第六節(jié) 傳染病相關(guān)抗體的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室對(duì)疑似（現(xiàn)癥或既往）感染性疾病的調(diào)查研究可以通過檢測(cè)來(lái)自可疑微生物的抗原、檢測(cè)機(jī)體應(yīng)答可疑微生物形成的抗體，或者檢測(cè)可疑微生物的DNA或RNA等微生物檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行。這些方法都各有利弊：整體來(lái)說(shuō)，微生物檢測(cè)方法需要至少24h才能完成，并且許多微生物無(wú)法成功培養(yǎng)；對(duì)抗原檢測(cè)而言，有時(shí)抗原水平可能由于過低而難以檢測(cè)；抗體在感染后1～4周內(nèi)無(wú)法檢測(cè)，甚至在某些個(gè)體中無(wú)法被檢出；最后，DNA和RNA的檢測(cè)方法在多數(shù)情況下不能確定患者當(dāng)前的感染狀態(tài)，而且由于循環(huán)水平過低無(wú)法用于某些微生物的檢測(cè)。

當(dāng)需要進(jìn)行全面調(diào)查以明確感染的性質(zhì)時(shí)，可以同時(shí)采用上述方法，但相應(yīng)的研究成本可能大幅增加。在多數(shù)情況下，可以選擇其中一種方法以解決研究中所關(guān)心的某一特定問題，而其中抗體檢測(cè)方法最為常用。例如，在確定機(jī)體對(duì)風(fēng)疹病毒的免疫力時(shí)，由于風(fēng)疹病毒難以被檢出，可以依據(jù)檢測(cè)相應(yīng)的抗體確認(rèn)由實(shí)際感染或免疫接種產(chǎn)生的免疫力，即采用抗體檢測(cè)較為合理。如果醫(yī)生懷疑患者的感染發(fā)生在過去的數(shù)周或數(shù)月內(nèi)，那么抗體檢測(cè)是最實(shí)用的確診方法，如梅毒或萊姆病的診斷。抗體還能提供信息來(lái)區(qū)分近期感染和既往感染。例如，EB核抗原1（EBNA-1）IgG抗體在急性EB病毒（EBV）感染時(shí)并不存在，因此在檢測(cè)不到EBNA-1 IgG抗體的患者中檢測(cè)EB病毒衣殼抗原（VCA）IgM和/或IgG抗體，有助于確認(rèn)活動(dòng)性感染。

大多數(shù)免疫分析方法都是用來(lái)檢測(cè)明確的實(shí)體，包括小分子或蛋白質(zhì)，而不是抗體。要檢測(cè)抗體時(shí)，需要了解與檢測(cè)方法開發(fā)相關(guān)的抗體特性，包括親和力、親合力和同種型。此外，抗體識(shí)別表位有時(shí)可能并不明確，即表位在不同個(gè)體之間、疾病不同階段以及同一微生物的不同毒株之間都有可能存在差異。免疫檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)必須考慮到這些特征，而抗體的多樣性要求檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)同樣具備多樣性。

免疫系統(tǒng)是一個(gè)高效的制造場(chǎng)所，因此抗體檢測(cè)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其濃度通常相當(dāng)可觀。對(duì)需要早期檢出的免疫檢測(cè)方法，如HIV抗體的檢測(cè)，其可能需要方法具備很高的靈敏度。但是，當(dāng)抗體在B細(xì)胞中穩(wěn)定產(chǎn)生后，抗體濃度大幅升高，此時(shí)檢測(cè)方法只需要適度的靈敏度即可。另一方面，抗體檢測(cè)的校準(zhǔn)非常困難。抗體的合成通常耗時(shí)且昂貴，因此人源性物質(zhì)常被用于校準(zhǔn)。然而，人類抗體的親和力、親合力和表位特異性可能存在差異，給檢測(cè)方法的校準(zhǔn)帶來(lái)了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。重組抗體應(yīng)用正逐步擴(kuò)展，未來(lái)可能為抗體檢測(cè)方法的校準(zhǔn)優(yōu)化提供機(jī)遇。

一、檢測(cè)模式

當(dāng)前幾乎所有抗體免疫檢測(cè)方法的共同特征是將目標(biāo)抗原與固相結(jié)合。快速檢測(cè)通常使用反應(yīng)條，而臨床化學(xué)領(lǐng)域通常選擇基于微球的檢測(cè)方法。單項(xiàng)檢測(cè)可以在羅氏、西門子、雅培和其他制造商的儀器中實(shí)現(xiàn)；多重檢測(cè)則可以使用Luminex儀器及其相關(guān)技術(shù)進(jìn)行。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）易于制備，并且可以使用廉價(jià)設(shè)備在幾乎所有實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，因此被廣泛地用于抗體檢測(cè)。平面陣列技術(shù)以ELISA原理為基礎(chǔ)進(jìn)行擴(kuò)展，允許多種抗體的同時(shí)檢測(cè)。詳見第四部分第一節(jié)“ELISA開發(fā)實(shí)用指南”。

當(dāng)對(duì)檢測(cè)特異性有極高要求時(shí)，如血液中心篩查場(chǎng)景下，可以采用雙抗原夾心檢測(cè)技術(shù)。在這種模式下，抗原以低密度被固定在固相上。抗體的其中一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)將與這個(gè)靶抗原結(jié)合，另一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)保持未結(jié)合狀態(tài)。在清洗步驟后，加入另外一種已預(yù)先與標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合的抗原，從而更好地保障目標(biāo)抗體被正確識(shí)別和捕獲。但是，這種技術(shù)的缺點(diǎn)是難以區(qū)分抗體的不同分型。

二、檢測(cè)方法研發(fā)

（一）捕獲試劑的選擇

捕獲試劑是構(gòu)建免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ)，因此選擇捕獲試劑是開發(fā)用于量化目標(biāo)分析物的特定檢測(cè)方法中最關(guān)鍵步驟之一。捕獲試劑應(yīng)與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合，所以在選擇捕獲試劑時(shí)，特異性可能是最重要的考慮因素。為了檢測(cè)針對(duì)感染因子的抗體，最好的捕獲試劑是感染因子本身的免疫原性部分。研究人員可以在計(jì)算機(jī)上運(yùn)用表位建模軟件預(yù)測(cè)高免疫原性區(qū)域。但通常推薦通過實(shí)驗(yàn)來(lái)確定感染因子的高免疫原性區(qū)域信息，其結(jié)果更為可靠。例如，可以測(cè)試經(jīng)免疫反應(yīng)（比如，病毒滅活株或減毒株）產(chǎn)生的抗體與來(lái)自感染因子的蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)性，以確定后者哪些蛋白質(zhì)最具免疫原性。免疫原性蛋白質(zhì)可以通過多肽或突變體進(jìn)一步定位免疫原性表位。

在選擇捕獲試劑時(shí)還應(yīng)考慮物種間的特異性差異，即如果該檢測(cè)方法旨在測(cè)試針對(duì)感染因子不同毒株的抗體，則捕獲試劑在這些毒株之間應(yīng)該足夠保守。反之，可能需要具有毒株特異性的捕獲試劑。人們還應(yīng)該考慮抗體反應(yīng)的異質(zhì)性（見下文）。推薦選擇一種免疫顯性抗原以確保大部分（即使不能全部）含抗感染因子抗體的樣本能被檢測(cè)出。

一旦識(shí)別出潛在的捕獲試劑，就可以根據(jù)其結(jié)合親和力和特異性來(lái)進(jìn)行篩選。為此，建議在相應(yīng)物種中制備多克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。所選擇的捕獲試劑應(yīng)在目標(biāo)基質(zhì)（如人血）中表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力和特異性（通過低本底和缺少基質(zhì)干擾來(lái)評(píng)估）。如果捕獲試劑與基質(zhì)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用，將導(dǎo)致檢測(cè)背景信號(hào)升高及假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

當(dāng)捕獲試劑被固定在固相上時(shí)，必須保留其與目標(biāo)分析物結(jié)合的能力。基于捕獲試劑的非極性部分與塑料基質(zhì)之間的疏水作用，捕獲試劑能夠固定在ELISA微孔板上。在某些情況下，包被過程可能會(huì)使捕獲試劑用于與目標(biāo)抗原結(jié)合所需的區(qū)域被掩蓋或隱藏，導(dǎo)致無(wú)法有效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的捕獲。在這些情況下，可以將捕獲試劑進(jìn)行標(biāo)記，并通過標(biāo)記的捕獲試劑與預(yù)先結(jié)合在微孔板上的高親和力配體相互作用，從而實(shí)現(xiàn)固定化。常用的標(biāo)記方式包括生物素標(biāo)記（與帶有親和素的包被板結(jié)合），以及組氨酸標(biāo)記（與帶有鎳包被板結(jié)合）。由于標(biāo)記試劑的包被依賴于標(biāo)記物（而非捕獲蛋白質(zhì)本身）與微孔板的結(jié)合，因此捕獲試劑的結(jié)合區(qū)域可能處于更有利的位置，并且能更自由地與目標(biāo)抗體結(jié)合。在進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，需要著重關(guān)注試劑被標(biāo)記的位置和程度，以確保該標(biāo)記過程不會(huì)改變?cè)噭┑慕Y(jié)合活性。

（二）檢測(cè)試劑的選擇

檢測(cè)試劑的作用是結(jié)合目標(biāo)抗體，并提供可量化的信號(hào)以供測(cè)量。最常見的情況下，酶（如辣根過氧化物酶，HRP）與檢測(cè)試劑結(jié)合，并與相應(yīng)的底物（如四甲基聯(lián)苯胺）反應(yīng)以產(chǎn)生與結(jié)合的目標(biāo)抗體數(shù)量成比例的顯色信號(hào)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)或化學(xué)熒光信號(hào)。市面上有大量的商品化酶標(biāo)記試劑可以實(shí)現(xiàn)上述目的。但是，如果酶與目標(biāo)檢測(cè)試劑偶聯(lián)不便，也可以采用二級(jí)檢測(cè)試劑代替。例如，如果使用自制的小鼠單克隆抗體作為一抗，則可以使用商品化HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗以產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。在選擇酶標(biāo)記物時(shí)，應(yīng)考慮溫育溫度、緩沖液組成、pH、酶的穩(wěn)定性以及對(duì)輔酶因子的要求等。與所有的檢測(cè)試劑一樣，酶標(biāo)記物的使用濃度應(yīng)該針對(duì)每一種檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化。

靈敏度是選擇檢測(cè)方法時(shí)最重要的考慮因素之一，如表2-6-1所示。盡管顯色法的靈敏度比化學(xué)熒光法和化學(xué)發(fā)光法低，但這并不一定是缺點(diǎn)。高度靈敏的檢測(cè)方法更容易因封閉液或稀釋液發(fā)生隨機(jī)性微小變化而受到影響。因此，合適的檢測(cè)方法通常提供等于或低于試劑預(yù)期檢測(cè)范圍的信號(hào)。如果試劑的預(yù)期檢測(cè)范圍在較高的pg或μg級(jí)別，則首選顯色檢測(cè)，而化學(xué)熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)則更適合更低檢測(cè)下限的檢測(cè)（如較低的pg或fg級(jí)別）。基于電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的Meso Scale Discovery（MSD）平臺(tái)（www.mesoscale.com）通常用于開發(fā)靈敏度高、線性范圍寬的檢測(cè)試劑。MSD使用釕標(biāo)記檢測(cè)抗體，在對(duì)MSD微孔板電極表面啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)后，會(huì)發(fā)出與樣本中抗體濃度成正比的光信號(hào)。光信號(hào)經(jīng)過多個(gè)激發(fā)周期放大以增加靈敏度，同時(shí)檢測(cè)體系保持較低的背景信號(hào)，以獲得良好的信噪比。

（三）封閉緩沖液

ELISA板中微孔的結(jié)合容量通常會(huì)超過用于包被的捕獲試劑的數(shù)量，因此需要利用封閉液（blocking solution）進(jìn)行封閉。封閉液包含與免疫反應(yīng)不相關(guān)的、無(wú)免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)能包被微孔的剩余表面，以減少測(cè)試樣本或檢測(cè)試劑中蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。表面活性劑也能夠有效地降低蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。常用的封閉成分包括白蛋白、酪蛋白、牛奶、Tween?、Triton?和硫酸葡聚糖。封閉成分的有效性取決于測(cè)定過程中的多種組分，其中最重要的可能是待測(cè)分析物的基質(zhì)。

非特異性結(jié)合的一個(gè)明確指標(biāo)是當(dāng)目標(biāo)抗體（即待測(cè)分析物）不存在時(shí)產(chǎn)生背景信號(hào)的強(qiáng)度。較高的背景信號(hào)會(huì)顯著降低檢測(cè)方法的信噪比，從而限制了方法的檢測(cè)范圍。除了在包被后立即封閉微孔板外，在隨后的清洗步驟中加入封閉蛋白質(zhì)或表面活性劑也有助于降低背景信號(hào)。推薦通過實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的封閉條件，包括封閉液中封閉蛋白質(zhì)或表面活性劑的濃度以及封閉過程的溫育時(shí)間和溫度。最佳封閉組合可以通過評(píng)估不同條件下對(duì)背景信號(hào)和信噪比的影響來(lái)確定。

（四）待測(cè)抗體的異質(zhì)性

機(jī)體對(duì)感染因子的免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的抗體幾乎都是多克隆抗體。因此，目標(biāo)抗體群通常非常多樣，并與感染因子免疫原性成分的數(shù)量相關(guān)。為了確保檢測(cè)中不遺漏陽(yáng)性樣本（假陰性），在試劑設(shè)計(jì)上需要對(duì)個(gè)體的全部抗體實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，這一點(diǎn)十分重要。這類檢測(cè)試劑可以選擇將用于捕獲的免疫顯性蛋白質(zhì)或表位與通用的檢測(cè)試劑（如抗物種特異性IgG抗體）進(jìn)行配對(duì)。

（五）同種型特異性

抗體同種型分型可以用來(lái)鑒別目標(biāo)抗體的血清學(xué)類別。分型通常能更好地表征抗體，并提供與抗體反應(yīng)相關(guān)的有用信息（如反應(yīng)時(shí)間和抗體結(jié)構(gòu)）。在使用ELISA檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)抗體的同種型可以通過捕獲或檢測(cè)對(duì)抗體同種型（如IgG和IgM）特異的抗體來(lái)確定。在市面上可以購(gòu)買到這些同種型特異性抗體（其通常為試劑盒形式，用以確定目的抗體類型）。其他的一些方法，包括瓊脂糖凝膠擴(kuò)散和同種型“試紙條”分型試劑等也可以用于抗體分型。與ELISA試劑類似，人們可以利用同種型特異性對(duì)目標(biāo)抗體進(jìn)行分型，但在不清楚目標(biāo)抗體分型的情況下研發(fā)檢測(cè)試劑需要避免同種型特異性的情況。

（六）疫苗免疫研究的特殊考慮

由疫苗引發(fā)機(jī)體針對(duì)特定抗原的抗體應(yīng)答能力可以通過定量免疫測(cè)定來(lái)評(píng)估，其最終結(jié)果可以以抗體滴度的形式報(bào)告。商品化試劑盒可用于針對(duì)常見疫苗抗原的定量抗體滴度分析；然而，罕見疫苗或?qū)嶒?yàn)性疫苗則需要研發(fā)新的免疫檢測(cè)方法。由于機(jī)體對(duì)疫苗的抗體應(yīng)答因人而異，因此形成可推算抗體絕對(duì)濃度的校準(zhǔn)曲線是不現(xiàn)實(shí)的。為此，抗體滴度的定量檢測(cè)通常是通過對(duì)待測(cè)樣本連續(xù)稀釋來(lái)進(jìn)行，其最終滴度報(bào)告為產(chǎn)生高于本底的可靠信號(hào)時(shí)的最高樣本稀釋度。抗體的含量并不是了解疫苗免疫應(yīng)答的唯一重要因素；抗體應(yīng)答動(dòng)力學(xué)同樣重要，通常通過加入同種型特異性檢測(cè)抗體（如上述）來(lái)跟蹤抗體應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)特征。

三、方法確認(rèn)

（一）定量范圍

免疫檢測(cè)的定量范圍（quantitation range）應(yīng)符合可接受稀釋水平下未知樣本的預(yù)期抗體濃度。定量范圍由定量的上限值和下限值進(jìn)行定義。利用上下限以及介于兩者之間的四種建議抗體濃度對(duì)應(yīng)樣本相對(duì)于已知對(duì)照樣本產(chǎn)生的信號(hào)生成校準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)未知樣品測(cè)定過程中產(chǎn)生的信號(hào)，利用校準(zhǔn)曲線來(lái)確定未知樣品中抗體的濃度。

經(jīng)確認(rèn)的定量范圍要求已知抗體濃度的對(duì)照樣本需具有可接受的精密度和準(zhǔn)確度。除了校準(zhǔn)曲線各個(gè)點(diǎn)（校準(zhǔn)品）的抗體濃度外，至少高、中和低濃度（相對(duì)于定量的上限和下限）的對(duì)照樣本也必須具有可接受的準(zhǔn)確度和精密度。方法學(xué)準(zhǔn)確度的定義是通過該方法獲得的測(cè)試結(jié)果與對(duì)照樣本已知濃度的接近程度，通常以相對(duì)誤差（relative error）表示。檢測(cè)精密度的定義是指在同一微孔板內(nèi)（批內(nèi)）或不同微孔板間（批間）多次進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)時(shí)的抗體濃度的接近程度。當(dāng)前管理指南，如來(lái)自美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）建議，經(jīng)確認(rèn)的抗體定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確度的相對(duì)誤差應(yīng)為已知抗體濃度的±20%和精密度的變異系數(shù)≤20%。有關(guān)指標(biāo)確認(rèn)的參數(shù)信息可以在當(dāng)前的管理指南和行業(yè)白皮書中找到。

（二）稀釋線性

如上所述，免疫檢測(cè)的定量范圍應(yīng)與可接受稀釋度下測(cè)試樣本的預(yù)期抗體濃度相適應(yīng)。當(dāng)待測(cè)樣本中抗體濃度超出定量范圍時(shí)，通常需要稀釋以使抗體濃度落在定量范圍以內(nèi)。為了展示樣本可以被稀釋的程度并且通過反向計(jì)算獲得準(zhǔn)確的目標(biāo)抗體濃度，應(yīng)該對(duì)稀釋線性進(jìn)行評(píng)估。通常將高濃度的抗體投入到待測(cè)樣本的基質(zhì)中，并對(duì)該樣本進(jìn)行連續(xù)稀釋，以使其檢測(cè)結(jié)果濃度值落在分析的定量范圍內(nèi)。當(dāng)落在定量上、下限之間的80%的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)反算（乘以稀釋因子）得到的濃度在已知抗體濃度±20%以內(nèi)時(shí)，稀釋線性性能是可接受的。將滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的最高稀釋倍數(shù)定義為稀釋極限（limit of dilution）。

需要特別注意，如果稀釋前目標(biāo)抗體理論上應(yīng)該產(chǎn)生高于定量上限的信號(hào)，但實(shí)際上卻落在定量范圍內(nèi)，這表明測(cè)定中可能存在前帶（prozone）效應(yīng)，也稱高劑量鉤狀效應(yīng)（high-dose hook effect）。這種情況可能在抗體水平相對(duì)于檢測(cè)試劑過量時(shí)發(fā)生，從而使捕獲和檢測(cè)試劑的結(jié)合力飽和并抑制了信號(hào)的產(chǎn)生。當(dāng)檢測(cè)方法疑似存在鉤狀效應(yīng)時(shí)，測(cè)試者需要格外留意。為了避免低估抗體的高濃度水平，建議在多個(gè)稀釋度下對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行檢測(cè)，以展現(xiàn)稀釋線性，即平行樣本（parallelism）。

（三）選擇性和特異性

選擇性（selectivity）是評(píng)估當(dāng)測(cè)試樣本基質(zhì)（如血漿）中含有其他物質(zhì)的情況下，方法檢測(cè)出目標(biāo)抗體的能力。類似地，特異性（specificity）是評(píng)估檢測(cè)試劑與目標(biāo)抗體結(jié)合的能力，尤其是當(dāng)測(cè)試樣本中預(yù)期存在結(jié)構(gòu)相似的化合物或潛在交叉反應(yīng)物時(shí)。為了確保在目標(biāo)抗體不存在時(shí)不會(huì)產(chǎn)生高水平的信號(hào)，選擇恰當(dāng)?shù)牟东@和檢測(cè)試劑至關(guān)重要。為了評(píng)估選擇性，應(yīng)在獨(dú)立批次的空白樣本基質(zhì)中加入目標(biāo)抗體，并測(cè)量抗體濃度以計(jì)算每個(gè)樣本的回收率。如果至少80%的測(cè)試樣本中抗體的回收率是已知抗體濃度的±20%，則認(rèn)為該方法的選擇性是可以接受的。同理，特異性的評(píng)估可以通過將抗體加入已添加已知濃度潛在交叉反應(yīng)物的樣品基質(zhì)中來(lái)進(jìn)行。如果與已知濃度的加標(biāo)樣品相比，含有潛在交叉反應(yīng)物情況下抗體的回收率在80%～120%的相對(duì)誤差范圍內(nèi)，則特異性可接受。此外，對(duì)于僅含有潛在交叉反應(yīng)物的樣本，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)低于定量下限。

（四）穩(wěn)定性

在任何確認(rèn)試驗(yàn)中，確認(rèn)分析物在待測(cè)樣本儲(chǔ)存條件下（儲(chǔ)存時(shí)間和溫度）保持穩(wěn)定是十分重要的。抗體在長(zhǎng)期冷凍的條件下可以在很長(zhǎng)時(shí)間（如1年）保持相對(duì)穩(wěn)定；然而，非理想的儲(chǔ)存條件和反復(fù)多次的凍融會(huì)導(dǎo)致樣本內(nèi)物質(zhì)降解。通常可以通過制備多個(gè)水平的質(zhì)控品（在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中加入抗體）來(lái)模擬測(cè)試樣本以評(píng)估其穩(wěn)定性。測(cè)試的時(shí)間和溫度應(yīng)該反映樣本可能的存儲(chǔ)條件，并且還應(yīng)該包括樣本處理過程中可能發(fā)生的潛在誤操作（如樣品留在工作臺(tái)上）。常見的穩(wěn)定性評(píng)估實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括在室溫和冷藏溫度下進(jìn)行短期評(píng)估、冷凍條件下進(jìn)行長(zhǎng)期評(píng)估以及反復(fù)凍融下評(píng)估。當(dāng)至少2/3的穩(wěn)定性評(píng)估樣本和每種濃度水平的50%或以上樣本結(jié)果符合該方法設(shè)定的準(zhǔn)確度和精密度要求時(shí)，穩(wěn)定性可接受。

四、儀器

對(duì)于簡(jiǎn)易的試紙條檢測(cè)，通常采用目測(cè)觀察而無(wú)需儀器。試紙條測(cè)試費(fèi)用低廉，可以在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室之外和設(shè)備有限的國(guó)家使用。抗體在干燥時(shí)通常會(huì)保持穩(wěn)定，所以血斑可以在偏遠(yuǎn)地區(qū)中收集并轉(zhuǎn)移到檢測(cè)中心進(jìn)行洗脫，從而進(jìn)一步增強(qiáng)檢測(cè)方法在發(fā)展中國(guó)家的適用性。

ELISA設(shè)備應(yīng)用廣泛，可支持顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)。為了提高通過量，可以使用機(jī)械設(shè)備實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化吸樣、移液和清洗等步驟，其還可以同時(shí)處理2～16塊微孔滴定板。由于ELISA中抗體濃度較高，溫育時(shí)間一般選擇30～60min，所以ELISA測(cè)試的總耗時(shí)為2～3h。

自1997年多重微利分析技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，該技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。在許多情況下，醫(yī)院需同時(shí)測(cè)定多種抗體以輔助病人的診療。例如，為了建立兒童期感染的免疫力，醫(yī)院通常要求同時(shí)檢測(cè)流行性腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹和水痘（MMRV）抗體。在本書中描述的Luminex 200系統(tǒng)被廣泛用于上述檢測(cè)，而抗原陣列也可以實(shí)現(xiàn)多種抗體的同時(shí)檢測(cè)。

五、應(yīng)用

目前已有相當(dāng)多的感染性疾病可以通過血清學(xué)檢測(cè)來(lái)鑒定。下述總結(jié)了關(guān)于血清學(xué)檢測(cè)的一些更重要的應(yīng)用以及部分新興用途。

（一）血庫(kù)檢測(cè)

為確保血液供應(yīng)的安全，血庫(kù)必須對(duì)獻(xiàn)血人員進(jìn)行傳染病篩查。通常包括艾滋病、肝炎和梅毒檢測(cè)；在某些病原體流行的地區(qū)還需進(jìn)行其他傳染病的篩查，如人T淋巴細(xì)胞病毒（HTLV）、瘧疾和錐蟲病。

HIV檢測(cè)必須具備高靈敏度和高特異性，因此其相關(guān)檢測(cè)方法的要求在當(dāng)前已有免疫分析項(xiàng)目中可能最為嚴(yán)格。在實(shí)驗(yàn)室中，目前的HIV第四代試劑必須具有超過99.5%的靈敏度和99.7%的特異性；對(duì)用于社區(qū)診所的快檢試劑來(lái)說(shuō)，其要求略為降低。為了滿足特異性的要求，一些制造商采用夾心法的模式進(jìn)行檢測(cè)，即HIV抗體的一只臂識(shí)別固定于固相表面的靶標(biāo)分子，另一只臂識(shí)別偶聯(lián)了酶或其他標(biāo)記物的抗原，最終通過熒光和化學(xué)發(fā)光信號(hào)來(lái)檢測(cè)。如果IgG和IgM抗體均存在，檢測(cè)方法必須能同時(shí)檢出。此外，無(wú)論采用何種初篩方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果都必須進(jìn)行確認(rèn)。過去，常用免疫印跡法（Western blot）作為確證試驗(yàn)；如今篩查試驗(yàn)的靈敏度可能超越了免疫印跡法，因此需要采用諸如基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)（NAAT）來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充檢測(cè)。最后，HIV是一種具有多種血清型的病毒，因此檢測(cè)試劑必須能夠識(shí)別足夠廣泛的抗體類型以檢出各種血清型以及HIV-2這一種基因序列有顯著差異的不同病毒株。圖2-6-1舉例說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行HIV抗體的篩查和確認(rèn)的基本流程。

（二）確認(rèn)急性疾病狀態(tài)

通過抗體檢測(cè)可以確認(rèn)許多疾病是否處于急性期。傳染性單核細(xì)胞增多癥是兒童和青少年中的一種常見傳染病，數(shù)十年來(lái)人們一直采用一種檢測(cè)“嗜異性抗體”的簡(jiǎn)便方法來(lái)輔助診斷。這種方法采用試紙條的形式，用于檢測(cè)存在于人血清中且能與綿羊或馬的血液提取物反應(yīng)的抗體。目前，針對(duì)EB病毒VCA抗原的IgM抗體檢測(cè)靈敏度更高，并常作為優(yōu)選方法；但該檢測(cè)方法一般只在提供全面服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室采用。關(guān)于感染后的其他情況可以利用EBV VCA IgG和EBV早期抗原（EA-D）IgG抗體來(lái)確定。最后，因?yàn)镋BNA IgG抗體通常在初次感染后3個(gè)月出現(xiàn)，因此若未能檢測(cè)到上述抗體則可以排除患者處于感染晚期或二次感染的可能。圖2-6-2匯總了這些抗體出現(xiàn)的先后順序。許多醫(yī)生沒有接受過解讀檢測(cè)結(jié)果的訓(xùn)練，而技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展可能會(huì)繼續(xù)改變這些測(cè)試的使用方式。例如，在2 000年以前，EBNA抗體的檢測(cè)均采用間接免疫熒光法。該方法可以檢測(cè)多種EBNA分子，同時(shí)包含早期和較晚階段出現(xiàn)的分子。然而，所有現(xiàn)代方法檢測(cè)的抗重組EBNA-1蛋白抗體均是在感染較后期才形成的，因此提高了檢測(cè)的實(shí)用性。

（三）影響妊娠的病原體

抗體檢測(cè)的另一個(gè)主要用途是篩查孕婦是否患有可能傳染給其子女的疾病。這類篩查與血庫(kù)篩查不同，因?yàn)榍罢咧挥谢顒?dòng)的、未經(jīng)治療的傳染病才有意義。這類檢測(cè)包括弓形蟲、風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒（CMV）和梅毒感染等，某些國(guó)家也把單純皰疹病毒（HSV）的檢測(cè)包括在內(nèi)。篩查試驗(yàn)包括IgG和IgM抗體，而近期感染有時(shí)僅能通過IgM抗體的檢測(cè)來(lái)發(fā)現(xiàn)。

（四）疫苗有效性

前文提到了醫(yī)院工作人員對(duì)麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和水痘帶狀皰疹病毒的檢測(cè)，并且還報(bào)道了用于白喉、破傷風(fēng)監(jiān)測(cè)的多種方法。此外，新疫苗的開發(fā)一般需要進(jìn)行抗體檢測(cè)以確定制劑是否能有效地引起免疫反應(yīng)，該過程減少了對(duì)煩瑣的中和試驗(yàn)的需求。近期引進(jìn)的人類乳頭瘤病毒和肺炎球菌疫苗便得到了快速抗體篩查的極大幫助。

（五）移植和免疫抑制監(jiān)測(cè)

許多用于監(jiān)測(cè)急性感染、妊娠期疾病和疫苗接種功效的檢測(cè)對(duì)于在移植前評(píng)估供體和受體具備價(jià)值。例如，來(lái)自EBV或CMV感染供者的器官可能會(huì)導(dǎo)致未曾感染過的受者出現(xiàn)嚴(yán)重疾病。抗體篩檢費(fèi)用低廉，有助于發(fā)現(xiàn)潛在風(fēng)險(xiǎn)。后續(xù)檢測(cè)通常需要NAAT來(lái)確認(rèn)是否存在活動(dòng)性感染，在某些情況下還需要確定病毒載量。器官受贈(zèng)者為降低排斥風(fēng)險(xiǎn)而引發(fā)的免疫抑制狀態(tài)可能會(huì)導(dǎo)致潛伏病毒（CMV、EBV或HSV）致病，使患者和器官都處于危險(xiǎn)之中。

（六）流行病學(xué)

鑒定新的傳染病通常需要確定當(dāng)?shù)厝丝谥屑膊”┌l(fā)的流行性情況，如漢坦病毒。此外，對(duì)動(dòng)物種群的檢測(cè)也有助于確定可能攜帶該疾病的物種。這些研究可以通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析來(lái)補(bǔ)充，并鑒定出了長(zhǎng)期散播漢坦病毒的動(dòng)物——鹿鼠。此外，許多患者可能已經(jīng)暴露感染但尚未表現(xiàn)出癥狀；利用血清學(xué)檢測(cè)，則可以更準(zhǔn)確地確定該病的真實(shí)發(fā)病率。在1999年紐約市西尼羅病毒暴發(fā)期間，據(jù)稱只有1%的感染者報(bào)告了癥狀。

（七）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

用于研究的動(dòng)物可以通過定期檢測(cè)以確定是既往感染或現(xiàn)癥感染。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通常采用小鼠或大鼠進(jìn)行傳染性疾病測(cè)試，因此可以同時(shí)篩查多種感染的多重分析方法逐漸流行。同樣，家畜也經(jīng)常在獸醫(yī)診所中接受傳染病篩查。

（八）生物戰(zhàn)

對(duì)于炭疽等急性病原體而言，在生物戰(zhàn)攻擊事件中通常并不會(huì)首選抗體檢測(cè)。然而，在其他情況下，當(dāng)局可能必須進(jìn)行廣泛的抗體檢測(cè)，以確定傳染病的流行程度。與此同時(shí)，抗體檢測(cè)還可幫助有過病原體接觸史的人群排除感染可能。

六、擴(kuò)展閱讀

（周宏偉　譯，何建文　審）