傳學、基因表達譜、傳染性疾病的分子檢測和microRNA表達譜分析等。

八、參考文獻和進一步閱讀

（黃憲章、鄭磊　譯，陳福祥　審）