第八節(jié) 芯片上的實驗室、微/納米免疫檢測系統(tǒng)、微陣列芯片

本書“免疫檢測產(chǎn)品技術(shù)”部分（該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注）介紹了市場上許多不同的商業(yè)化的免疫檢測系統(tǒng)，所使用的儀器尺寸包括從落地式的實驗室分析儀到緊湊的床旁檢測（POC）設(shè)備。最早的POCT測試是基于玻片凝集法用于檢測人絨毛膜促性腺激素（Santomauro and Sciarra，1967），此后POCT的應(yīng)用范圍不斷擴大（Kasahara and Ashihara，1997；Price，1998；Rasooly，2006；Sia and Kricka，2008；Gervais等，2011a）。雖然傳統(tǒng)的POCT系統(tǒng)是獨立且體積相對較小，但是不需要放大就可以很容易地看到其試劑和反應(yīng)容器。然而，在過去的十多年間，許多微量免疫檢測方法已經(jīng)在科研實驗室得到了證實，且相當(dāng)一部分產(chǎn)品已經(jīng)上市，并有力地帶動相應(yīng)設(shè)備的市場化。雖然有些微量免疫檢測方法具有納米級的元素，但真正的納米流控免疫檢測方法還處于早期研發(fā)階段，它們在技術(shù)上和商業(yè)上是否可行仍有待觀察。

檢測系統(tǒng)微型化的主要目的有以下幾點：

● 經(jīng)濟——減少生物材料的消耗和降低生產(chǎn)過程成本。

● 環(huán)保——減少固體和液體廢棄物和包裝的生物危害。

● 簡化——整合所有免疫檢測步驟（包括樣本制備、分析、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果呈現(xiàn)等），這對于POCT至關(guān)重要。

● 便攜——方便現(xiàn)場檢測，比如資源匱乏的地區(qū)或場所。

● 通量——能同時檢測多種不同的分析物，比如蛋白組學(xué)研究。

● 速度——由于擴散距離短，反應(yīng)速度更快。

隨著檢測微型化概念的進(jìn)一步發(fā)展，分析儀器也可能被重新設(shè)計，與測試單元融為一體，從而實現(xiàn)完全的一次性免疫診斷測試。與傳統(tǒng)的大型檢測儀器相比，微芯片分析儀有很多優(yōu)勢，但也有不足（表2-8-1）。

把復(fù)雜的分析功能集成到小型設(shè)備的想法是基于微全分析系統(tǒng)（micro total analysis systems，μTAS）的概念，這個概念最初是由Manz及其同事于20世紀(jì)90年代早期提出（Manz等，1990，1993）。該概念的目標(biāo)是將盡可能多的實驗步驟包括加樣、樣本處理、分離、檢測、數(shù)據(jù)分析等集成到緊湊的“芯片實驗室（lab-on-a-chip，LOC）”設(shè)備中。將這些設(shè)備與免疫傳感器區(qū)分開來是它能整合分離的步驟，從而避免與多分析物檢測和干擾相關(guān)的典型傳感器問題（Harrison等，1992，1993）。盡管側(cè)向?qū)恿鳈z測被認(rèn)為是LOC的一種，但這里不予討論（相關(guān)內(nèi)容見第二部分第三節(jié)“側(cè)向?qū)恿髅庖邫z測系統(tǒng)”）。

基于LOC設(shè)備所需要的微芯片（microchips）是小型化的組件，大小一般為100nm至1mm。通常，這些芯片從外觀上看是二維的，且制造成一些列的層。微流控（microfluidic）微芯片（也稱為流控微芯片（fluidic microchips））主要是由狹窄通道連接的反應(yīng)池組成，樣本和反應(yīng)液沿著這些通道運輸。不同的檢測階段在芯片的不同部位運行。內(nèi)部容積取決于特定結(jié)構(gòu)的橫截面和幾何結(jié)構(gòu)，但通常在納升到微升范圍內(nèi)。

生物電子（bioelectronics）芯片在生物分子（抗體、抗原或信號生成分子）與非生物材料之間有一個連接，該連接會將信號從生物分子傳遞或調(diào)制到設(shè)備上，該設(shè)備可以將電子信號放大。芯片內(nèi)置電氣組件與流體組件。電氣組件（比如電極）位于芯片內(nèi)部如微室，控制微室內(nèi)液體或其中成分（Ronkainen等，2010）。芯片通常組裝在電路板上，通過電路板連接芯片內(nèi)各電子元件，并插入到控制顯示器上。

微陣列芯片（microarray）最初是將試劑有規(guī)律地固定在小且平整的硅片、玻片或塑料片的表面（Schena，1999，2000），陣列是通過在芯片表面進(jìn)行點樣、沖壓或者直接原位合成試劑而形成，根據(jù)芯片上試劑的位置不同可進(jìn)行識別。另一種基于微球的微陣列芯片是將試劑偶聯(lián)在微米大小的微球上，每組微球具有不同的光學(xué)特性，檢測的過程中可以進(jìn)行單個識別。微陣列試劑包括互補脫氧核糖核酸（cDNA）、寡核苷酸、適配體、抗體、親合體、抗原、寡肽和組織切片。不同的芯片其微點（microspots）的大小、密度和數(shù)量可以差別很大。點的大小一般在100μm以下，日常使用的芯片每平方厘米包含有數(shù)百個點。

早期微流控系統(tǒng)的微加工（microfabrication）是基于對玻片或硅片等物質(zhì)的蝕刻，然后進(jìn)行熱封以產(chǎn)生密閉的通道（Madou，2011）。其免疫檢測的應(yīng)用集中在帶有電泳分離步驟的均相免疫反應(yīng)模式。在過去的十多年中，芯片加工技術(shù)取得顯著進(jìn)步，已轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^注塑或壓花然后層壓的聚合芯片。（Becker and Locascio，2002；Liu，2007；Becker and Gaertner，2008）這些基于復(fù)制的方法使低成本微流體變成了現(xiàn)實，正如一次性POC免疫診斷所需要的一樣。制作該芯片典型的材料包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯（有機玻璃）和環(huán)烯烴共聚物（Nanes等，2010）。聚二甲硅氧烷（PDMS）芯片廣泛應(yīng)用于研究領(lǐng)域，因為它們可以通過一個簡單的鑄造工藝制造，并且表面可以功能化以滿足免疫檢測的要求（McDonald等，2000；Sia and Whitesides，2003；Zhou等，2010）。值得注意的是，熱塑性材料注塑和PDMS鑄造可以擴展到納米級（Attia等，2009）。

就連那些被認(rèn)為具有非凡創(chuàng)新能力的免疫檢測的科學(xué)家和工程師們也不可避免地會被納米技術(shù)所吸引。由于免疫檢測實際上是分子反應(yīng)，免疫檢測可微型化以節(jié)約成本并提高檢測容量。納米技術(shù)（nanotechnology）指的是在原子、分子以及小于100nm的大分子水平進(jìn)行的操作技術(shù)。雖然免疫檢測跟分子反應(yīng)有關(guān)，但是只有檢測系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、加工或控制達(dá)到了納米水平才算是納米技術(shù)。這包括由納米組件或者納米粒子（nanoparticles，小于100nm）組裝的更大的結(jié)構(gòu)。

微流控中液體驅(qū)動有兩種方式，一種是通過毛細(xì)管作用被動填充，一種是利用壓力差、電場作用、旋轉(zhuǎn)離心力或者動態(tài)改變表面濕度來驅(qū)動。與微流控相比，納流控（nanofluidic）需要納米級別驅(qū)動液體流動的新方法以克服表面張力（Sparreboom等，2010；Eijkel and van den Berg，2005）。雖然已經(jīng)出現(xiàn)許多納米級的分析系統(tǒng)，但免疫診斷設(shè)備目前還很難見到（Sparreboom等，2009；Napoli等，2010）。

為了理解微/納米級免疫檢測的優(yōu)點和挑戰(zhàn)，需要先了解一些基本理論。微/納米級免疫檢測跟傳統(tǒng)的免疫檢測有很多不同。

一、微型化的基本原理

大型分析系統(tǒng)與微型分析系統(tǒng)有許多根本上的區(qū)別（Janasek等，2006；Gad-el-Hak，2006；Kirby，2010），這些變化主要影響液流和被取樣的分析物分子數(shù)量，也就是檢測能力問題。本節(jié)主要是側(cè)重于微米級分析系統(tǒng)，也會涉及納米級系統(tǒng)。

（一）黏度和表面張力

表面張力（surface tension）源自液體表面的分子間引力。水的表面張力強是由于相鄰水分子的氫鍵作用力。在含水的液態(tài)生物樣本中，如血液、尿液和痰液，還有其他的分子間引力會產(chǎn)生更高的表面張力導(dǎo)致黏度（viscosity）增加。

即使在厘米水平，表面張力也能影響樣本和試劑在反應(yīng)容器中的分布，如微量反應(yīng)板。隨著物體尺寸的減少，物體的體積和慣性按尺寸的三次方減少，而表面張力只是按線性減少。因此，在微米和納米水平，表面張力是主要的作用力，對于表面性能的控制至關(guān)重要。

濕潤（wetting）是指一個固體表面與液體（潤濕相）接觸的能力。濕潤程度（或濕潤性，wettability）是由表面黏附力（自由能）和潤濕相內(nèi)的凝聚力（表面張力）之間的平衡所決定。潤濕相傾向于在固體表面擴散，多孔固體傾向于吸收潤濕相。在免疫檢測中，液體通道對水溶液具有高濕潤性是非常重要的。濕潤性是通過測量一滴水溶液滴在塑料、玻璃或金屬等固體材料上形成的接觸角（contact angle）來確定的。

表面張力可以通過使用吸引液滴的親水表面來修正。有許多方法可以增加檢測設(shè)備中使用的塑料材料的濕潤性，包括電暈放電和等離子體處理。化學(xué)表面處理方法包括清潔、底漆、涂層和蝕刻。溫度升高會降低表面張力（及黏度），但是因為蛋白在高溫下會變性，所以在免疫檢測方面價值有限。也可以在樣本或者流動基質(zhì)中添加表面活性劑使注塑的模制塑料等疏水性表面能夠被潤濕。然而，表面活性劑對免疫檢測結(jié)合可能存在干擾。

（二）毛細(xì)管流

毛細(xì)管流（capillary flow）是利用高表面積與體積比介質(zhì)的表面張力效應(yīng)，介質(zhì)包括多孔材料（如硝酸纖維素膜試紙條）和封閉的微結(jié)構(gòu)表面（如基于微芯片的免疫診斷）（Eijkel and van den Berg，2006）。水分子被這些介質(zhì)內(nèi)的親水表面所吸引，導(dǎo)致窄管內(nèi)前緣的水向前移動，甚至可以克服重力的影響。當(dāng)水分子對管壁的黏附力強于水分子之間的凝聚力時，毛細(xì)作用就會發(fā)生。由于表面張力，水分子之間的吸引力也會導(dǎo)致前面的水分子牽引著后面附近的水分子向前運動。毛細(xì)管力作用于液體和通道壁的接觸周界，因此有助于微型化。這是因為在尺度縮小時，周長相對于通道橫截面積將變得更大。正如Lucas-Washburn方程所示，在微通道的毛細(xì)管填充過程中，彎月面是在填充通道段的流體阻力線性增加的基礎(chǔ)上，以時間的平方根成正比進(jìn)行的（Delamarche等，2005）。然而，在恒定截面通道中，這種被動填充速度減慢的問題可以通過改變設(shè)備的幾何結(jié)構(gòu)和/或表面疏水性，從而可以有效的生成“可編程”的被動式微流控線路來克服。

（三）電滲流

對于電動微型免疫檢測系統(tǒng)來說，電滲流（electroosmotic flow，EOF）是一種簡便的流體驅(qū)動方法。EOF是基于帶電表面（如玻璃、硅或等離子體處理的塑料上的微通道）形成的離子層而產(chǎn)生。這里，樣本成分形成了與靜態(tài)的帶電表面所帶電荷相反的可移動的離子層。在電場的作用下，離子層會朝著帶相反電荷的電極方向遷移。對于微型系統(tǒng)，則會在通道中產(chǎn)生大量的液體流動。EOF可以方便地通過電場控制微芯片周圍的液流，但它所需要的帶電表面在注塑成型的塑料微流體較難以獲得。

（四）減少樣品體積對于低濃度樣本的影響

樣本中分析物的濃度是恒定的，與樣本體積無關(guān)。當(dāng)樣本體積減小的時候，樣本中分子數(shù)量會減少。免疫檢測分析物的濃度通常在微摩爾、納摩爾或皮摩爾級水平。

從表2-8-2可以看出，這對免疫檢測的規(guī)模有一個基本限制。如果樣本體積是1fl，那么它的規(guī)格也就是1μm3，這比一個真正納米元件的體積大了10倍。然而，如果樣本的濃度是1nmol/L，那么很有可能1fl樣本中沒有一個分析物分子。

低樣本體積對低濃度樣本測定的影響在定性和定量上是不一樣的。如果能夠開發(fā)出理論上理想的免疫檢測方法，其檢測效率是100%（能檢測到樣本中的每一個分子），且信噪比大于1 000，那么在上述的例子中，可以基于小于200fl的樣本體積設(shè)計定性檢測方法。然而，對于定量檢測來說，為了將誤差控制在1%以內(nèi)，分析物的分子數(shù)量必須為10 000個（因為標(biāo)準(zhǔn)差大約等于分子數(shù)量的平方根），那么樣本體積必須為17pl。

為了解決納米設(shè)備中樣本體積的問題，一個辦法就是提供足夠的樣本量，以便增加與捕獲抗體或抗原作用的分子數(shù)量（Eijkel，2007）。時間積分流通系統(tǒng)將抗體或抗原固定在表面，去捕獲分析物并集中在一個點上。可是，不論是競爭性還是非競爭性免疫檢測，樣品體積應(yīng)該通過固定加樣體積或系統(tǒng)設(shè)計要求來確定。當(dāng)然環(huán)境分析物免疫測定是個例外（見“環(huán)境分析物免疫測定”（該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注））。

（五）減少樣本體積對反應(yīng)動力學(xué)的影響

免疫檢測微型化的一個優(yōu)點是減少了分子移動距離。分子擴散需要的時間與擴散距離的平方成正比，跟分子自身的擴散系數(shù)成反比。分子的擴散系數(shù)主要是由分子大小決定的。

在液相檢測法中，所有的分子在溶液中自由運動。除非樣本被過度稀釋，否則樣本量不會影響抗原抗體的結(jié)合。但是隨著檢測方法的發(fā)展，越來越注重非均相的固相免疫分析，這種方法需要分離洗滌步驟。在固相免疫檢測中，主要的反應(yīng)物是被固定的。這就減緩了反應(yīng)速度，因為只有液相中的反應(yīng)物可以自由移動。由于微型反應(yīng)體系體積特別小，反應(yīng)物的擴散時間也就縮短了，因此可以增加反應(yīng)速率從而減少反應(yīng)到達(dá)平衡的時間，從而減少總的分析時間。

另一個增強反應(yīng)動力學(xué)的方法是使樣本通過檢測器時保持一段時間以確保能夠檢測到，或用電場將分子吸附到表面。在設(shè)計流通系統(tǒng)時，最小化包被有捕獲抗體的反應(yīng)池的直徑很重要（Hofmann等，2002）。用電場吸引生物分子到敏感表面的方法包括電熱效應(yīng)（Sigurdson等，2005；Feldman等，2007）和介電電泳（Yasukawa等，2007；Hart等，2010），更詳細(xì)的內(nèi)容參見近期的綜述（Wang，2006；Ronkainen等，2010）。

（六）納米級分析系統(tǒng)

需要注意的是，上述許多構(gòu)思在納米分析系統(tǒng)中仍需要進(jìn)一步改善。常規(guī)分析系統(tǒng)的原理在納米級似乎不適用，此外還存在一個“可檢測性”問題，就是檢測的分子數(shù)目太少不具有代表性。這可能是至今仍缺乏真正意義上的納米級免疫檢測系統(tǒng)的部分原因。然而，應(yīng)該指出的是，大多數(shù)納米研究仍處于起步階段，“可檢測性”的問題能夠通過僅僅一維納米尺度的系統(tǒng)或通過信號隨時間累積的時間積分系統(tǒng)來解決（Eijkel，2007）。

二、微/納米級免疫檢測設(shè)計

（一）檢測模式

目前常用的兩種免疫檢測模式是競爭性（competitive）免疫檢測和直接免疫檢測（immunometric）（通常也稱為非競爭性免疫檢測）（見第二部分第一節(jié)“競爭性和非競爭性免疫測定（包括ELISA）的原理”）。競爭性免疫檢測的根本局限是分析物的濃度在零和非常低的水平時，信號相當(dāng)強，造成低信噪比，犧牲了靈敏度。由于微/納米級免疫檢測產(chǎn)生的信號水平極低，所以優(yōu)先使用直接免疫檢測法來最大化信噪比。

為了提高非均相免疫檢測方法性能，有效地去除未結(jié)合的標(biāo)記分子至關(guān)重要，也就是說只有將所有未結(jié)合的標(biāo)記物全部洗滌后，極低濃度的與標(biāo)記物結(jié)合的分析物才能被準(zhǔn)確地測出來。微流控免疫診斷設(shè)備可以整合主動洗滌步驟，但是對于常規(guī)的自動分析儀的被動洗滌，要將分離效率提高到＞99.99%是非常困難的（見第三部分第三節(jié)“固相和其他分離系統(tǒng)”）。

環(huán)境分析物檢測作為非均相分析中的一種，它有兩點獨到的優(yōu)勢。首先它不需要加樣，捕獲抗體只對抗體區(qū)附近的分析物“采樣”。其次這種檢測模式包括很小的抗體埋點靶，這些點通常直徑小于100μm，間距小于50μm，使它適于在微水平和免疫檢測陣列上制造生產(chǎn)（見“環(huán)境分析物免疫測定”（該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注））。

在均相免疫檢測中，檢測抗體和分析物均處于液相中。雖然大多數(shù)均相免疫檢測方法往往比非均相檢測靈敏度低，但它的優(yōu)勢在于不需要洗滌分離步驟去除未結(jié)合的標(biāo)記檢測抗體（見第二部分第二節(jié)“均相免疫測定”）。

電動（electrokinetic）檢測的分離系統(tǒng)包括親和電泳和電色譜檢測（Hou and Herr，2008），電動分離檢測可進(jìn)一步分為以下幾類：①預(yù)親和（affinity preparative）：在分離之前或分離期間發(fā)生的基于親和力的結(jié)合；②預(yù)平衡親和檢測（preequilibrated affinity assays）：在芯片分離步驟之前，親和試劑和樣品預(yù)先混合至平衡；③ 芯片平衡親和檢測（on-chip equilibrated affinity assays）：親和試劑和樣本在分離通道內(nèi)動態(tài)混合至平衡。預(yù)親和可以用于免疫富集或免疫耗竭（Breadmore，2007），這有助于降低檢測限并能擴大免疫診斷檢測的動態(tài)范圍，特別是在對復(fù)雜的臨床樣品進(jìn)行檢測時（Mondal and Gupta，2006）。以LOC為基礎(chǔ)的微流控系統(tǒng)非常適用于芯片平衡親和檢測，因其可以將多個步驟整合到單一芯片上，并可以選擇多步驟同時進(jìn)行。經(jīng)過免疫提取、標(biāo)記、電洗脫以及2min的電泳分離后，同時檢測血液、唾液和尿液中的4種激素的技術(shù)已有應(yīng)用（Wellner and Kalish，2008）。免疫親和樣品制備甚至能對皮膚活檢樣本中的12種炎性標(biāo)志物同時進(jìn)行檢測，主要是通過電泳分離所有標(biāo)志物，再與熒光標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合（Phillips and Wellner，2007）。其他基于電動分離的微流控免疫診斷系統(tǒng)包括檢測血漿中抗感染藥的設(shè)備（Phillips and Wellner，2006）、監(jiān)測胰島素分泌的四通道檢測系統(tǒng)（Dishinger and Kennedy，2007）以及同時定量檢測經(jīng)50s電泳分離后的血清中4種腫瘤標(biāo)志物的儀器（Yang等，2010）。

Yager及其同事已開發(fā)出基于擴散系數(shù)的免疫檢測方法，其通過擴散系數(shù)的變化將結(jié)合與未結(jié)合的檢測抗體區(qū)分開。美國華盛頓州雷德蒙德市的Micronics公司已經(jīng)研制出一種競爭性均相免疫檢測方法，在玻璃-聚酯薄膜-玻璃的雜交芯片上嵌入一個T形傳感器，芯片包含兩個流體入口，分別經(jīng)過兩個通道后匯合成一個100μm×1 200μm（深×寬）的反應(yīng)槽，然后連接到流體出口（Kamholz等，1999；Hatch等，2001）。在層流條件下，兩種流體（抗體試劑和摻有熒光標(biāo)記抗原的樣本）平行流動，它們只能通過擴散來混合。抗原向平行流體的擴散受平行流體中的抗體結(jié)合比例的限制。樣本中抗原和標(biāo)記抗原競爭結(jié)合抗體流中抗體的結(jié)合位點，這是抗原定量的基礎(chǔ)。這種檢測的優(yōu)點是可以檢測稀釋的全血而無須去除紅細(xì)胞。該方法檢測全血中苯妥英鈉需要不到1min（10～400倍稀釋），能夠檢測到低至0.43nM的苯妥英鈉（Hatch等，2001）。

（二）一次性POC與可讀性檢測卡

免疫檢測設(shè)計需考慮的一個重要因素是針對不同應(yīng)用需求設(shè)計免疫診斷方法。理想的POC免疫診斷設(shè)備組成如圖2-8-1所示。

大多數(shù)POC裝置都是可讀性檢測卡（如Alere TRIAGE?系列），同時也有純粹的一次性POC，這些主要面向家庭測試和醫(yī)療資源貧乏的地區(qū)（如BayerA1CNow+?），表2-8-3概述了不同檢測儀器的主要區(qū)別。

一次性測試儀應(yīng)用的關(guān)鍵問題在于無法使用外部設(shè)備（如泵）來主動驅(qū)動液體的流動。目前主要著眼于發(fā)展基于毛細(xì)管填充微流體回路的被動驅(qū)動檢測設(shè)備，但是在進(jìn)行非均相檢測時，就可能需要面對難以洗去未結(jié)合檢測抗體的難題。對于被動驅(qū)動系統(tǒng)來說，需要使用過量的樣本去洗滌未結(jié)合的抗體。以下介紹免疫診斷設(shè)備對定標(biāo)、校準(zhǔn)、信號生成和檢測的影響。

（三）抗體

與常規(guī)免疫檢測一樣，微量免疫檢測需要抗體具有適當(dāng)?shù)奶禺愋裕疫€需要具有高的親和力（K_eq＞1010）。單克隆抗體能夠提供最高濃度的活性抗體（這對微/納米級檢測儀器是非常有利的），但大多數(shù)單克隆抗體缺乏像多克隆抗體一樣的高親和力。理想的抗體應(yīng)該是具有高親和力的單克隆抗體。對抗體互補決定簇區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行選擇性修飾，產(chǎn)生新的噬菌體DNA序列，再利用噬菌體展示技術(shù)從大的噬菌體文庫中篩選出高親和力的單克隆抗體（通常K_eq是107～109）。通過這種方法可獲得親和力K_eq≥1011的單克隆抗體（見第三部分第一節(jié)“抗體”）。

（四）捕獲抗體固定

在非均相免疫檢測中，可以將試劑固定在微流控結(jié)構(gòu)內(nèi)的微球上（Tarn and Pamme，2011）。這種捕獲抗體的固化不僅增加了表面積-體積比，還能夠減少分析物的擴散距離，提高分子間相互作用。典型的珠子材料包括聚苯乙烯/乳膠（Ohashi等，2009；Yuan等，2009；Ihara等，2010）和玻璃（Tsukagoshi等，2005）。

磁珠具有的額外優(yōu)勢，就是無須設(shè)置物理限制屏障。磁珠能夠被磁力吸附，在需要的時候通過關(guān)閉磁場而釋放磁珠（Pamme，2006）。因此，各種各樣的基于磁珠的免疫檢測應(yīng)用于微流控中并不為奇（Hayest等，2001；Choi等，2002；Petkus等，2006；Mulvaney等，2007；Do and Ahn，2008；Peyman等，2009；Chen等，2011）。

然而更常見的是，先將免疫試劑包被于微流控結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，再將抗原或抗體固化于其上。固化方法包括物理吸附、自組裝單層膜（selfassembled monolayers，SAMs）、溶膠-凝膠法和共價偶聯(lián)（Shankaran and Miura，2007）。常見的化學(xué)物質(zhì)包括葡聚糖、蛋白A或蛋白G和生物素-鏈霉抗生物素蛋白。一個重要的區(qū)別是功能基團的方向，因為這能影響固化抗體的活性。通過抗體的微接觸打印技術(shù)，能夠在微通道產(chǎn)生定向功能化的自組裝單層膜（Foley等，2005）。

另一種方法是直接將抗體固定于致敏的表面，如表面等離激元共振（surface plasmon resonance，SPR）或表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）。同樣可將抗體固定于電極或場效應(yīng)晶體管（field effect transistor，F(xiàn)ETs）上進(jìn)行電化學(xué)檢測，或固定于石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）上，或懸臂上進(jìn)行機電檢測，詳見本節(jié)后述的“芯片檢測方法”部分。

（五）標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)

與常規(guī)免疫檢測相同，定量微量免疫檢測在標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)上充滿了挑戰(zhàn)（見第三部分第五節(jié)“標(biāo)準(zhǔn)化和校準(zhǔn)”）。與臨床分析儀一樣，基于微芯片的免疫診斷采用可溯源的國際標(biāo)準(zhǔn)制物質(zhì)來確認(rèn)其準(zhǔn)確性。微加工技術(shù)能夠在微芯片上生產(chǎn)出相同的反應(yīng)通道和反應(yīng)孔，因此如果校準(zhǔn)品和樣本同批檢測，則可以直接通過參考校準(zhǔn)曲線來估算樣本濃度。在微量檢測中，反應(yīng)動力學(xué)更快，這使得反應(yīng)可以在更短的時間內(nèi)達(dá)到平衡。這種快速達(dá)到平衡的檢測方法能夠允許樣本和校準(zhǔn)物之間的微小差異，且在極微量檢測中，更容易在各樣本間快速達(dá)到平衡溫度。

理論上具有近線性劑量-反應(yīng)曲線的非競爭性免疫檢測法所需要的校準(zhǔn)品可能不超過兩個，而特異性強、呈線性劑量-反應(yīng)的試驗可僅使用一個標(biāo)準(zhǔn)品。對于可讀性檢測卡系統(tǒng)，操作人員可根據(jù)已知濃度的分析物的響應(yīng)選擇（重新）校準(zhǔn)，這在一次性POC免疫診斷上是難以實現(xiàn)的。這種情況下，可以使用廠家提供的定標(biāo)曲線，它是以電子文檔存儲在檢測設(shè)備上的，但隨著時間的推移，該定標(biāo)曲線的準(zhǔn)確度會發(fā)生下降，且無法補償和調(diào)整，因此廠家要求在有效期內(nèi)使用。

由于以緩沖液為基質(zhì)的校準(zhǔn)品和血液樣本之間的表面張力差異，其基質(zhì)效應(yīng)在微通道內(nèi)可能會被放大，通過稀釋樣品可降低其影響，但這需要人工操作，并減少了樣本中分子的數(shù)量，可能會降低檢測靈敏度。對于一次性免疫診斷檢測，微芯片里的緩沖液會發(fā)生蒸發(fā)，但又難以補充，這也限制了該方法的有效期。

（六）信號生成

在免疫檢測中，由于分析物濃度非常低時，產(chǎn)生的信號很弱，在微量免疫檢測中信號會更弱，因此必須使用高特異性和高活性的標(biāo)記物。為了實現(xiàn)高信噪比，必須消除噪聲源。后面我們將在不同的章節(jié)中詳細(xì)討論免疫測定中信號發(fā)生系統(tǒng)（見第三部分第二節(jié)“信號產(chǎn)生及檢測系統(tǒng)”），這里我們將具體討論微量免疫檢測信號生成面臨的挑戰(zhàn)及解決方案。

在傳統(tǒng)的免疫診斷檢測中，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）因其通過酶促反應(yīng)放大信號而被廣泛使用。一般情況下，ELISA使用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為標(biāo)記物，催化發(fā)色底物的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色而放大信號。然而在微量條件下，能夠檢測的光路波長是有限的，這也部分解釋了為什么在微量免疫檢測中更多傾向于使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，因為它只需要一個檢測器就可實現(xiàn)。

信號放大也可以通過銀增強的納米顆粒標(biāo)記來實現(xiàn)（Nam等，2003）。具有高擴散性的金標(biāo)納米顆粒在復(fù)合物形成后通過銀顆粒沉積被催化放大。形成的銀包被標(biāo)記物有很高的靈敏度，可以被普通的相機或掃描儀檢測，同時也有助于POC診斷（Chin等，2011）。

然而，絕大多數(shù)微量免疫診斷方法仍然依賴于熒光標(biāo)記，免疫夾心法中最常見的是標(biāo)記二抗。與使用單一染料分子相比，攜帶大量染料分子的微球由于能發(fā)射更強的熒光更為可取。最近，在激發(fā)光和發(fā)射光之間具有較大斯托克斯位移的熒光微球已成為可用于集成一次性免疫診斷裝置的光譜過濾材料。例如，包含一系列染料的TransFluoSpheres?聚苯乙烯微球能產(chǎn)生高達(dá)200nm的斯托克斯位移特別有應(yīng)用價值，已應(yīng)用于具有集成正面熒光檢測的免疫診斷芯片中（Ryu等，2011）。

目前，利用光學(xué)檢測的微芯片免疫診斷方法中信號增強措施主要聚焦于使用納米技術(shù)源探針（Myers and Lee，2008；Azzazy等，2006）。量子點（quantum dots，Q-dots）尤其受人關(guān)注，因其發(fā)射光窄且可調(diào)節(jié)，非常適合于多通道檢測（Lee等，2007）。這些半導(dǎo)體顆粒通常被植入高分子微球里，目前已經(jīng)應(yīng)用于同時檢測HIV、HBV和HCV的微芯片中（Klostranec等，2007）。目前，Q-dot的成本較高，功能化和穩(wěn)定性仍然存在問題，限制了其在POC診斷中的應(yīng)用。

一個有趣的Q-dots信號產(chǎn)生替代物是含有陶瓷納米微球的稀土金屬，可充當(dāng)上轉(zhuǎn)換熒光（Yan等，2006）。這種熒光在紅外區(qū)被吸收，并以可見光譜發(fā)射，產(chǎn)生了有效的反斯托克斯位移。這避免了體液中的背景自發(fā)熒光，從而提高了定量診斷應(yīng)用中的信噪比。

對于非光學(xué)檢測方法，可以充分利用微量分析系統(tǒng)中增加的表面積與體積比的技術(shù)，尤其是對于致敏表面作為生成信號的設(shè)備，就像在電化學(xué)和機電檢測系統(tǒng)中一樣。下一節(jié)將回顧現(xiàn)有的光學(xué)和非光學(xué)檢測的解決方案及其在微量分析系統(tǒng)中的應(yīng)用。

（七）芯片檢測方法

基于微芯片的分析設(shè)備受（Jiang等，2011）到體積小和光程短的限制（Myers and Lee，2008）。此外，還要求這些設(shè)備低成本和便于攜帶，以便應(yīng)用于POC檢測，但又不能影響靈敏度和精密度（Weigl等，2008）。以下概述如何解決以上的挑戰(zhàn)，表2-8-4列舉了光學(xué)和非光學(xué)芯片檢測的方法。

根據(jù)朗伯-比爾定律，微芯片中光程長度的減少會對吸光度（asorbance）檢測產(chǎn)生不利的影響。研究人員已經(jīng)研發(fā)出許多巧妙的解決方案，如通過使用反射鏡或透鏡來增加光路長度以檢測大體積樣本（Myers and Lee，2008）。相反，Lee及其同事在芯片ELISA方法中，在基于光盤（CD）的檢測系統(tǒng)上，使用深6mm的檢測池和偶聯(lián)硅光電二極管的450/630nm波長LED光源，檢測HRP標(biāo)記催化TMB顯色，根據(jù)其顏色深淺對乙型肝炎進(jìn)行檢測（Lee等，2009a）。Maier及其同事在增強共振吸收ELISA中使用標(biāo)記的金納米顆粒對食品過敏原進(jìn)行檢測（Maier等，2008），其目測半定量的檢測限可以達(dá)到1ng/ml，如果使用讀數(shù)儀器，檢測限會更高。

熒光（fluorescence）檢測在芯片免疫檢測中得到了廣泛的發(fā)展。早期的工作主要集中于激光誘導(dǎo)熒光（laser-induced fluorescence，LIF），這種高能激光聚焦在一個小區(qū)域，它的窄發(fā)射光譜有利于區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光（Chiem and Harrison，1997；Jiang等，2000）。帶有熒光掃描檢測的多通道微流控免疫檢測也已經(jīng)被開發(fā)出來（Cheng等，2001）。最近，一種基于LIF對唾液中牙周疾病標(biāo)志物進(jìn)行檢測的口腔免疫診斷集成便攜式儀器已經(jīng)問世，其靈敏度可達(dá)到納摩爾至皮摩爾水平（Herr等，2007）。McDevitt和他的同事利用Q-dots獨特的光譜特性，將傳統(tǒng)的用于HIV患者CD4+T細(xì)胞計數(shù)的臺式落射熒光顯微鏡功能簡化為一種手持診斷設(shè)備（Jokerst等，2008）。美國桑迪亞國家實驗室開發(fā)了一種小型并整合有LIF功能的免疫診斷系統(tǒng)，它能夠同時檢測一組生物毒素，其敏感性可達(dá)皮摩爾水平（Meagher等，2008）。該系統(tǒng)集成了電子元件，并使光學(xué)元件小型化，這些光學(xué)元件包括二極管激光器、反射鏡、透鏡、濾光器和光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）。作為邁向完全一次性熒光檢測系統(tǒng)的第一步嘗試，Ryu和他的同事開發(fā)了一種基于無機LEDs和有機光電二極管的綜合免疫診斷檢測系統(tǒng)，據(jù)報道該系統(tǒng)對心肌標(biāo)志物肌紅蛋白和肌酸激酶MB（creatine kinase MB，CK-MB）同工酶的敏感性能達(dá)到ng/ml（Ryu等，2011）。

Baba及其同事最近展示了一種具有熒光偏振檢測的均相微芯片茶堿檢測法（Tachi等，2009）。該方法的原理是，當(dāng)熒光標(biāo)記物與分析物結(jié)合后會發(fā)生旋轉(zhuǎn)運動，并有熒光偏振的變化。這種變化可使用激光、電荷耦合器件（chargecoupled device，CCD）相機和固定并可旋轉(zhuǎn)的偏振器進(jìn)行量化。最近，一種新型超臨界角熒光（supercritical angle fluorescence，SAF）免疫檢測概念已在一次性高分子試管中得到應(yīng)用和驗證，該方法可以檢測皮摩爾水平白細(xì)胞介素-2（Ruckstuhl等，2011）。SAF只發(fā)生在透明基質(zhì)的表面，因此可以用來區(qū)分表面結(jié)合和基體效應(yīng)，從而避免了類似ELISA的繁瑣洗滌步驟。

為了克服熒光檢測中激發(fā)光和發(fā)射光光譜重疊方面的一些局限性，可以利用長壽命的磷光（phosphorescence）采用時間-門控方法進(jìn)行檢測，其激發(fā)光為脈沖形式，可在脈沖結(jié)束后檢測發(fā)射光。然而這種方法需要復(fù)雜的鎖定檢測電子器件，這可能是其尚未應(yīng)用于POC免疫診斷檢測中的原因。最近一種基于上轉(zhuǎn)換熒光（見第三部分第二節(jié)“信號產(chǎn)生及檢測系統(tǒng)”）的獨立方法已應(yīng)用于檢測鼠疫耶爾森菌，這種小巧、便攜的掃描裝置在980nm處由二極管激發(fā)激發(fā)光，PMT檢測541nm處的發(fā)射光（Yan等，2006）。

化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是一種常用的免疫診斷檢測技術(shù)，由于不需要光學(xué)激發(fā)設(shè)備，其對一體化的一次性儀器更具有吸引力。在早期檢測模型小鼠IgG的研究中，在毛細(xì)管電泳微芯片上使用標(biāo)準(zhǔn)魯米諾/過氧化物系統(tǒng)對HRP標(biāo)記的IgG二抗進(jìn)行免疫檢測（Mangru and Harrison，1998）。鑲嵌在檢測區(qū)背面的鋁鏡提供了一個可以提高發(fā)射光的收集效率的反射面，使小鼠IgG的線性范圍達(dá)到0～60μg/ml。最近，化學(xué)發(fā)光檢測已經(jīng)擴展到用于生物制劑檢測的10通道毛細(xì)管流式夾心免疫檢測法（Yacoub-George等，2007）。該方法使用微型蠕動泵驅(qū)動流體進(jìn)入10個平行安裝于毛細(xì)管中的微芯片內(nèi)，在多陽極-光電倍增管陣列上進(jìn)行HRP為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光檢測。一種基于磁珠并集成氣動微泵、微閥和微混合器的微芯片已應(yīng)用于血清中C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）的免疫檢測（Yang等，2009）。這種化學(xué)發(fā)光檢測通過芯片外光度計對吖啶酯標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測，使CRP檢測限達(dá)到0.012 5mg/L。在多通道注塑成型的環(huán)烯烴芯片上使用HRP/魯米諾化學(xué)發(fā)光并用臺式成像系統(tǒng)讀數(shù)，通過間接免疫測定法，測定血清CRP的檢測限為0.1mg/L（Bhattacharyya and Klapperich，2007）。更有趣的是，對板載即時膠片模塊進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，與參考膠片相比，它更適合在定性POC儀器中使用。Pamula及其同事已經(jīng)將磁免疫測定法在數(shù)字微流體平臺應(yīng)用于胰島素和白細(xì)胞介素-6的測定（Sista等，2008b）。該平臺使用標(biāo)記的HRP與PS-Atto底物反應(yīng)，利用PMT進(jìn)行讀數(shù)。

熱透鏡顯微鏡（thermal lens microscope，TLM）檢測采用雙激光束來測量非熒光分子的光熱效應(yīng)，通常采用膠體金進(jìn)行標(biāo)記。在之前的研究中，TLM已經(jīng)有效地應(yīng)用于對人分泌型免疫球蛋白A和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的免疫檢測中（Sato等，2000，2001）。將捕獲抗體包被于聚苯乙烯微球，封閉在100μm×250μm（深×寬）的玻璃通道中，孵育10min后檢測CEA，檢測限可達(dá)0.03ng/ml。Kitamori和他的同事將高敏TLM應(yīng)用于開放式夾心ELISA芯片中，檢測人血清骨鈣素（Ihara等，2010）。該方法使用658nm激發(fā)光、785nm檢測光和一個光電二極管，檢測骨鈣素靈敏度能達(dá)到1.0μg/L，其能力與板式ELISA相當(dāng)。

在表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）光譜學(xué)中，當(dāng)分子靠近被局部電磁場增強的金屬表面時，拉曼光譜的分子指紋信號會增強。在Natan及其同事的早期研究中，將核心為拉曼活性金或銀、表面包被玻璃的分析納米顆粒（glass-coated analytetagged nanoparticles，GANs）應(yīng)用于表面結(jié)合免疫檢測法（夾心法）（Mulvaney等，2003）。他們使用激光作為激發(fā)光，利用CCD檢測散射光。Lee和其同事最近研究了在多晶硅涂層的玻璃薄片上無標(biāo)記測定腺嘌呤的方法（Cho等，2009）。他們在頂部圓柱形線電極和底板金電極之間（SERS活性區(qū)域）施加電場，使帶電分析物在電場中泳動，積聚在相反電極的檢測區(qū)域。如果使用集成的拉曼系統(tǒng)檢測，這種電動預(yù)富集可以使檢測靈敏度提高8個數(shù)量級，所以SERS在低濃度診斷檢測中有很大的發(fā)展前景。

表面等離激元共振（surface plasmon resonance，SPR）可以無須標(biāo)記直接檢測表面的免疫復(fù)合物，詳見本部分第九節(jié)“表面等離激元共振在結(jié)合位點、動力學(xué)和濃度分析中的應(yīng)用”。值得注意的是，基于SPR的Biacore?系統(tǒng)已商業(yè)化，并廣泛應(yīng)用于免疫檢測平臺（見本節(jié)后述“商業(yè)化微流控免疫診斷”部分）。這里，我們僅討論SPR在微流控免疫診斷設(shè)備上的應(yīng)用。在之前的研究中，SPR與微流體單元聯(lián)合使用并與傳感器表面接觸，實時測量單克隆抗體-抗原反應(yīng)的動力變化。抗體或抗原被固定在一個附著在傳感器表面的葡聚糖基質(zhì)中，可以通過SPR監(jiān)測抗原抗體的反應(yīng)過程（Karlsson等，1991）。在過去的20年中，這種對復(fù)雜樣本中低分子量分析物進(jìn)行檢測的高靈敏度、可靠的檢測方法已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，特別是在傳感表面穩(wěn)定性和儀器小型化方面（Shankaran等，2007；Shankaran and Miura，2007）。Lee和他的同事研制出了二維SPR成像檢測的自動化聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片，它基于Kretschmann結(jié)構(gòu)，帶有微泵和閥門，已應(yīng)用于免疫檢測陣列中（Lee等，2007）。考慮到SPR測量的溫度敏感性，該系統(tǒng)還集成了由微加熱器和溫度傳感器組成的溫度控制模塊，使IgG的初步檢測限達(dá)到0.67nM。作為POC應(yīng)用的重要一步，Davis和他的同事已經(jīng)開發(fā)了一種由9V電池供電的完全獨立手持SPR設(shè)備（Feltis等，2008）。為了證明該系統(tǒng)的有效性，他們在固定了抗蓖麻毒素抗體的塑料圓柱形感應(yīng)孔中10min內(nèi)檢測到200ng/ml蓖麻毒素，與Yager和他的同事研究類似。Yager和他的同事已經(jīng)建立了一個基于發(fā)光二極管、圖像檢測器、集成數(shù)字信號處理器和被動溫度控制的小型SPR成像（SPRi）儀器（Chinowsky等，2007）。這種設(shè)計理念也同樣被用于競爭性免疫檢測法測定苯妥英鈉。

盡管上述光學(xué)檢測方法用處非常廣泛，且直接受益于傳統(tǒng)臨床實驗室檢測方法的轉(zhuǎn)換及相關(guān)光學(xué)標(biāo)記化合物的發(fā)展，但是其所需的硬件通常非常昂貴，難以小型化，并且光學(xué)讀數(shù)裝置的性能易受微量檢測方式的影響。如前所述，將光學(xué)檢測集成在芯片上檢測的方法已經(jīng)克服了上述一些不足，但更簡單的小型化檢測技術(shù)仍有很大的發(fā)展空間。電化學(xué)檢測提供了一種可行的替代方法，雖然電化學(xué)檢測方法在多分析物檢測時的干擾以及電極污染和穩(wěn)定性方面有一定的局限性。下面我們將回顧電化學(xué)檢測技術(shù)的現(xiàn)狀，并在其他章節(jié)提供更多細(xì)節(jié)（見“免疫生物傳感器”（該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注））。

在早期的研究中，pH敏感的光尋址電位傳感器（light addressable potentiometric sensors）被用來監(jiān)測細(xì)胞膜上捕獲的免疫復(fù)合物中結(jié)合的尿素酶標(biāo)記的交聯(lián)物發(fā)生酶促反應(yīng)時的pH變化（Briggs and Panfili，1991；Owicki等，1994）。Bakker和他的同事近來已將電位檢測用于納米顆粒的免疫夾心法檢測中（Chumbimuni-Torres等，2006）。當(dāng)標(biāo)記金納米顆粒與檢測抗體結(jié)合并被銀催化沉積后，使用Ag+選擇性電極對銀溶解進(jìn)行電位檢測，50μl樣本中IgG的檢測限達(dá)到12.5pmol。Wang等（2001）報道，當(dāng)堿性磷酸酶標(biāo)記抗體與柱上的抗原結(jié)合后，分離去除游離的抗體，酶標(biāo)記物與4-氨基苯磷酸酯底物發(fā)生酶促反應(yīng)，催化底物生成4-氨基苯酚，引起電流變化，芯片通過檢測電流的變化而實現(xiàn)對產(chǎn)物的檢測。Yoo等（2009）報道，在玻璃微芯片50μm×20μm（深×寬）的反應(yīng)通道中檢測小鼠IgG，其檢測限能達(dá)到1.7amol。基于微流控的酶聯(lián)電流檢測的PDMS微芯片已應(yīng)用于檢測尿液的馬尿酸，其檢測范圍達(dá)到0～40mg/ml。Whitesides及其同事已經(jīng)在微流控紙基電化學(xué)儀器（microfluidic paper-based electrochemical devices，mPEDs）上利用電流時間曲線法測定葡萄糖和方波陽極溶出伏安法檢測重金屬離子（Nie等，2010）。這種簡單的低成本裝置包括兩個內(nèi)置碳電極作為工作電極和反電極，并有一個內(nèi)置Ag/AgCl電極作為偽參比電極，其本質(zhì)上與基于免疫檢測方法的分析是兼容的。最近有一種用納米金標(biāo)記并在微梳型電極上進(jìn)行的電導(dǎo)（conductometric）免疫（夾心）檢測血清中乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的方法，其檢測限可達(dá)0.01ng/ml（Liu等，2009）。作為上述電化學(xué)方法的延展，在微流控免疫檢測中使用互補金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary metal oxide semiconductor，CMOS）傳感器進(jìn)行電容（capacitive）檢測也有報道（Ghafar-Zadeh等，2009）。

Lieber及其同事將FETs與胺和氧化的硅納米線（silicon nanowires，SiNWs）用在源極和漏極之間，研制出了高靈敏度的實時免疫傳感器（Cui等，2001）。通過監(jiān)測抗生物素-生物素化的SiNWs的結(jié)合，已證明了其理念的可行性，但是由于NSB和生物淤積，迄今為止檢測體液樣本中的生物標(biāo)志物仍然困難。Fahmy及其同事最近通過研發(fā)一種微流控芯片克服了這一問題，該芯片從血液樣本中捕獲多種標(biāo)志物，然后基于FET的硅納米帶檢測器對清洗后釋放到純緩沖液中的標(biāo)志物進(jìn)行感應(yīng)檢測（Stern等，2010）。它可以在不到20min內(nèi)通過無標(biāo)記的免疫夾心法檢測出全血樣本中兩種腫瘤標(biāo)志物，證明了該方法是有效的。

機電檢測方法是基于傳感表面的結(jié)合誘導(dǎo)變化，這種變化可通過電氣方法進(jìn)行測量。石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）測量原理基于表面結(jié)合誘導(dǎo)正、負(fù)電極之間的石英晶片振蕩變化。雖然這種方法本質(zhì)上是無須標(biāo)記的，但添加如金納米顆粒后可以提高檢測靈敏度。Tothill及其同事已將這種方法用于測定75%人血清中的腫瘤標(biāo)志物，前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）的檢測靈敏度可達(dá)到0.29ng/ml（Uludag and Tothill，2010）。QCM應(yīng)用于POC免疫診斷的主要缺點是其對基質(zhì)黏度的敏感性，因此需要在芯片上使用質(zhì)控。懸臂（cantilever）法測量的是抗原抗體分子識別時產(chǎn)生的表面應(yīng)力（Hwang等，2009；Waggoner and Craighead，2007），其檢測CK和肌紅蛋白的檢測限＜20μg/ml（Arntz等，2003）。Cho和他的同事已經(jīng)能用這種方法檢測皮摩爾水平的尿PSA（Cho等，2005）。最近，Craighead研究組使用納米粒子的質(zhì)量標(biāo)記免疫測定法將血清PSA的靈敏度提高到1～100fM（Waggoner等，2010）。硅光子微環(huán)諧振器已應(yīng)用于200fM水平血清CRP的檢測，其檢測范圍含6個數(shù)量級（Luchansky等，2011）。

三、微流控檢測的免疫診斷標(biāo)志物

在過去10年左右的時間里，大量的免疫診斷實驗已可以通過微芯片完成，見表2-8-5。分析物的數(shù)量同樣也在增加，現(xiàn)在幾乎已經(jīng)覆蓋了臨床實驗室中檢測的所有疾病標(biāo)志物。其中最令人關(guān)注的是心臟標(biāo)志物、傳染病和腫瘤標(biāo)志物。心臟標(biāo)志物的研究集中在肌紅蛋白、CK-MB、肌鈣蛋白I、CRP和B型鈉尿肽（B-type natriuretic peptide，BNP）的檢測（Mohammed and Desmulliez，2011）。傳染病檢測主要包括用于HIV監(jiān)測的CD4+ T淋巴細(xì)胞計數(shù)、登革熱、甲型流感、丙型肝炎、瘧疾和結(jié)核病（Yager等，2006；Chin等，2011）。迄今為止，通常以低濃度存在的腫瘤標(biāo)志物的研究包括PSA、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）和CEA。各種新標(biāo)記物的快速增加顯示了先進(jìn)技術(shù)的活力，預(yù)示著基于微流控的免疫診斷技術(shù)的良好前景。現(xiàn)有的基于微流控的商業(yè)檢測系統(tǒng)見表2-8-6。

四、微流控免疫診斷技術(shù)的應(yīng)用

POC免疫診斷檢測提供更適用和更高效的護理服務(wù)（見第五部分第三節(jié)“即時檢測”）。對于醫(yī)護人員來說，可以使檢測分散和更有效地利用資源，同時患者也從個性化治療、現(xiàn)場診斷和早治療中受益，并在疾病管理結(jié)果方面有益。然而，要成為一種經(jīng)濟、適用、普遍的診斷工具，POC檢測需是定量的、高通量測量一組分析物，為便攜式或手持的，并且成本足夠低，可以一次性使用。

迄今為止，大多數(shù)非處方（OTC）的POC測試仍然是以多孔硝酸纖維素膜為基質(zhì)進(jìn)行試劑沉積和流體橫向流動的形式進(jìn)行的（詳見本部分第三節(jié)“側(cè)向?qū)恿髅庖邫z測系統(tǒng)”部分）。然而，這些側(cè)向?qū)恿飨到y(tǒng)僅限于進(jìn)行定性或半定量分析。另外，復(fù)雜的可讀性檢測卡系統(tǒng)可以對一組分析物進(jìn)行定量測試，如Alere公司的TRIAGE?系列心肌標(biāo)志物檢測板（詳見“TRIAGE”（此部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注））。這些系統(tǒng)充分利用了微流控技術(shù)的強大功能，能夠同時檢測一批相關(guān)分析物，并被集成到一個小型低成本的一次性微流控檢測板上，而精細(xì)的數(shù)據(jù)讀取和數(shù)據(jù)處理功能儲存于可重復(fù)使用的讀卡器中。

然而，要訪問更多的遠(yuǎn)程POC應(yīng)用程序，如家用檢測，仍然需要開發(fā)類似于側(cè)向?qū)恿鳒y試這樣的小型手持診斷設(shè)備，其分析能力應(yīng)與可讀性檢測卡系統(tǒng)一致，甚至完全與臨床實驗室分析儀相當(dāng)。本節(jié)回顧了在實現(xiàn)這一宏偉目標(biāo)過程中，微流控技術(shù)發(fā)展的各個關(guān)鍵節(jié)點。目前POC的應(yīng)用仍然面臨一些問題，包括被動流體的質(zhì)量控制、降低檢測成本，以及將上述功能集成到一個診斷設(shè)備，并適用于非專業(yè)用戶和醫(yī)療條件匱乏的地區(qū)，如發(fā)展中國家。

（一）流體控制

大多數(shù)傳統(tǒng)實驗室用微流控系統(tǒng)均依賴于流體控制驅(qū)動。典型的驅(qū)動方式是對微芯片入口施以正壓來促進(jìn)微流體回路的填充，在這種方法中常使用高精度注射泵。其他驅(qū)動方式包括使用集成微泵或者在微芯片出口處真空抽吸。另外，還可以利用帶電玻璃或硅表面上的電滲作用，但這種方法需要使用高壓電源。由于上述微流體控制方法都需要額外的輔助設(shè)備，限制了其在POC領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，為突破當(dāng)前的局限，人們開展了廣泛的研究以尋找更好的流體控制方法，包括基于CD驅(qū)動的離心體系、數(shù)字化微流控和基于毛細(xì)管的被動填充系統(tǒng)，以及它們在免疫診斷POCT中的應(yīng)用。在以下內(nèi)容中，我們將介紹這些新型的流體控制方法，并總結(jié)當(dāng)前的技術(shù)狀態(tài)，重點闡述其在免疫診斷POCT中的適用性。

在實驗室用微流控系統(tǒng)向輕便手持式POC裝置的過渡過程中，人們開發(fā)了離心式微流體平臺。在這一平臺中，CD驅(qū)動器用來通過離心力、歐拉力和科里奧利力來控制微流控盤中的液體流動。在生物磁盤平臺上，多個流體單元操控程序與液流驅(qū)動、液面接觸及結(jié)果檢測連接在一起，形成一個低成本的半便攜式平臺。目前，該理念已成功應(yīng)用于基于ELISA的血清和全血心臟標(biāo)志物的免疫學(xué)檢測，并且適用于吸光度、化學(xué)發(fā)光和熒光檢測。也有其他研究組將基于CD的流體控制應(yīng)用于多重免疫測定和全血中乙型肝炎的ELISA檢測，見圖2-8-2。

不同于被動毛細(xì)管吸附填充體系，基于離心方法產(chǎn)生的這種小型半便攜式裝置不受血黏度和表面張力的影響，能提供穩(wěn)健的液流操控。但該方法目前尚存在成本、可靠性和難以實現(xiàn)高靈敏度讀取等方面的不足。

在數(shù)字化微流控中，樣本在絕緣體包裹的電極陣列上作為離散液滴進(jìn)行操作。通過不斷地給電極施加一系列電位，電荷將在電極表面蓄積并動態(tài)地改變其濕潤度，進(jìn)而對液滴進(jìn)行分配、移動、融合、混合和分裂液滴。為防止蒸發(fā)、交叉污染和減少通道表面的非特異性結(jié)合，這些液滴通常懸浮在不相溶的油中。開放式單板配置系統(tǒng)可在同時兼容驅(qū)動電極和接地電極的單層基板上處理液滴。然而，POC免疫診斷最常使用的是封閉的雙板系統(tǒng)以方便裝置操控和減少液體蒸發(fā)。盡管Srinivasan早在2004年就首次證明了數(shù)字化微流體與體液（包括全血）的兼容性，但數(shù)字化微流控在免疫診斷中的應(yīng)用最近才出現(xiàn)。Pamula研究組開發(fā)了一種可用于檢測胰島素和白細(xì)胞介素的微滴磁珠免疫檢測法，見圖2-8-3。

在這一方法中，樣本與偶聯(lián)捕獲抗體的磁珠、檢測抗體和封閉蛋白質(zhì)進(jìn)行數(shù)字化混合；然后，形成的抗原抗體復(fù)合物隨后用磁鐵吸附，經(jīng)洗滌和重懸后，利用堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。這一數(shù)字化微流控平臺亦已應(yīng)用于全血中肌鈣蛋白I的測定，該檢測可在8min內(nèi)完成。基于其優(yōu)越的液流控制性能，該體系可實現(xiàn)40個循環(huán)的PCR檢測，這在其他研究組中也得到了證實。

數(shù)字化微流控的主要優(yōu)點有：使用模塊化和可擴展的印制電路板來替代復(fù)雜的通道網(wǎng)絡(luò)；固態(tài)兼容（如需進(jìn)行全血檢測時）及上樣量靈活。總的來說，該技術(shù)解決了便攜、經(jīng)濟的POC免疫診斷平臺中難以兼容的復(fù)雜的液流控制問題。然而，數(shù)字化微流控仍處于起步階段，非特異性結(jié)合和絕緣體電極表面積垢等問題依然存在。

Delamarche及其在IBM的同事開發(fā)了一種基于毛細(xì)管力填充的硅毛細(xì)管系統(tǒng)的自主被動微芯片流體控制系統(tǒng)。該整合微流控體系包括充液港、微通道和被動“毛細(xì)管泵”出口。“毛細(xì)管泵”出口包含多個分支通道以增加表面積并促進(jìn)流體蒸發(fā)，這有助于基于毛細(xì)管作用的液流填充。交互式流體控制可通過冷卻Peltier元件控制液流蒸發(fā)速率來實現(xiàn)。用于免疫檢測的生物功能化修飾在一個附著于硅毛細(xì)管的獨立PDMS聚二甲硅氧烷底物上進(jìn)行。該研究組證實該體系能在次微升體積中檢測出皮摩爾級別的細(xì)胞因子TNF-α。早期的檢測是手工依次把分析物和檢測抗體加入進(jìn)樣口，該研究組隨后專注于全自動一步法免疫檢測的研發(fā)。最終實現(xiàn)了通過一個包含有樣本收集器、延遲閥、阻流器、反應(yīng)室和硅毛細(xì)管的無源裝置，在5min內(nèi)完成5μl血清樣本中CRP的檢測，且檢出限可達(dá)1ng/ml。在最新研發(fā)出來的多功能六通道一步法免疫檢測平臺，還可以調(diào)節(jié)和優(yōu)化樣本流速、上樣體積及檢測抗體的濃度。而眾多研究團隊的研究表明，樣本流速和檢測抗體的濃度及分布是芯片式免疫檢測獲得高靈敏度的關(guān)鍵。在被動式硅毛細(xì)管平臺中，可以通過可控的試劑積分器對試劑進(jìn)行程序式分配來優(yōu)化試劑的投放。

盡管上述被動式一步法硅毛細(xì)管系統(tǒng)兼顧了性能卓越、成本低和操作簡便的優(yōu)點，但它們需要一個加濕器以確保流速穩(wěn)定，這限制了其在POC中的應(yīng)用。

（二）經(jīng)濟落后地區(qū)的微流控

目前，人們正致力于提升資源配置相對匱乏的發(fā)展中國家的免疫診斷能力。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的規(guī)定并遵循ASSURED標(biāo)準(zhǔn)，為有需要的地區(qū)提供經(jīng)濟適用、敏感性高、特異性好、操作簡便、穩(wěn)定、無設(shè)備要求以及便于運輸或攜帶的理想診斷測試。而微流控具備上述技術(shù)要求，有望在實現(xiàn)這一目標(biāo)中發(fā)揮重要作用。

最近一項從傳統(tǒng)的芯片實驗室（LOC）技術(shù)轉(zhuǎn)向紙上芯片實驗室系統(tǒng)的研究，部分解決了資源貧乏地區(qū)免疫診斷測試的大部分要求。如上所述，基于微芯片的微流控可以為POC免疫診斷提供各種復(fù)雜的解決方案，但不一定成本低或無需輔助設(shè)備。另一方面，側(cè)向?qū)恿餮b置雖然易于操作、成本低且獨立包裝使用，但不能定量。紙上實驗室技術(shù)是通過在紙這種低成本的一次性介質(zhì)刻畫圖案，形成實際的微流體通道來克服側(cè)向?qū)恿飨到y(tǒng)的性能限制。

2007年，Whitesides研究組首次展示了基于SU-8的等離子體處理紙的圖案。這一理念通過同時檢測尿液中葡萄糖和蛋白質(zhì)時顏色的變化進(jìn)行驗證。這種光刻圖案化方法已被改進(jìn)為與印刷掩模兼容的快速模型制作方法。其功能進(jìn)一步增強，主要表現(xiàn)為垂直堆疊的紙層能使樣本分布在試劑點陣列上，可同時檢測多種分析物，以及可編程3D系統(tǒng)來實現(xiàn)特定應(yīng)用程序的重新構(gòu)建。雖然上述系統(tǒng)仍需要每步手工加入試劑，但Yager研究組已研發(fā)出了一種紙芯片系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于可溶的海藻糖屏障可自動運送和加入多種試劑。在這一問題上，最近有研究展示了用一個96區(qū)的紙盤進(jìn)行血清HIV檢測的ELISA技術(shù)。在這項研究中，人抗HIV-1抗體被包被的HIV-1抗原捕獲，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG二抗進(jìn)行顯色，最后用臺式掃描儀進(jìn)行比色檢測。除了這種基于反射比色法的檢測之外，還包括吸光度、熒光強度和電化學(xué)發(fā)光的檢測，這些檢測均可通過紙芯片實驗室系統(tǒng)實現(xiàn)。值得關(guān)注的是，一個美國財團已經(jīng)嘗試將柔性電子元件的LED陣列、光探測器和晶體管與紙基微流控技術(shù)進(jìn)行整合，該財團包括美國全民診斷公司、伊利諾伊大學(xué)香檳分校和電子初創(chuàng)公司MC10。

結(jié)合上述的某些改進(jìn)技術(shù)并輔以相應(yīng)的附加組件，就能用來解決微流控免疫診斷技術(shù)在發(fā)展中國家資源貧乏地區(qū)的使用問題。例如，Linder及其同事開發(fā)了一種在常規(guī)聚乙烯管中放置一系列液體試劑接口的方法，這如同ELISA檢測時一樣。在進(jìn)行測定時，聚乙烯管連接于微芯片入口，在芯片出口處施以負(fù)壓，通過接口即可逐個吸入試劑。將該方法應(yīng)用在附著于聚苯乙烯底物的PDMS微芯片上，利用熒光顯微鏡，可在13min內(nèi)完成血清HIV檢測，其靈敏度可達(dá)到納摩爾級。盡管這些試劑在常溫儲存和運輸過程中是穩(wěn)定的，人們?nèi)栽谂ψC明這種方法在發(fā)展中國家現(xiàn)場檢測的有效性。Yager及其同事已經(jīng)開發(fā)出了一種用于流式免疫檢測系統(tǒng)中的檢測抗體和捕獲抗體的干試劑儲存模式，以便在發(fā)展中國家使用。在芯片外制備了聚酯（檢測抗體）和硝酸纖維素（捕獲抗體）上的試劑干片，并在組裝包含多層聚脂薄膜和PMMA的檢測卡時插入。利用外部注射泵驅(qū)動液體，用平板掃描儀可在9min內(nèi)完成血清中瘧疾的檢測，其靈敏度達(dá)到次納摩爾級。

在臨床實驗室中，通常將全血離心獲取血漿用于分析。對于微流控體系，目前已有多種不同的血液過濾方法。為滿足資源貧乏地區(qū)的特殊要求，人們開發(fā)了手動攪拌器樣的裝置進(jìn)行全血分離。將全血樣本加到聚乙烯管中，并在攪拌器樣裝置上手動旋轉(zhuǎn)5min以分離出血漿，通過這種方法能從100μl全血中分離出約40μl血漿。這種低科技的樣本預(yù)處理方法已經(jīng)得到了驗證，適用于紙基微流控膽固醇的測定，理論上來說，同樣適用于免疫檢測。

最近，人們開發(fā)出了全血兼容的自供電集成微流控血液分析系統(tǒng)（self-powered integrated microfluidic blood analysis system，SIMBAS），見圖2-8-4。

值得注意的是，這種帶有基于物質(zhì)沉降血液過濾的被動一步法系統(tǒng)，不需要手工制備樣本或額外的流體控制設(shè)備，但它依賴于真空PDMS芯片中的負(fù)壓驅(qū)動來被動填充液體試劑（如存儲在干燥的真空袋中）。已經(jīng)證實，利用標(biāo)記的生物素-抗生物素蛋白方法，通過熒光掃描儀即可檢測5μl全血中的物質(zhì)，其靈敏度可達(dá)皮摩爾及以下水平。為實現(xiàn)低配條件下的檢測結(jié)果掃描分析，Whitesides及其同事開發(fā)了一種基于常用的可拍照手機的遠(yuǎn)程分析方法。檢測人員通過手機拍照，將芯片試驗的比色結(jié)果數(shù)字化，并將數(shù)字信息傳輸給經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)醫(yī)療人員進(jìn)行非現(xiàn)場分析。盡管這種方法非常適合偏遠(yuǎn)環(huán)境，但由于照相手機和環(huán)境條件所導(dǎo)致的圖像質(zhì)量差異，使得該方法仍存在技術(shù)缺陷。只有克服了上述技術(shù)難點，基于微流控的免疫診斷技術(shù)才能在POC領(lǐng)域，包括發(fā)展中國家的資源匱乏地區(qū)大放異彩。

五、商業(yè)化微流控免疫診斷

POC設(shè)備和基于免疫檢測的診斷產(chǎn)品的關(guān)鍵成功因素在本手冊的其他地方有所描述。雖然側(cè)向?qū)恿鱋TC妊娠檢測已取得商業(yè)化成功，但基于微流控的免疫診斷產(chǎn)品的商業(yè)化卻受到一定限制，見表2-8-6。微流控的診斷產(chǎn)品之所以稀缺，一部分原因是這種復(fù)雜但低成本的微芯片在準(zhǔn)確度和精確性上難以達(dá)到市場和監(jiān)管體系的認(rèn)可。監(jiān)管方面，在美國基于微流控免疫診斷法與傳統(tǒng)的基于免疫檢測的測試受相同的法規(guī)約束；再者，還得考慮POC應(yīng)用，最好是實現(xiàn)臨床實驗室改進(jìn)修正案（CLIA）豁免，證明該測試是“非專業(yè)用戶可以輕松操作”，并且錯誤風(fēng)險較低。而且，該方法要求精密度好、配置高，能提供具有防止故障發(fā)生的用戶界面，這對商業(yè)系統(tǒng)的設(shè)計和開發(fā)提出了很高的要求。目前有幾個這樣的系統(tǒng)正在開發(fā)中，但監(jiān)管許可和市場接受程度遠(yuǎn)比預(yù)期的要慢。

最成功的商業(yè)微流控診斷設(shè)備之一是雅培的手持式i-STAT?系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于硅片上的電化學(xué)檢測，可為實驗室提供實時的檢測結(jié)果。目前使用最廣泛的測試卡是CHEM8+，它能利用幾滴全血在2min內(nèi)提供8種代謝項目，包括鈣離子和血細(xì)胞比容的結(jié)果。還有已通過FDA510（k）批準(zhǔn)的用于血液學(xué)、血氣、凝血和心臟標(biāo)志物免疫測定的測定卡，但目前只有CHEM8+為CLIA豁免。

拜耳公司的A1cNow+?是一種手持式家用型HbA1c免疫檢測設(shè)備。HbA1c是評價糖尿病患者長期血糖控制的重要指標(biāo)。該CLIA免檢設(shè)備包括微流控和橫側(cè)向?qū)恿鹘M件及機載熒光檢測。Alere TRIAGE?是美艾利爾公司生產(chǎn)的一種便攜式熒光測定儀，可檢測肌紅蛋白、CK-MB和肌鈣蛋白I（TnI）等心肌損傷標(biāo)志物以及D-二聚體和BNP。同樣也是全血加樣，樣本通過毛細(xì)管作用被動吸入通道，通過熒光讀數(shù)，在15min內(nèi)可獲得定量結(jié)果。該系統(tǒng)還可用于尿液樣本中某些藥物的定性篩查（見“Triage”相關(guān)內(nèi)容（該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注））。

Biacore? X100及T200系統(tǒng)是一種無標(biāo)記的SPR技術(shù)，該510（k）批準(zhǔn)的系統(tǒng)旨在作為開發(fā)平臺，用于實現(xiàn)定制化檢測，是一種使用注射泵驅(qū)動液流的一次性多通道微流控技術(shù)。

已被510（k）批準(zhǔn)的美克羅尼公司的ABORhCard?，可同時定性檢測個體的ABO血型和Rh因子。該檢測卡單個測試一次性包裝、信用卡大小，通過檢測手指末梢血，幾分鐘內(nèi)便可目測結(jié)果。索尼公司最近已將這種微流控驅(qū)動技術(shù)收購，以尋求在醫(yī)療和保健領(lǐng)域的多元化發(fā)展。

日本W(wǎng)ako公司的i30?微流控免疫分析儀已被510（k）批準(zhǔn)生產(chǎn)，該免疫分析儀整合了復(fù)雜的微流控技術(shù)、電泳技術(shù)以及免疫化學(xué)檢測技術(shù)來檢測肝癌風(fēng)險標(biāo)志物甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）和脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）。該檢測卡可以并行分析多達(dá)6種標(biāo)志物，最快可在10min內(nèi)出結(jié)果。

美艾利爾TRIAGE?檢測系統(tǒng)最近正式推出新一代CE認(rèn)證的心臟標(biāo)志物檢測卡，包括單通道高敏TnI，雙通道TnI和BNP（Cardio2）以及三通道TnI、BNP和CK-MB（Cardio3）。通過提高TnI檢測靈敏度，這些檢測卡可測量出99%人群的TnI濃度，幫助急診科更早地診斷急性心肌梗死并改善患者預(yù)后。卡拉洛斯診斷公司生產(chǎn)的PSA檢測儀最近通過了CE認(rèn)證，它基于微流體芯片技術(shù)，是一款信用卡大小、小型銀標(biāo)記的高靈敏度分析儀，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)從手指末梢的全血樣本中得到定量檢測結(jié)果，見圖2-8-5。

除了上述市場上已在使用的診斷產(chǎn)品外，還有大量非常有前景的處于開發(fā)階段的免疫診斷設(shè)備。特別是，目前正在從傳統(tǒng)的外置讀卡器發(fā)展為完全集成的一次性檢測卡系統(tǒng)，從而無需額外儀器，并且用戶操作也更為簡單。MycroLab公司的Mycro?Check檢測系統(tǒng)就是基于一次性的Mycro?Card卡，該卡包括先進(jìn)的微流控裝置、電子設(shè)備和顯示屏。Molecular Vision的BioLED?平臺將有機發(fā)光半導(dǎo)體（OLED）和有機光電探測器（OPV）與注塑成型的微流控芯片相結(jié)合，形成了低成本和完全一次性的POCT免疫診斷產(chǎn)品。

六、芯片、免疫檢測和蛋白質(zhì)組學(xué)

1961年，F(xiàn)einberg首次報道了生物分析芯片的使用。該技術(shù)先將瓊脂薄膜浸入自身免疫性甲狀腺病患者的血清中，再將幾微升甲狀腺球蛋白抗原點在該膜表面，如果觀察到免疫沉淀反應(yīng)，即表明甲狀腺球蛋白和患者血清中的抗體發(fā)生反應(yīng)。醋酸纖維素膜條的出現(xiàn)使該技術(shù)得以改進(jìn)，但直到幾十年后，Ekins及其同事才進(jìn)一步發(fā)展了這一概念，推導(dǎo)出了環(huán)境分析物理論，并基于微型化可增加檢測靈敏度的理念，證明了多點和多分析物免疫檢測的高靈敏度。這是第一個真正意義上的抗體芯片，并顯示小型化多重免疫檢測可能對臨床診斷產(chǎn)生重大影響。然而，芯片技術(shù)首次取得重大進(jìn)展是在基因組學(xué)領(lǐng)域，伴隨高精度液體處理機器人技術(shù)和光學(xué)掃描儀的出現(xiàn)。隨著人類基因組測序的完成，高通量DNA芯片、mRNA表達(dá)譜以及單核苷酸多態(tài)性分析得到了進(jìn)一步發(fā)展。就生化和診斷效用而言，由于蛋白質(zhì)翻譯和降解速率上的差異，mRNA水平的變化并不一定與蛋白質(zhì)水平的變化成比例。此外，核酸檢測并不能反映蛋白質(zhì)翻譯后修飾，而這種修飾對蛋白質(zhì)功能是至關(guān)重要的，且一個基因可以編碼多種不同的蛋白質(zhì)。由于控制細(xì)胞活性的是蛋白質(zhì)而非mRNA，因此鑒定蛋白質(zhì)本身就很重要。由于大部分技術(shù)來源于早期基因組芯片，在過去十年中，蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)得到了很到的發(fā)展。由于人類蛋白質(zhì)的數(shù)量比24 000個蛋白質(zhì)編碼基因大一個數(shù)量級，可能多達(dá)106個蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員的任務(wù)是相當(dāng)艱巨的。微陣列能夠在單個實驗中檢測數(shù)百或數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)，可成為解決該問題的有力工具。此外，芯片技術(shù)還可廣泛用于各種應(yīng)用，包括藥物開發(fā)和分類、生物標(biāo)志物檢測、患者疾病的診斷及療效監(jiān)測等。由于通常是低豐度蛋白質(zhì)提供最重要的生物信息，因此更需要高靈敏度、特異性和高通量測試平臺，用于對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測以及進(jìn)行健康與疾病的差異分析。

（一）芯片模式

芯片的基本概念是在可定義的位置（通過空間位置或光學(xué)識別）使用包被的捕獲分子特異地結(jié)合單個分析物，若存在不同的捕獲分子，則可同時檢測復(fù)雜混合物中的多種成分。在過去的十年中，人們設(shè)計了各種各樣的陣列模式。陣列通常可分為兩類：正相蛋白微陣列（forward-phase protein microarrays，F(xiàn)PPMs）（進(jìn)一步分為分析抗體陣列和功能蛋白陣列）和反相蛋白微陣列（reverse-phase protein microarrays，RPPMs），見圖2-8-6。

在一種形式中，分析抗體微陣列作為經(jīng)典的兩位點非競爭性免疫檢測法的微型版本，通過固定在載玻片上的抗體陣列文庫來捕獲樣本溶液中的靶蛋白，隨后使用針對該蛋白質(zhì)上的不同抗原決定簇的標(biāo)記二抗檢測靶蛋白。標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法包括熒光法、化學(xué)發(fā)光法和比色法。這種微陣列通常用于分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，以測定單個樣本內(nèi)的結(jié)合親和力、特異性和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。抗體微陣列是分析微陣列中最為常見的形式。該技術(shù)似乎對具有高質(zhì)量抗體、特征已明確的蛋白質(zhì)更為有效，但通常情況并非如此。為了避免對每個目的蛋白質(zhì)都需要匹配抗體對，可以選擇在與捕獲抗體一起孵育之前，簡單地標(biāo)記（如熒光素標(biāo)記）樣本中的所有蛋白質(zhì)，通過這種方法可以直接比較兩個樣本。該方法的缺點是對樣本中低豐度蛋白質(zhì)通常難以高效標(biāo)記，并且可能由于單一抗體的交叉反應(yīng)性而使特異性降低。

不同于分析芯片，功能蛋白質(zhì)芯片是由單個、全長功能蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域制備的，用于研究整個蛋白質(zhì)組的更廣泛的蛋白結(jié)合事件。功能蛋白質(zhì)芯片可以研究不同形式的蛋白質(zhì)相互作用，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、蛋白質(zhì)-磷脂和蛋白質(zhì)-小分子。

反相（間接）芯片是將包含復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的樣本固定在芯片上，用標(biāo)記的特異性抗體檢測樣本中的靶蛋白。該技術(shù)可避免每種靶蛋白需要兩種高親和力和高特異性抗體的問題。將含有復(fù)雜蛋白質(zhì)成分的組織或細(xì)胞裂解物或體液印跡在芯片上，每張芯片用不同的抗體探測。每張芯片可以固定多個不同的患者樣本或系列稀釋的樣品。該技術(shù)非常適合于在臨床研究中大樣本受試者的篩查。

（二）芯片制造

對于核酸芯片，材料應(yīng)具有共同的化學(xué)特性，因此無論核酸序列如何，都可以使用通用的方法將其固定到芯片上。在蛋白質(zhì)芯片中，載玻片的表面性質(zhì)和固定方法會對蛋白質(zhì)的構(gòu)象、功能和穩(wěn)定性產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。因此，為了在保持蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能的同時，使結(jié)合能力最大化，人們嘗試了許多不同的技術(shù)。隨著用于DNA陣列的設(shè)備能夠適用于蛋白質(zhì)芯片，人們在啟用自動打印機和激光掃描儀之后選擇顯微鏡載玻片作為載體。在此之前，人們嘗試了聚偏氟乙烯、硝化纖維素、聚苯乙烯、瓊脂糖、PDMS和醛基活化的普通玻璃等。這些方法和其他如包被多聚-L-賴氨酸或通過硅烷或環(huán)氧衍生物共價附著于玻璃表面的方法，均可使載玻片表面的蛋白質(zhì)產(chǎn)生一個隨機方向，在某些情況下，這會影響蛋白質(zhì)檢測。親和標(biāo)簽可以避免上述問題，在可重復(fù)的方向上提供穩(wěn)定的連接。典型的例子是在鎳表面使用6xHis標(biāo)簽、N端GST標(biāo)簽和麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)。

早期制作蛋白質(zhì)陣列的其他方法包括：在二氧化硅表面上吸附n-辛癸基三甲氧基硅烷的sSAM，二氧化硅預(yù)先用紫外光刻技術(shù)將其壓成微米大小的陣列；將RNA-蛋白質(zhì)融合雜交到一組表面結(jié)合的DNA捕獲探針上來實現(xiàn)自組裝；點在玻片、包被金的硅片或塑料表面（如聚苯乙烯）；電噴霧沉積于鍍鋁塑料上和固定在玻璃表面的聚丙烯酰胺凝膠小墊片（如100μm×100μm×20μm）內(nèi)。

為了將蛋白質(zhì)或抗體點在芯片上，人們使用了兩種機器人微陣列打印機：接觸型和非接觸型。接觸型打印機使用金屬針直接與載玻片接觸，在玻片上放置納升級的蛋白質(zhì)或抗體溶液，針的大小決定加樣體積。用實心針點陣需要在每次應(yīng)用后補充液體；使用帶有毛細(xì)管作用填充內(nèi)部儲層的空心針，可以在一次填充后進(jìn)行多次應(yīng)用，點樣的體積取決于接觸時間。非接觸型打印機通過傳統(tǒng)的噴墨式、壓電脈沖或電噴霧沉積釋放出定量液體。后一種打印機提供了更精確的流體輸送，從而改善了點與點之間的差異，盡管它們通常需要更大的樣本量，有時還可能會出現(xiàn)點樣位點錯誤。

現(xiàn)在許多商業(yè)組織提供用于打印陣列、執(zhí)行測試和光學(xué)測量的預(yù)制或定制陣列和自動化設(shè)備。例如，Aushon Biosystems（www.aushon.com）、Arrayit Corporation（www.arrayit.com）、Affymetrix（www.affymetrix.com）、Invitrogen Life Sciences（www.invitrogen.com）、GeSim（www.gesim.de）、Arrayjet（array-jet.co.uk）、RayBiotech（www.raybiotech.com）、R&D Systems（www.rndsystems.com）和Gentel Biosciences（www.gentelbio.com）等公司。

（三）自組裝的蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)或抗體芯片的一個重要問題是它們的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)尤其是抗體的穩(wěn)定性有很大的差異。含有成百上千個蛋白質(zhì)的微陣列極易受到單個和非可控條件下的蛋白質(zhì)降解的影響。相比之下，基于核酸的陣列非常穩(wěn)定。利用這一點，He和Taussig發(fā)明了一種蛋白質(zhì)原位陣列（protein in situ array，PISA），蛋白質(zhì)直接由DNA表達(dá)，并通過識別標(biāo)簽序列或?qū)⒔M氨酸標(biāo)記的新生蛋白質(zhì)結(jié)合而附著在鍍鎳陣列表面上。該方法通過將DNA模板包被于板上（而不是混懸于PISA溶液）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯得到了進(jìn)一步改進(jìn)。核酸編程蛋白質(zhì)芯片（nucleic acid programmable protein array）用生物素化cDNA質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)作為GST融合蛋白，與抗GST抗體一起印刷到抗生物素蛋白包被的載玻片上以捕獲蛋白質(zhì)。因此，表達(dá)的蛋白質(zhì)與cDNA一同固定在芯片上。在He和同事的另一個發(fā)明中，蛋白質(zhì)表達(dá)是在兩個載玻片之間的膜中進(jìn)行的，其中一個載玻片載有DNA，另一個載玻片載有試劑以捕獲翻譯后的蛋白質(zhì)。標(biāo)簽蛋白質(zhì)表達(dá)的同時即可轉(zhuǎn)移至第二載玻片進(jìn)行固定，形成的蛋白質(zhì)陣列是DNA陣列的鏡像。這種方法的優(yōu)點是所得到的蛋白質(zhì)陣列不含DNA，并且用以產(chǎn)生蛋白質(zhì)陣列的DNA陣列可以重復(fù)使用，有報道稱至少可以重復(fù)20次。

（四）芯片的抗體來源

從理論上講，針對每種人類蛋白質(zhì)的特異性抗體的研究，將勾畫出整個人類蛋白質(zhì)組學(xué)的輪廓。近年來也有一些倡議，建立一系列專業(yè)協(xié)作的組合聯(lián)盟，但是考慮到此工作的重要性和范圍，憑單個組織甚至國家之力難以承擔(dān)這份重?fù)?dān)。ProteomeBinders及其后續(xù)的AffinityProteome研究，集結(jié)了歐洲諸多組織的努力，包括Antibody Factory公司（德國，www.antibody-factory.org）、人類蛋白質(zhì)組學(xué)研究組織（www.hupo.org）、抗體資源數(shù)據(jù)庫（www.antibodypedia.org），旨在建立一個經(jīng)過驗證的人類蛋白質(zhì)抗體的綜合目錄。同樣，美國國家癌癥研究所已經(jīng)建立了臨床蛋白質(zhì)組學(xué)試劑資源庫，以開發(fā)針對腫瘤標(biāo)志物（特別是低豐度標(biāo)志物）的單克隆抗體。這些計劃前景可期，且在技術(shù)上可行，并具重大的科學(xué)和經(jīng)濟價值。

（五）檢測策略

蛋白質(zhì)芯片使用的檢測方法類似于常規(guī)免疫檢測方法中使用的檢測方法。在基于芯片的酶免疫檢測中，通過使用比色法、熒光測定法和化學(xué)發(fā)光信號檢測系統(tǒng)來檢測酶標(biāo)記物。

隨著最初用于cDNA和寡核苷酸分析的檢測和芯片激光掃描儀的普及，熒光標(biāo)記物如Cy3和Cy5染料在蛋白質(zhì)芯片標(biāo)記檢測中逐漸流行。Srivastava等人通過這一樣本直接檢測的常用技術(shù)比較了正常人和囊性纖維化患者混合血清的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，并在其中對這些染料的用途作了說明，見圖2-8-7。

由于半導(dǎo)體Q點（Q-dot）標(biāo)記具有更高的量子產(chǎn)量、抵抗光漂白和寬斯托克斯位移等優(yōu)點，因此也被應(yīng)用于蛋白質(zhì)芯片，與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記相比，它具有更高的信噪比。也有研究人員提出磁性納米標(biāo)簽也可作為多路復(fù)用蛋白質(zhì)陣列熒光標(biāo)簽的替代品，據(jù)報道其分析靈敏度可低至飛摩爾級。

通過應(yīng)用滾環(huán)擴增（rolling circle amplification）技術(shù)擴增出與檢測抗體共價連接的寡核苷酸引物，可提高芯片免疫檢測的靈敏度。該方法結(jié)合熒光檢測技術(shù)，可在芯片上以高靈敏度檢測出單個抗原-抗體復(fù)合物的信號（如可檢測出0.1pg/ml的PSA和1pg/ml的IgE）。該方法運用到在玻璃陣列上同時檢測75種細(xì)胞因子，其中45種細(xì)胞因子的靈敏度達(dá)到≤10pg/ml。另一種蛋白質(zhì)芯片中使用的信號放大技術(shù)是酪胺信號放大技術(shù)（tyramide signal amplification，也稱為催化報告沉積技術(shù)，catalyzed reporter deposition technique），它使用HRP標(biāo)簽來催化熒光酪胺衍生物轉(zhuǎn)化為能與探針上鄰近酪氨酸殘基相結(jié)合的活性中間體。

無論標(biāo)記的類型如何，依賴標(biāo)記的檢測的一個缺點是標(biāo)記本身有可能會改變與其連接的分子的結(jié)合特性。為了彌補這一缺陷，最近開發(fā)了許多無標(biāo)記檢測技術(shù)，這些技術(shù)增加了具有可以實時監(jiān)測蛋白質(zhì)芯片結(jié)合反應(yīng)動力學(xué)的優(yōu)點。表2-8-7總結(jié)了這些技術(shù)的例子。其中，SPR技術(shù)最受關(guān)注且技術(shù)成熟。其余的SPRi、碳納米線和碳納米管（CNT）以及干涉測量和橢圓偏振技術(shù)也引起了人們的極大關(guān)注，它們既具高靈敏度，又有高水平的復(fù)用能力，但這些目前仍處于研究階段。

質(zhì)譜（MS）技術(shù)也被應(yīng)用于芯片免疫檢測，并且作為生物標(biāo)志物開發(fā)項目的一部分，基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間（matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight，MALDITOF）質(zhì)譜和表面增強激光解吸/電離飛行時間（surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight，ELDI-TOF）質(zhì)譜的技術(shù)平臺已經(jīng)被研發(fā)出來。在這兩種方法中，待分析的蛋白質(zhì)與具有紫外吸收能力的化合物在陣列上共結(jié)晶，并通過脈沖紫外激光束蒸發(fā)。離子化的蛋白質(zhì)碎片隨后在電場中被加速并通過速度被鑒別，其速度由不同的質(zhì)/荷比表征。這兩種技術(shù)在樣本靶標(biāo)和分析儀設(shè)計的構(gòu)造上有所不同。這些方法為每個樣本提供蛋白質(zhì)分析譜，并已廣泛用于新的生物標(biāo)志物的尋找。但事實證明候選生物標(biāo)志物的鑒定和驗證更具挑戰(zhàn)性。新出現(xiàn)的一項MS技術(shù)在加速該過程中極具潛力。在三重四極桿質(zhì)譜儀上的多重反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)（multiple reaction monitoring-MS，MRM-MS）中，根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的質(zhì)/荷比來篩選目標(biāo)多肽離子，再對其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，以監(jiān)測所選片段。通過使用樣本中特征蛋白多肽合成的、穩(wěn)定的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物（穩(wěn)定同位素稀釋法，SIDMRM-MS），可以對測試進(jìn)行量化并提供近乎絕對的結(jié)構(gòu)特異性。復(fù)雜樣本（血清）和高豐度蛋白質(zhì)的存在會限制該方法的靈敏度，但可以通過免疫捕獲來彌補這個不足：抗肽抗體捕獲的穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)方法（stable isotope standards with capture by anti-peptide antibodies，SISCAPA?）是一種有效的傳統(tǒng)非競爭性免疫檢測（夾心）方法，用MS技術(shù)代替標(biāo)記抗體，其檢測能力達(dá)到低至納克每毫升的水平，且CV＜20%。

（六）基于微球的芯片

在平面芯片中，是依據(jù)分析物在芯片中的空間位置來識別分析物。而在基于微球的芯片中，試劑耦合至不同的微球集合，每個微球集合可通過其顏色、大小、形狀或其他編碼因素來識別。這種試劑特異的微米大小的微球混合在一起可以提供多重分析，并可通過類似于常規(guī)非競爭性免疫檢測的方法與樣本進(jìn)行孵育。其檢測原理是通過使用熒光標(biāo)記抗體或熒光標(biāo)記鏈霉抗生物素蛋白和生物素標(biāo)記的抗體來分析每一個分析物。洗滌后，通過流式細(xì)胞儀對微球懸液進(jìn)行處理，來識別微珠并測量結(jié)合的免疫復(fù)合物的熒光。基于微球的芯片的檢測方法穩(wěn)定、靈活，且可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室液流處理系統(tǒng)來輕松地實現(xiàn)自動化，從而提供與傳統(tǒng)ELISA相當(dāng)?shù)男阅堋?/p>

最普遍的基于微球的平臺是Luminex公司的xMAP技術(shù)，它使用100個不同顏色編碼的5.6μm直徑的微球結(jié)合，以及一種可測量兩個波長熒光的儀器。這種儀器首先識別出每一個微球來自哪個微珠集合，其次對結(jié)合的免疫復(fù)合物進(jìn)行定量分析。這種開放式體系結(jié)構(gòu)系統(tǒng)允許研究人員建立自己的多重分析方法，也可以從Luminex或其合作伙伴處選擇各種商品化試劑盒（www.luminexcorp.com）。此外，在Luminex升級系統(tǒng)中，F(xiàn)LEXMAP 3D?系統(tǒng)可擴展至500種微球集合，以及MAGPIX?系統(tǒng)外形小巧緊湊，使用LED和CCD攝像取代流式細(xì)胞系統(tǒng)的激光和光電倍增管，來檢測編碼磁珠的熒光圖像（參見本部分第七節(jié)“基于微球的多重免疫分析：Luminex?xMAP?技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用”）

其他基于微球的系統(tǒng)有：來自BD生物科學(xué)公司的細(xì)胞微球陣列（cytometric bead array，CBA）（www.bdbiosciences.com），它使用30種不同光譜識別微球集合；eBioscience公司生產(chǎn)的FlowCytomixTM多重免疫檢測試劑盒，它能夠通過大小和染色強度同時區(qū)分20種微球集合；Enzo生命科學(xué)公司也有類似的MultiBeadTM免疫檢測試劑盒（www.enzolifesciences.com）。

此外，來自Immucor的BioArray Solutions BeadChip?系統(tǒng)使用光譜可區(qū)分的微球，但在測試前，微球混合物以單分子層固定在硅片上，檢測結(jié)束時去除未結(jié)合的檢測交聯(lián)物，再在專業(yè)成像系統(tǒng)上讀取芯片結(jié)果（www.immucor.com/bioarray/）。Illumina的BeadX-PressTM和VeracodeTM技術(shù)使用全息圖形編碼圓柱形玻璃微球（長240μm，直徑28μm）作為其多重分析系統(tǒng)的固相，通過讀取板槽中收集的微球編碼來鑒定結(jié)合在微球上免疫復(fù)合物的種類和檢測熒光強度（www.illumina.com）。盡管這些技術(shù)最初是為了DNA分析而開發(fā)，但I(xiàn)llumina可為用戶提供羧基化玻璃微球以開發(fā)他們自己所需的免疫檢測方法。

微球芯片和平面芯片的相對優(yōu)勢已在業(yè)界引起爭論，支持平面芯片的一方聲稱其具有更強的多重分析能力（單張芯片可進(jìn)行幾萬項測試）、易于操作、非特異性結(jié)合低、實驗室設(shè)備常規(guī)化，以及可使用不同標(biāo)記物或無標(biāo)記檢測。而微球芯片在其多重分析能力可能性上更為有限，在測試特異性成為問題之前，測試混合物中的50種分析物的實際范圍是有限的，但它們能夠?qū)γ糠N微球進(jìn)行獨立的質(zhì)量控制，因此更符合FDA批準(zhǔn)用于臨床診斷的驗證和確認(rèn)要求。

（七）應(yīng)用

自從高密度蛋白質(zhì)或抗體芯片的操作版本首次被引入使用以來，它們已經(jīng)成為蛋白質(zhì)表達(dá)譜、生物標(biāo)志物篩選、疾病譜、抗體特征、臨床診斷的可靠和穩(wěn)定平臺，并已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具。

蛋白質(zhì)芯片可以對少量樣本中的數(shù)百種蛋白質(zhì)進(jìn)行平行量化分析，使研究者可以同時比較某種疾病患者和對照患者之間的濃度模式。大多數(shù)疾病特異性蛋白質(zhì)組學(xué)研究都是從癌癥患者的樣本中進(jìn)行的。例如，2005年Gao等在肺癌的研究中使用一個84種抗體陣列來探討肺癌患者和對照組之間的區(qū)別。2006年Sebastiani研究組在乳腺癌研究中使用149個癌樣本檢測8個蛋白質(zhì)與存活的相關(guān)性。在2008年另一項乳腺癌研究中，Sauer等利用54種蛋白質(zhì)篩選，發(fā)現(xiàn)其中5種蛋白質(zhì)標(biāo)志物組合可以對乳腺癌患者進(jìn)行分型鑒定。2008年Linkov 等人應(yīng)用19種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的血漿蛋白組合模式篩選出其中5種蛋白質(zhì)可用于鑒別甲狀腺惡性和良性疾病。2006年Sanchez-Carbayo等使用含有254種不同抗體的抗體芯片對膀胱癌患者與對照進(jìn)行區(qū)分，其檢出率可達(dá)94%。也有許多關(guān)于卵巢癌患者的研究，包括磷酸化抗體的研究和應(yīng)用6-plex試驗在156名新診斷的卵巢癌患者和362名健康受試者中驗證其篩選效率，結(jié)果顯示6-plex對卵巢癌的診斷敏感性為95.3%，特異性為99.4%。Hudson等人的一項研究，使用了一個含5 005種蛋白質(zhì)的芯片來識別自身抗體譜，該抗體譜能夠識別卵巢癌患者血清中的94種抗原，選取篩選出的其中兩種抗原聯(lián)合應(yīng)用比單獨使用CA125鑒定卵巢癌的效果更好。隨著芯片研究的深入，其在前列腺癌中的應(yīng)用也受到越來越多的關(guān)注，包括應(yīng)用反相蛋白陣列來隨訪疾病進(jìn)展；Miller等利用一個包含184種抗體的芯片檢測了33個前列腺癌患者和20個對照組血清，在這兩組人群中鑒定出5種顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。另有Shafer等人的研究表明，血小板反應(yīng)蛋白-1可以區(qū)分良性和惡性前列腺疾病，但該蛋白質(zhì)與PSA無關(guān)。

其他臨床應(yīng)用實例還包括在400例暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征的血清樣本中，使用含有82種蛋白質(zhì)的冠狀病毒蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行的研究，以證明蛋白質(zhì)芯片可用于大規(guī)模地鑒定血清中的病毒特異性抗體；Bozza等利用蛋白質(zhì)芯片評估了17種細(xì)胞因子作為膿毒血癥特異性生物標(biāo)志物，以確定其與器官功能障礙相關(guān)的生物標(biāo)志物。

許多商業(yè)化芯片產(chǎn)品現(xiàn)在可供科研使用，包括蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片，如細(xì)胞因子、趨化因子、腫瘤標(biāo)志物和生長因子等。表2-8-8列出了可供研究使用的商用平面芯片系統(tǒng)的示例。

基于微球的系統(tǒng)主流產(chǎn)品是Luminex公司的xMAP和MAGPIX系統(tǒng)，為了滿足科研需求，Luminex及其合作伙伴（Millipore、R&D Systems、Bio-Rad、Invitrogen、Innogenetics、Inverness Medical、Rules-based Medicine、Affymetrix和Zeus Scientific）還可提供大量的測試項目組合，覆蓋自身免疫性疾病、心臟標(biāo)志物、炎性疾病、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號、細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子、內(nèi)分泌、代謝標(biāo)志物和神經(jīng)生物學(xué)等。其他基于微珠系統(tǒng)的商品化科研產(chǎn)品包括BD生物科學(xué)CBA系統(tǒng)的黏附分子、細(xì)胞因子、趨化因子；eBiosciences FlowCytomix系統(tǒng)的黏附分子、細(xì)胞因子、趨化因子、心血管標(biāo)志物和肥胖相關(guān)標(biāo)志物；以及Enzo Life Science MultiBeadTM系統(tǒng)的細(xì)胞因子和定制組合項目。

FDA認(rèn)證或歐洲CE標(biāo)識的多重分析芯片產(chǎn)品更加有限，迄今為止僅限于單個測試項目獲得認(rèn)證的多分析物測試組合。Luminex多重分析系統(tǒng)主要應(yīng)用于通過較少檢測項目即可診斷的臨床疾病，目前可用于臨床檢測的產(chǎn)品列表即反映了這一點，主要以全身免疫性疾病和傳染性疾病的診斷應(yīng)用為主（表2-8-9）。

（八）芯片在臨床診斷中的應(yīng)用展望

芯片能同時分析成百上千種蛋白質(zhì)間的相互作用，理論上可有力推進(jìn)生物標(biāo)志物探索項目的開發(fā)，但目前收效甚微。在過去的15年中，新型蛋白質(zhì)分析物引入常規(guī)臨床使用的轉(zhuǎn)化率每年平均僅有1.5項。研究人員認(rèn)為，造成上述困境的原因是缺乏高效的大樣本驗證技術(shù)平臺、臨床樣本獲取受限，以及缺乏明確且連貫的生物標(biāo)志物開發(fā)流程等。另一種觀點認(rèn)為，臨床實驗室缺乏新產(chǎn)品也反映出行業(yè)風(fēng)險規(guī)避、學(xué)術(shù)界專注于科學(xué)新發(fā)現(xiàn)，以及研究人員對滿足監(jiān)管機構(gòu)要求的高標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性缺乏理解。后面的觀點已被蛋白質(zhì)組學(xué)研究界廣泛接受，為了縮短候選生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用的流程，人們已經(jīng)采取了一些舉措來消除轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究人員需要驗證基于蛋白質(zhì)多重分析的特定分析測量標(biāo)準(zhǔn)的不確定性。在此背景下，美國國家癌癥研究所的癌癥臨床蛋白質(zhì)組學(xué)倡議（NCI-CPTC，proteomics.cancer.gov）提出了生物標(biāo)志物臨床前驗證階段的新途徑，與臨床實驗室組織合作制定共同的標(biāo)準(zhǔn)，并與FDA密切合作，使蛋白質(zhì)組學(xué)研究界理解評估要求的注意事項。作為這一過程的一部分，NCI-CPTC成員準(zhǔn)備了兩份模擬的送審前的蛋白質(zhì)多重測定說明，提交給美國FDA體外診斷設(shè)備評估和安全性辦公室，以獲得反饋。辦公室給出的指導(dǎo)意見包括需要充分注意對可能影響檢測穩(wěn)定性和可靠性的潛在失效模式的理解，并在驗證過程中相對于樣本收集和測試，需要充分注意選擇適當(dāng)?shù)念A(yù)期用途群體。

從單個樣本獲得的多個測試結(jié)果的可用性在質(zhì)量控制方面提出了新的挑戰(zhàn)，無論這些結(jié)果是單獨報告的，還是作為多變量指標(biāo)檢測（multivariate index assay，IVDMIA）輸入到算法中生成單個結(jié)果。一張芯片可以提供數(shù)百乃至數(shù)千種分析物的結(jié)果，但是傳統(tǒng)實驗室通過監(jiān)控高、中、低分析物水平的質(zhì)控性能作為日常質(zhì)量控制的方案就變得不切實際，特別是對于平面芯片。多重分析項目數(shù)越多，問題就越嚴(yán)重。如果一種（或多種）分析物的響應(yīng)超出預(yù)期范圍，則必須考慮其他分析物的所得結(jié)果要如何處理。對于一些需發(fā)布（或不需發(fā)布）或沒有被要求提交的結(jié)果還存在一些爭議，這些結(jié)果包括商業(yè)、倫理和法律問題，所有這些都需要在測試項目上市前得到解決。這些問題更多地局限于基于微球的芯片，尤其是通量小的多重分析芯片。因此，目前FDA認(rèn)證的基于微球的測試項目主要為自身免疫和感染性疾病。更高通道數(shù)的多重分析芯片目前僅限于實驗室開發(fā)測試（laboratory developed tests，LDT），而不是FDA許可的廣泛使用項目，如Rules Base Medicine公司生產(chǎn)的VeriPsych試劑盒，其通過測定51個蛋白質(zhì)標(biāo)志物組合來輔助診斷精神分裂癥。

對新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，其中每種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)都可能發(fā)揮作用，沒有任何一項技術(shù)可以提供高水平的多重分析、高靈敏度、高特異性，并具有可與當(dāng)今臨床實驗室分析儀相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和可靠性。很可能，免疫親和/質(zhì)譜和抗體芯片技術(shù)的結(jié)合將為結(jié)構(gòu)化生物標(biāo)志物的研發(fā)提供相關(guān)工具。

在臨床應(yīng)用方面，現(xiàn)在有機會利用多重分析蛋白質(zhì)通路，結(jié)合相關(guān)的解釋算法，可以為患者提供特異性基線，從而使醫(yī)療狀況的監(jiān)測可以真正實現(xiàn)個性化，而不是通過與基于人群的參考區(qū)間進(jìn)行比較。這種方法可以檢測樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的微小變化，從而早期發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的病變。考慮到芯片與現(xiàn)有實驗室分析儀競爭的可能性，現(xiàn)有的檢測系統(tǒng)可以通過要求按順序進(jìn)行測試的一個樣本進(jìn)行進(jìn)一步的測試，從而輕松地提高通量。除非多重分析系統(tǒng)能夠獲得更多收益，如IVDMIA預(yù)期的那樣或樣本量非常有限，否則診斷公司不太可能在開發(fā)新的多重分析系統(tǒng)方面投入大量資金。

七、結(jié)論

本節(jié)闡述了為實現(xiàn)免疫檢測小型化目標(biāo)所做的大量研究工作，以及所取得的成果，特別是已經(jīng)應(yīng)用于解決所面臨的各種挑戰(zhàn)的創(chuàng)新性分析技術(shù)。然而，最終的成功和真正衡量創(chuàng)新的標(biāo)準(zhǔn)取決于應(yīng)用領(lǐng)域?qū)夹g(shù)的采用程度、明確需要所解決的問題，以及終端用戶組織采用該解決方案的能力。目前，在研究領(lǐng)域中LOC概念的采用程度要高于其他任何領(lǐng)域。雖然前面的討論強調(diào)的是臨床診斷應(yīng)用，但是LOC和POC測試在其他領(lǐng)域如環(huán)境、食品和材料鑒別檢測中也有應(yīng)用潛能。快速、簡易和便攜是檢測儀器的理想屬性，而經(jīng)濟和環(huán)境問題同樣需要考慮。毫無疑問，這些是實現(xiàn)應(yīng)用最大化的關(guān)鍵。然而，POCT檢測的經(jīng)驗表明（見第五部分第三節(jié)“即時檢測（床旁檢測）”部分），這些新技術(shù)采用的速度很慢，且在醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)中采用新技術(shù)存在某些障礙。關(guān)鍵障礙之一是對新技術(shù)應(yīng)用尚未滿足的需求認(rèn)識不足。雖然分析設(shè)備理論上應(yīng)該解決未滿足的需求，但在臨床診斷中存在明顯過度需求，這可能與醫(yī)療付費業(yè)務(wù)模式的主導(dǎo)有關(guān)。

此外，從中心實驗室分析技術(shù)的演變中可以吸取到許多教訓(xùn)，早期通過開發(fā)“多通道分析儀”來擴大檢測“范圍”，廣泛采用該技術(shù)的結(jié)果表明，患者往往在接受與其病情無關(guān)的分析物（或生物標(biāo)志物）的檢測。這引發(fā)了兩個問題：首先，患者（或保險公司）是否應(yīng)該支付不必要的檢查費用；其次，報告的一部分異常結(jié)果與所關(guān)注的臨床病癥無關(guān)。這種經(jīng)驗使開放型分析儀的開發(fā)更加強調(diào)“相關(guān)”生物標(biāo)志物或“生物標(biāo)志物組合”檢測。因此，雖然檢測通量是LOC概念的主要屬性，但制定正確的“生物標(biāo)志物組合”并發(fā)揮臨床效用仍面臨更大的挑戰(zhàn)。還必須考慮的是，在前面的討論中提到的關(guān)于不必要檢測結(jié)果所產(chǎn)生的倫理問題，以及對臨床醫(yī)學(xué)循證日益增長的需求，這也是改善患者醫(yī)療保健服務(wù)質(zhì)量要求的一部分。

因此，雖然LOC診斷的原則已明確，但常規(guī)應(yīng)用卻明顯滯后。或許還可以從POC測試中學(xué)習(xí)到其他的東西，盡管由于未能提供良好的商業(yè)案例以及客戶組織無法為引入顛覆性技術(shù)的臨床實踐做出改變，減緩了新技術(shù)的采用速度，但有好幾個方案可能被使用，這些方案涉及的是多個項目檢測。因此，當(dāng)必須對一名患者依次進(jìn)行少量項目檢測時，單個分析物POC測試顯得十分耗時。然而，盡管LOC解決方案可能正確，但我們所面臨的挑戰(zhàn)在于所選擇的項目是否能夠同時平行檢測，因為在臨床有關(guān)的檢測項目菜單中可以提供許多檢測項目；此外，這些與疾病相關(guān)的檢測項目并不總是限于使用免疫檢測原理對分析物進(jìn)行檢測。

因此，這就引發(fā)了另外兩個問題：首先，LOC設(shè)備是否可以采用多種分析技術(shù)？其次，選擇LOC設(shè)備的真正優(yōu)勢是否在于制造的靈活性，以及生產(chǎn)多分析物一次性設(shè)備組合的能力，該組合是否取決于客戶？

毫無疑問，小型分析設(shè)備具有廣泛、巨大的應(yīng)用前景。此外，許多客戶需要的，尤其是感興趣的分析物范圍內(nèi)，相關(guān)產(chǎn)品已被逐步開發(fā)。然而，將其轉(zhuǎn)化為最適合的設(shè)置、（具有即時響應(yīng)且不需要任何專業(yè)技術(shù)知識的移動設(shè)置）、生產(chǎn)功能強大的設(shè)備和單測試/單分析物檢測試劑或儀器以滿足客戶個性化需求，仍然是一個挑戰(zhàn)。

八、參考文獻(xiàn)和進(jìn)一步閱讀

（賈克剛、侯敏　譯，陳福祥　審）