第五節 定性免疫檢測的特點和設計

與定量免疫檢測給出濃度值不同，定性免疫檢測通常直接給出“診斷”或分類結果，如抗體/抗原陰陽性判斷，即定性免疫檢測通常給出是或否的結論。與定量檢測相比，人們對定性免疫檢測的第一印象可能是其更加簡單，也更容易使用。然而定性免疫檢測需要對產生的信號進行解釋，即給出是或否的結論，而不僅僅是給出濃度值，因此這類方法與臨床診斷緊密相關。整體而言，定性檢測方法在設計時需要更加嚴謹，同時要求使用者理解其應用局限性。例如，很多定性免疫檢測設定了灰區，表示在這一區段內不能給出確定的診斷結果或者結果需要進一步確認。以獻血篩查為例，初篩陽性結果需要采用第二種定性或定量試劑確認。對于定性免疫檢測的陰性結果而言，其可以不進行進一步的確認，并提供有意義的臨床信息，如可以確認婦女并未懷孕。如果沒有臨床解釋的特殊要求，這種陰性結果通常不會進行復測。因此，了解用戶的需求和客戶對測試結果的解釋是定性檢測方法設計的基礎。

定性免疫檢測在免疫檢測法發明后不久即已出現。然而，在早期定性免疫檢測中，每輪測試都需要進行標準化（因為早期定性檢測方法非常依賴于精確的試劑濃度和放射性同位素的衰退平衡），這限制了其使用價值和可靠性。通過測試質控品，可以對每輪檢測中的臨界值信號水平進行修訂。隨著臨界非放射性的、穩健的免疫計量檢測技術的引入，如ELISA、側向層流免疫檢測，定性檢測得到迅速發展。很多早期定性檢測是為了測量抗體的滴度，如針對乙型肝炎病毒相關抗體的檢測，其對應的“定量”檢測結果的報告單位在不同的檢測方法間存在差異。對定性檢測方法而言，上述滴度測量結果使其具備部分定量檢測的優勢。

定性檢測被廣泛應用于篩查，因此其測試通量非常重要。特別是對于血液中心而言，大量的獻血篩查樣本一般選用大型自動化儀器進行定性檢測。另一方面，定性檢測也是家庭用戶的常用方法，如最為常見的家用驗孕試紙。上述兩種情況涵蓋大量不同使用場景，因此定性檢測也被全科醫生、獸醫、警察、環境專家和安全專家等臨床檢驗領域以外的專業人士使用。

定性免疫檢測可以分為兩類，一類是確認分析物是否存在，如病毒的抗原、抗體或毒品；另一類是區分分析物的濃度與背景濃度的差異，如驗孕檢測中的hCG測試。對于第一類檢測，檢測方法的靈敏度和特異性是關鍵因素；對于第二類檢測，設計者還需要考慮到分析物在正常人群中的濃度分布。

在增長潛力方面，由于發展中國家市場的開拓和血篩查檢測應用的拓展，定性免疫檢測的市場規模正在穩定增長。

定性檢測方法的開發在原理設計、條件優化、性能驗證和確認中具備獨特的特征，也受到額外的監管。本節所討論的定性檢測試劑的設計和開發的相關概念主要基于自動化的免疫檢測方法，但其原則在其他類型的定性檢測中同樣適用。

一、定性檢測的特點

（一）定義

免疫檢測可以按照輸出的結果分為定性、半定量和定量。定性指的是確定結果的性質或特征，而不是數量或量值。定性免疫檢測（qualitative immunoassay）基于分析物是否存在或分析物濃度相對于已建立的參考點的高低，來區分兩個或多個相互排斥的特征并得出相應的結論。在一些應用中，一個定性免疫檢測方法可能需要同時檢測兩種或更多種分析物。定性檢測的結果通常是二元的，即有反應性或無反應性。根據檢測的設計，上述結果可以被解釋為陽性或陰性。定量（quantitative）或半定量檢測能推算出分析物的濃度。定性免疫檢測不僅僅是簡單地根據測量的濃度和參考區間來解釋定性結果，更重要的是給出樣本狀態（如陽性或陰性）的結論。盡管部分定性檢測與定量檢測在某些領域或使用場景下存在一定重疊，但定性檢測的首要目的不是確認樣本中分析物濃度。

在定性檢測中，通常定義分析物的某個閾值濃度水平（臨界值，將在下面討論）以判斷分析物是否存在。分析物存在與否不應依據其濃度是否為零的絕對度量進行判斷，而應該依據預先確定的基于檢測靈敏度和特異性之間平衡的臨界值進行判斷，并與參比系統或臨床結果進行比較。由于上述原因，定性檢測的臨界值附近通常存在灰區。

半定量檢測（semiquantitative assays）基于定量檢測結果的有臨床意義的變化給出分類結果，通常認為其與定性檢測十分類似。整體而言，半定量檢測提供分類信息，如陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性。半定量檢測給出的分類結果與檢測的應用相關。例如，監測患者對抗病毒治療的應答時，可以測量患者體內抗病毒抗體的水平。換言之，半定量是指根據抗原濃度或抗體滴度的增加或減少提供額外的定性信息的能力，即定性結果的變化。與其他免疫檢測方法類似，半定量檢測的結果也有一定不確定性。在實際應用中，半定量檢測與定性和定量檢測之間均存在一定程度的重疊。從監管的角度來看，半定量檢測法必須作為定性檢測方法進行確認，才可以聲稱其分類結果具有臨床意義。

在一些定量檢測中，源自多個校準點的校準曲線可以將儀器的信號響應轉換成數值單位，以確定樣本中的分析物的水平。根據特定檢測的臨床應用需求，半定量免疫檢測也可以提供豐富的定量信息。

定性免疫檢測法可以通過設計達到盡可能高的靈敏度，這是其實際應用中的主要優勢之一。這樣，當樣本中抗原濃度或抗體滴度非常低時，就可以報告陽性或反應性結果。在設計定性檢測方法時，通常不需要對目標分析物形成可量化的或數字化的響應。

（二）抗原和抗體檢測

定性免疫檢測可用于檢測抗原或抗體，或同時檢測兩者。然而，檢測抗原和抗體的檢測方法，其設計的目標和要求是完全不同的。如果檢測抗原，如病毒抗原，檢測方法必須以實現最大靈敏度為目標進行設計。這主要是為了在特異性不受過度影響前提下，在基質低背景中檢出痕量的外源病毒抗原。然而，對于抗體檢測，檢測方法的設計雖然仍集中于實現最佳靈敏度，但需與更好的臨床特異性達到平衡。此外，與抗原檢測不同，抗體檢測可以通過測量特異性抗體與特異性抗原結合的親合力來獲取抗體的滴度，而其結果通常以任意單位（arbitraty unit，AU）表示。

在設計檢測方法以實現高靈敏度或特異性時，需要著重考慮假陽性和假陰性結果的臨床影響。高靈敏度的實現通常以犧牲特異性為代價（反之亦然），因此必須要考慮到后續的確認試驗，以達到檢測靈敏度和特異性的平衡，并獲得最佳的分析和臨床性能。當檢測方法的靈敏度過高時，其特異性可能相對較低，導致假陽性結果。例如，用于診斷時，高靈敏度的HBsAg檢測將可能報告更多的初始反應性（陽性）結果，這些結果需要通過復雜流程以確認或糾正。此外，假陽性結果將導致不必要的重復測試，或者在血液篩查中導致不必要的結果延遲和有價值的血液制品的浪費。另一方面，在誤診的情況下，如抗HTLV抗體假陽性，特別是考慮到與該病毒相關疾病發病率相對較低，患者可能承受過度的壓力和恐慌情緒。與之類似，在癌癥的診斷中，檢測方法需要具備高特異性以使結果假陽性率最小化，防止由于治療導致的醫源性疾病。

對病毒IgM檢測來說，檢測的目的是替代傳統病毒分離方法，快速診斷急性或原發性感染，因此必須證明該方法能夠檢測出病毒感染的真實疾病狀態，并且不會漏檢可能的陽性樣本。病毒IgM檢測試劑在設計時需要針對高特異性和靈敏度進行充分的優化。從這些例子中可以看出，在優化篩查試劑時，其后續確認試驗相關的成本和風險不可忽視。

最后，需要注意設計針對正常人群（如獻血者）的篩查檢測和設計針對具有癥狀或臨床病史的患者的診斷檢測之間存在差異。

最新的第四代定性免疫檢測能夠同時檢測抗原和抗體。檢測方法的設計主要聚焦于實現最高靈敏度，如第四代HIV檢測即可對早期血清轉化期間產生的低水平抗體及HIV p24（gag）病毒抗原進行聯合檢測。在這些檢測中，初篩陽性結果必須使用另外的試劑進行補充測試以確認HIV感染，因此檢測方法具備合適的特異性仍然十分重要。HIV抗體是HIV感染的可靠指標，但其在約3～4周的初始窗口期后（并且某些個體的窗口期較長）才出現。HIV抗原抗體聯合檢測使之相對于NAT篩查的窗口期顯著減少至2.35～4.04天。由于HIV基因組中免疫支配區域內的抗原變異性高，在設計檢測方法時，需要優先選用多種從不同病毒株分離出來的、表達保守區域蛋白序列的抗原。對于美國和歐盟的監管當局來說，第四代檢測方法如HIV抗原抗體聯合檢測越來越受歡迎，但其更為復雜，使開發和生產面臨更多挑戰。

（三）開發和監管要求

與定量檢測類似，定性檢測方法的主要開發過程通常包括可行性研究、優化、驗證和確認以及產品發布。其中，驗證和確認階段對于開發定性檢測方法非常關鍵。相比定量檢測，定性檢測確認的要求和方法與具體檢測試劑關系更大，如臨界值的驗證和確認，以及不同類別和疾病階段的檢測靈敏度的確定。關于定性檢測開發的更多細節將在后文進行介紹。

理解針對特定分析物和檢測方法的監管要求同樣重要。例如，在美國用于血液篩查的試劑由美國食品和藥品管理局（FDA）的生物制劑部門監管，獸用篩查試劑由美國農業部（USDA）監管。監管機構高度關注定性檢測的安全性和有效性，對于檢測抗病毒IgM抗體的試劑尤其如此。實驗室可能依賴于IgM檢測來診斷病毒感染，因此相關IgM檢測必須具備高特異性。如果IgM檢測不能有效區分所檢測的特定群體的真陽性和假陽性，則可能對受試者造成不利后果，如使健康個體接受不必要的抗病毒治療。同樣，假陰性結果可能導致治療延誤。此外，某些病毒感染的漏診或誤診可能對孕婦和胎兒產生嚴重的不良影響。因此，相關機構對抗病毒IgM抗體檢測的開發有一些特殊的要求。以下是定性抗體-抗原檢測的監管要點，其原則也適用于特定IgM的檢測。

● 抗原。分析物是什么抗原？為什么選擇這種抗原？抗原是天然的還是重組的？它是蛋白質還是多肽？它是純化的蛋白質還是細胞裂解液？在檢測設計中使用的病毒株、抗血清和合成材料的來源是什么？所有這些都是決定檢測的特異性和靈敏度的關鍵因素。

● 臨界值。如何確定和驗證臨界值？必須基于受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線來建立。

● 質量控制（quality control，QC）材料。QC的關鍵要求是其材料應與檢測的預期用途和臨床效用相關，并具有代表性。定性免疫檢測至少應該提供或推薦與測試樣本基質相同的兩個質控品（陽性和陰性）。

根據FDA的要求，如果是半定量檢測，應進行適當的研究以證實結果與感染階段（如早期、急性、感染減弱）的關系。感染階段的判斷應依據已確立的參考范圍。對于每個感染階段，應至少選擇10名患者的結果以建立參考范圍。如果廠家宣稱檢測具備半定量能力，還必須證明產品的線性達到或超過宣稱的指標。

（四）臨床應用

整體而言，定性檢測適用于以篩查、診斷和確認為目的的檢測場景。根據其應用對象的差異，不同的定性檢測具有不同的特征。在篩查中，定性檢測方法需要實現盡可能高的靈敏度，以使假陰性結果的風險最小化。然而，如前文所述，達到極高的靈敏度可能會犧牲特異性。因此，篩查試劑可能產生假陽性結果。對于以篩查為目的的定性檢測，假陽性結果的危害遠小于假陰性結果的危害。例如，在使用HBsAg試劑篩查獻血者時，由于假陰性結果會給血液供應帶來風險，因此高靈敏度非常重要，同時這也是監管的要求。相反，血液篩查中的假陽性結果對血液供應幾乎沒有風險。此外，雖然確認某些分析物的存在可能比較煩瑣、耗時和昂貴，如果有必要也可以通過后續的確認實驗來糾正假陽性結果，但是如果篩查時假陽性結果過多，可能需要大量的確認試驗，并可能縮短血液制品保質期并導致獻血者的流失，這可能會嚴重影響血庫運行。同時，這些定性檢測方法通常還可能用于診斷用途。因此，在設計過程中有必要盡可能減少假陽性結果的出現。

在用于診斷時，定性檢測需要同時實現高靈敏度和高特異性。設計用于診斷的免疫檢測方法的核心是在靈敏度和特異性之間實現最佳平衡。一些檢測方法在設計中不僅確定樣本的反應性和非反應性，而且預先設定了灰區或可疑區間。灰區或可疑區間根據檢測的臨界臨界值確定，通常在關鍵的最小靈敏度附近。當檢測出現可疑結果時，通常需要復測。

在一些應用中，定性篩查測試結果為有反應性的樣品，隨后會用合適的確認方法進行分析。對定性檢測結果進行確認以保證其可靠性和準確性是重要的，而且在某些情況下是必需的。在作為確認方法時，定性檢測需要具備高特異性和高陽性預測值。確認試驗的檢測方法在設計時，一般可以通過在首輪篩查檢測中添加特定的中和抗體來確定特定分析物的存在與否，如在初篩陽性的樣本中加入抗HBs抗體以確認HBsAg的存在。此外，一些篩查結果可以通過蛋白質印跡（Western blotting）或免疫印跡（immunoblotting）等其他方法確認，如對HCV和HIV的抗體初篩陽性結果的可以通過上述方法進行確認。確認試驗的可能結果包括確認（陽性）、未確認（陰性）或不確定（可疑）。

在圖2-5-1的判定流程中，Access HBsAg檢測的臨界值是1.0 S/CO（其中樣品信號與臨界值的比等于1），S/CO在0.9～1.0之間為灰區。當樣本進行篩查測試時，如果結果≥1.0S/CO，則稱為初篩陽性（initially reactive，IR）；如果結果在0.9～1.0 S/CO范圍內，則稱之為灰區（不確定（indefinite）或可疑（equivocal））。具有反應性或不確定結果的樣品需要用篩查試劑復測兩次。如果在總共三次篩查檢測中有兩次結果≥1.0 S/CO，則稱為復測反應性（repeatedly reactive，RR）。具有RR結果的樣本用確認試劑再次測試。如果確認對照的結果≥1.0 S/CO且中和率≥40%，則樣品的結果被稱為確認陽性（confirmed positive）。然而，如果確認結果的對照≥1.0 S/CO，而中和率＜40%，則需要進一步稀釋后復測樣本。如果確認結果的對照最終是＜1.0 S/CO，則稱其未確認反應性（not confirmed reactive）。

確認初篩陽性反應結果的流程較為耗時。在采用定性檢測方法進行診斷時，每個IR結果都應通過上述判定流程，以確認上述例子中最終結果是否為HBsAg陽性。因此，需要充分優化篩查檢測方法以獲得最佳靈敏度和特異性，從而盡可能降低初篩假陽性率。

在每種應用中，必須進行適當的臨床研究，以表明其結果對疾病的判斷與參比方法或“金標準”（如果存在）相一致。

二、定性檢測方法的設計和開發

（一）檢測模式的選擇

定性檢測使用的反應模式與定量檢測相同，反應模式的選擇主要取決于檢測的預期用途和需求，如用于抗原或抗體的檢測，以及患者、用戶和監管機構的要求等。在進行定性檢測設計時，必須精心選擇合適的反應模式以滿足設計輸入。針對定性檢測的特點，其設計時常見考慮因素如下：

1.對于抗原檢測，最常用的模式是使用雙抗體夾心法免疫檢測。這種模式具有更寬的檢測范圍和更穩定的結果。對于小分子，如類固醇激素和藥物等，最為常用的檢測模式為競爭法。這種模式也可以用于抗原或抗體檢測。

2.對于抗體檢測，可以選擇間接法、免疫捕獲法或雙抗原夾心法。

● 間接法（indirect format）：第一步，使用包被有合成蛋白質或多肽、純化的病毒抗原或病毒感染的細胞裂解物的固相載體（如順磁性顆粒）來捕獲特異性抗體（IgG、IgM或總抗體）。第二步，使用酶或熒光標記的抗人IgG或抗人IgM檢測捕獲的抗體，或用抗原與標記的抗人IgG或IgM形成的免疫復合物檢測捕獲的抗體。

● 免疫捕獲法（immunocapture format）：第一步，使用包被有抗人抗體（如小鼠抗人IgG、山羊抗人IgM或蛋白G/A）的固相載體捕獲特異性人抗體（IgG、IgM或總抗體）。第二步，將捕獲的抗體通過標記有酶或熒光基團的特異性抗原，或抗原與標記的抗人IgG或IgM形成的免疫復合物進行檢測。

● 夾心法（sandwich format）：使用包被特異性抗原的固相載體也可以捕獲特異性抗體，被捕獲的抗體可以通過標記的特異性抗原檢測。然而，這種模式下，需要了解抗原的性質并使用純化的抗原，而且抗原需要具備合適的相對分子質量。雙抗原夾心法不能區分IgG和IgM，其針對總抗體進行檢測。

在檢測抗體時，每種模式都各有利弊。一般而言，檢測模式的選擇需要綜合考慮檢測的對象為IgG、IgM、IgA或是總抗體，獲取特異性抗原的可行性，不同亞類免疫球蛋白與特定抗原結合的競爭性，對干擾的敏感性等。以IgM檢測為例，檢測的靈敏度可能受非IgM免疫球蛋白影響。因此在免疫捕獲模式中，捕獲的IgM在第一步中與其他血清組分分離，防止后續IgM與IgG以及其他免疫球蛋白亞類間的競爭。對于間接法而言，其進行IgM檢測時，靈敏度可能受到非IgM類免疫球蛋白的影響。然而，捕獲法中特異性IgM也可能與其他非特異性IgM分子競爭固相載體上的抗人IgM抗體。因此，捕獲法中靈敏度受特異性IgM抗體與總IgM的比例的影響。與間接法相比，免疫捕獲法的缺點是需要針對每種待測的特異性IgM標記抗血清或抗原，即通常需要純化的特異性抗原或抗原-抗體免疫復合物。 此外，標記抗原在實踐中比標記免疫球蛋白更困難。

對特異性抗病毒IgM進行檢測時，間接法易受類風濕因子（rheumatoid factors，RFs）的干擾。RF是識別人IgG的自身免疫抗體，通常屬于IgM類。因此，間接法的第一步反應中，RF可以與被特異性病毒抗原捕獲的特異性IgG結合。然后，標記的抗人IgM偶聯物在下一步中可能識別結合的RF。當樣本含有高滴度的特異性病毒IgG時，這個問題尤為突出。在這種情況下，特異性病毒IgG可以與特異性病毒IgM競爭結合固相上的抗原，進而影響測定靈敏度。另一方面，與間接法相比，免疫捕獲法不易受到RF干擾。如果使用間接法，需要對樣本進行前處理以去除IgG，從而改善測試含有高滴度特異性病毒IgG的樣本時結果的可靠性。

（二）試劑的選擇和優化

與定量檢測類似，試劑優化對于設計定性檢測方法而言也是至關重要的。其中，選擇合適的生物活性原料（如抗體對和抗原），優化試劑配方，以及優化檢測過程，都是試劑優化的重要要素。試劑優化可以從評估關鍵的影響因素開始，包括可能的濃度范圍、可能的交叉反應物和其他干擾物質。將試劑性能優化提升到一個新水平，需要考慮如下關鍵因素：

1.抗體對：在檢測設計的兩端，即作為捕獲或者檢測，都使用單克隆抗體，以避免HAMA干擾。

2.抗原：天然的或重組抗原，在檢測設計的兩端，即作為捕獲或者檢測，使用的原料需要來自不同種屬或使用不同的表達和細胞培養系統。

3.可以檢出亞型或基因型。

4.固相化學：文獻中有多種選擇。

5.偶聯化學：文獻中有多種選擇。

6.溫育時間：滿足靈敏度和特異性要求，以及滿足用戶需求。

7.檢測模式：滿足靈敏度和特異性要求，以及滿足用戶需求。

8.試劑的組成和濃度：阻斷劑、穩定劑、防腐劑，以及化學品對環境的影響。

9.試劑穩定性：包括試劑在2～8℃下儲存時的穩定性，用戶可能經常將其移至環境溫度以進行測試時的穩定性，以及從廠家運輸到最終用戶的過程中的穩定性。

10.用于制作校準品和質控品的抗原/抗體：重組的或天然的。

11.校準品和質控品的基質：樣品的正確采集和處理。

12.樣本類型：EDTA、肝素、檸檬酸血漿和血清的等效性。

檢測方法的開發人員應評估這些因素及其相互作用對檢測的準確性、精密度、重復性、靈敏度和特異性的影響。對定性檢測而言，設置正確的臨界值是最基本的要求。

（三）ROC曲線、臨界值的確定和灰區

定性檢測設計中最重要的參數之一是確定臨界值。臨界值是用于區分反應性和非反應性狀態的信號響應水平，合理設定臨界值是給出正確臨床解釋的先決條件。確定臨界值的方法有很多種。通常，將臨界值定義為陰性質控品平均值加上2～3倍SD。確定臨界值的最佳方法為使用ROC曲線（ROC curve）臨界。ROC曲線是用診斷測試的靈敏度對所有可能的假陽性率（1-臨床特異性）作圖。ROC曲線作為表征臨床靈敏度（當疾病確實存在時檢測出疾病）和臨床特異性（當沒有疾病時識別出沒有疾病）的標準方法已被廣泛認可（Obuchowski et al，2004）。ROC曲線體現了免疫檢測設計時對臨床靈敏度和特異性之間的權衡。通過對設計輸入中靈敏度和特異性要求進行平衡，可以確定用于定性檢測的最佳臨界值（圖2-5-2）。

選擇ROC曲線設定臨界值時，原則上是為了實現最少的假陽性和假陰性結果，以達到靈敏度和特異性之間的最佳平衡。假陽性結果或假陰性結果的危害和嚴重程度取決于檢測的預期用途。

例如，用于獻血篩查的檢測方法應該具備高靈敏度，因為假陰性結果將對輸血安全性產生極高的風險。相反，用于輔助診斷惡性腫瘤的免疫檢測應該具有高特異性，因為假陽性結果可能導致不必要的治療而給患者帶來更高的風險。最佳臨界“cutoff”值的確定對于每種用途是獨特的；或者從更小的范圍講，對每種檢測設計是獨特的。因此，定性檢測的“準確性”通常通過證明臨界值能夠給出滿足診斷要求的靈敏度和特異性，從而在篩查的目標人群中達到最佳預測值來進行確認。

在實踐中，由于生物和系統因素，沒有一種檢測具有完美的靈敏度和特異性。在某些情況下，設置臨界值的目的是盡可能多的識別出真陽性，并盡量減少相同群體中的假陰性結果。在其他情況下，臨界值的設定應以實現結果的真陰性結果的概率達到最大，而假陽性結果概率最小為目標。

綜上所述，在待測生物標志物固有生物學特性的約束下，需要綜合考量試劑選擇、優化并合理設置臨界值，以達到臨床有效性的目標臨界。

在檢測方法設計時，需要定義和計算臨界值，計算臨界值的相關公式可以基于校準品建立（Xu et al.，1997）。例如，使用兩水平校準時，其中一個校準品不含特定分析物用于反映系統的噪聲信號，另一個校準品以基于功能靈敏度的濃度制備。臨界值可以通過以下公式計算：

式中x、y和z是根據ROC曲線為獲得最佳靈敏度和特異性所確定的參數。通常將定性檢測的結果報告為樣品信號與臨界值（S/CO）的比值。定義反應性結果對應的S/CO后，要通過內部和外部研究進行確認。在大多數情況下，S/CO≥1.0意味著反應性或陽性。

在檢測方法開發過程中，正常人群（沒有癥狀的健康個體）中分析物的濃度水平通過采用臨界值對一定數量的標本進行判斷來確定。標本的數量應有統計學意義，標本來源的人群應符合預期臨床用途，并應包含相關的樣本類型。

盡管定性檢測中臨界值可能存在不確定性，但是臨界值對分析和/或診斷的可靠性依然是方法確認過程中最重要的內容（Coste et al.，2006）。灰區（gray zone）是在定性檢測中臨界值的附近的一個區間；在此區間內，檢測結果難以被歸為反應性或非反應性，即檢測結果可能為“不確定、可疑或無結論”。灰區的上限為診斷結果可以判斷陽性，且陽性可能性最低的值。灰區的下限為診斷結果可以排除陽性，且陰性可能性最高的值。如果檢測結果“非黑即白”，則可能由于檢測系統和臨床應用過程中的不精密性而造成偏差，不利于實際使用；灰區的設定避免了上述“非黑即白”的情形。灰區和臨界值均應基于統計學上足夠大的樣本數量來確定，同時樣本群中患病和未患病的個體必須能夠代表常規測試的人群。對檢測進行優化和確認的主要目的是確保灰區的范圍盡可能窄，因此設計定性檢測的理想目標是沒有灰區。

在實際使用中，同一種檢測方法針對不同人群或不同應用，可能設置不同的臨界值。

（四）校準和質量控制

與定量檢測中使用多個校準品濃度繪制校準曲線不同，定性檢測通常使用雙水平校準品來確定臨界值。在某些情況下，如對于微孔板EIA而言，臨界值通過重復測定校準品獲得平均值并結合一個預先設定的值（方法確認過程中通過大樣本量測試而來）計算而得。用于抗原檢測的定性分析方法中的校準品，一般通過向合成基質中添加抗原而制備，以降低非特異性結合并實現更好的穩定性；用于檢測抗體的定性分析方法中的校準品，則一般通過向血清或血漿來源的天然基質中添加抗體而制備。陰性校準品（校準品0，通常是基質本身）用于反映系統間差異，通常包含在臨界值的計算公式中。第二個校準品（校準品1）中的抗原濃度或抗體滴度通常處于非常低的水平。如前文所述，臨界值通常是校準品0和校準品1的函數，此函數通過測試大量陰性樣品和弱陽性樣品并形成ROC曲線來確定。同時，為了包容儀器臺間差、檢測日間差以及試劑批間差，臨界值應進行微調。由于臨界值主要由校準品1的信號響應值確定，因此校準品1的穩定性對于試劑的可制造性和結果重復性至關重要。

質量控制的目的是在檢測試劑制造過程中監控產品性能并評估產品質量。對定性檢測而言，質量控制沒有統一的理論（Simonet，2005）。整體而言，質控品應該在成分和性質上類似于臨床樣本，以發現試劑的性能異常，如檢測靈敏度的下降（Garrett，1994）。因此，理想的質控品應使用天然的基質、抗原和抗體進行制備。臨床實驗室改進法（Clinical Laboratory Improvement Act，1988）要求實驗室使用與用于計算臨界值的校準品不同的陽性質控。此外，除了試劑盒中制造商提供的質控品外，一些實驗室還要求使用額外的陽性質控品。QC質控品至少應具備兩個水平，即陰性和陽性質控，并與測試樣本的基質相同。

根據檢測方法原理和獲取陽性樣本的難易程度，可以通過混合和添加陽性人群樣本的方式制備質控品。

（五）抗病毒抗體和親合力測試

眾所周知，在免疫后，由于抗體從IgM逐漸轉換為IgG，因此抗體的親和力隨時間逐漸增強。親合力測試的目的是測量目標IgG與包被在固相載體上的抗原的結合強度。抗體親合力測試可以用于確認定性篩查的結果，以確定是否是近期感染。此外，抗體親合力也可以通過定性檢測來確定。用于抗體親合力測定的定性檢測的設計與常規的定性檢測有些差異，其通常需要增加一個變性的步驟，來表征抗體結合能力的變化。

親合力（avidity）是通過比較變性劑存在和不存在的情況下抗體結合親和力的差異來測定的。高親和力抗體的滴度測定通常需加入離液序列高的表面活性劑，如尿素、SDS、二乙胺或乙醇胺，以去除低親合力IgG。表面活性劑可以預先加入患者樣本或用于固相載體清洗，以緩解低親和力抗體與固相的結合或溫育過程中抗體與固相的結合。之后，通過加入相同的抗人IgG偶聯物，可以得到結合的高親和力IgG滴度。總IgG滴度測定時，通常選擇上述相同的檢測試劑，但無須添加上述表面活性劑。

親合力指數可以通過存在和不存在變性劑的情況下的親合力結果進行計算，公式如下：

通常，50%或更低的親合力指數被稱為低親合力指數。

親合力檢測的方法確認，應當采用包含大量樣本的、充分表征的樣本盤；最終結果會確定親合力臨界值，高于臨界值的結果誤判風險低。

免疫應答的成熟過程因個體而異，因此應謹慎地解釋抗體親合力的檢測結果。對于免疫功能低下或服用藥物（包括一些抗生素）的個體尤其如此，其在弓形蟲或CMV感染后可表現出親合力增強趨勢逐漸減緩的現象（Lefevre-Pettazzoni et al.，2006，2007）。

（六）驗證和確認

毫無疑問，定性分析方法應該進行驗證和確認（Taverniers et al.，2004）。目前定性檢測方法眾多，但用于評估二元性“是/否”響應和相關的定性檢測的系統化方法鮮有報道（Trullols et al.，2005）。在實踐中，驗證和確認策略取決于相關定性檢測方法的使用和設計過程中的具體特點。在驗證和確認之前以及過程中，應當確定不同定性方法中最重要的質量參數。總的來說，定性檢測的主要分析特性與定量檢測類似，因此兩者驗證和確認的要求和規范也是相似的。然而，定性檢測具備一些獨特的特征。

（1）需要對定性檢測方法中的臨界值進行確認，以確保其滿足分析和臨床性能要求。臨界值直接決定了陰性和陽性響應的范圍，對于定性檢測方法至關重要。結果不確定區域的上下限取決于臨界值附近的測量誤差。在確認過程中，樣本的結果應該通過樣本信號響應與臨界值的關系來確定。通常，推薦測試中包含陰性、臨界值附近或陽性的質控品。相關質控品可以通過將抗體人為添加到基質中，以達到目標滴度的方法來制備。在這個過程中，樣本選擇、臨床決定水平和臨界值附近區域十分重要。在臨床應用時，臨界值會決定診斷的結果，因此在方法確認過程中，診斷特異性和靈敏度是主要關注點。

對于定性檢測而言，只有在高于檢測限的濃度時才能獲得定性結果。在確認臨界值時，應提供相關數據以證實其可以有效區分陽性和陰性樣本。確認過程中選擇的樣本，應包含與方法預期用途和建議的臨床應用中相對應的相關疾病人群，且樣本數量應具備統計學意義。此外，一項完整的臨床確認還應考慮不同地域人群的差異。

為了對灰區進行確認，需要準備與臨界值處分析物濃度相近的樣本，包括濃度為臨界值，濃度比臨界值高20%和低20%；其樣本量應足以進行20次重復測試。將每個樣本重復測試20次，計算結果為陰性和陽性的百分比，然后通過分析-20%到+20%的濃度范圍是否在95%置信區間內來評估臨界值是否準確（圖2-5-3）。灰區的理想范圍是在高、低端各95百分位之間。

（2）與定量檢測不同，定性免疫檢測方法在驗證和確認過程中確定檢測的臨床靈敏度和特異性十分重要。臨床靈敏度和特異性的評估是通過將臨界值檢測結果與患者樣本實際情況比對而進行的。如前文所述，高靈敏度通常是定性檢測設計的主要目標。因此，檢測方法在實現高靈敏度同時可能會出現一些假陽性結果，這種情況是可以理解的。對于臨床特異性和靈敏度評估時，建議選擇日常工作條件（如規范的樣本采集和處理流程）對檢測方法的假陽性率和假陰性率同時進行測試。

（3）檢測性能需要通過有效的方法學對比進行評估。理想情況下，新建檢測方法的所有性能評估都應與成熟產品進行直接比較。比對時的樣本選擇應當謹慎，除了明顯的陰性和陽性樣本，還應確保有一定數量的樣本在臨界值附近和處于灰區。測試的結果應根據預定標準，使用定性（是或否）結果的符合率來評估。在某些情況下，使用可量化的S/CO比值變化來評估方法之間的相關性也可獲得有用的信息。如果評估中有不一致的結果，應盡可能對這些結果進行確認，例如：

● 通過在其他測試系統中進一步評估不一致的樣本；

● 通過使用替代方法或標志物，包括親合力測試；

● 通過回顧患者的臨床狀況和診斷；

● 通過測試后續樣本。

定性方法的性能評估通常比定量方法復雜得多。在評估中，引入一組已知分析物濃度的樣本或（如果不能確定樣本濃度）一組通過參考方法或金標準方法確定的具備不同響應水平的樣本會對評估效果有很大幫助。

三、結束語

在世界各地的臨床實驗室中，越來越多定性檢測被應用于不同的場景中。針對定性免疫分析，目前市面上仍沒有系統性專著，本節基于經驗和最佳實踐提供了相關介紹和指引。原則上，定性檢測旨在為樣本定性和分類提供快速、簡單和可靠的“是或否”結果。與定量檢測相比，定性檢測的設計具備自身的特點，尤其是定性檢測中與臨界值確定過程相關的部分。由于定量檢測的分析特性不能直接適用于定性檢測，因此定性檢測必須根據其自身的特點進行確認。

免疫檢測技術的發展十分迅速，相應的需求量也逐年增多。在過去的20年中，定性測試的應用場景大幅增加。亞洲和非洲作為新興市場，傳染性疾病仍然流行，其對于定性檢測的需求也在不斷增長。

血清學檢測通常用來檢測傳染病病原體和對應的抗體。檢測常采用半定量或定性方法，并要求高靈敏度。定性檢測能夠提供快速和明確的結論，滿足用戶相關的需求。在定性檢測的產品設計中，簡明的信息、直接的結果、先進技術的應用以及自動化和小型化將是未來的發展趨勢。

四、參考文獻和進一步閱讀

（吳令嘉、于麗娜　譯，何建文　審）