第一節 競爭性和非競爭性免疫測定（含酶聯免疫吸附試驗）的原理

免疫檢測法是利用抗體獨特性質的高靈敏分析測試方法，是20世紀對醫學和基礎生命科學研究最有成效的技術貢獻之一。免疫學技術，特別是免疫檢測法，為人們提供了一系列精密的生物化學工具，可應用于研究和操控微量的復雜分子。更確切地說，這可能是自然界給予人們研究生物學過程的基礎工具。

免疫檢測法的特性源自抗體的如下3個重要性質：

（1）抗體具有廣泛的結合能力。抗體能夠與天然和人造化學物質、生物分子、細胞以及病毒結合。抗體的本質是蛋白質，其結合位點來源于大量潛在的氨基酸序列組合。每一種氨基酸都有其獨特的結合和空間取向性質，而氨基酸肽鏈的扭曲和折疊可以提供多個結合位點。

（2）抗體與底物結合的特異性。這種優異的特異性確保抗體能夠在大量類似物中檢測出微量的分析物，如常規檢測中可以對血液樣品中皮摩爾（10-12）級別的激素進行分析。

（3）抗體與其靶標之間結合的強度。在免疫檢測中，分析物和抗體通過強非共價作用結合，在后續的檢測和信號產生的階段維持其結合狀態。因此，即使對生物體液中濃度很低的物質而言，免疫檢測也可以獲得準確結果。

自Rosalyn Yalow和Solomon Berson（Yalow和Berson，1959）首次闡述免疫檢測原理以來，免疫檢測方法適用范圍越來越廣泛，而且不斷涌現出新穎巧妙的實驗設計。其中一些設計形成了更靈敏的檢測方法，開辟了臨床研究和診斷的新視野；另外一些設計聚焦簡化對支撐技術的需求，使其適用于自動化。這些技術不僅僅局限于醫療診斷，免疫檢測法已廣泛應用于藥物、獸醫、環境、法醫、軍事和食品科學等領域。在基礎生命科學研究中，免疫檢測法是闡釋基本生物化學現象的重要工具。此外，免疫檢測使用程序的簡化，使用戶能夠在家中便捷地進行妊娠和排卵測試，此類產品以電視廣告的形式被廣泛推廣。

一、抗體-抗原反應動力學

免疫檢測法涉及分析物與至少一種抗體之間的結合反應。這種結合反應受多種因素影響，可能在幾秒到幾小時達到平衡。檢測方法的設計可能從多種方面對平衡時間產生影響。例如，如果抗體被固定在微粒上而非Microtiter?的孔內，那么分析物分子在接觸抗體分子之前的平均移動距離會大幅縮短。此外，pH、離子強度和溫度也會影響反應平衡時間。

每種免疫測定方法的核心都是抗體和分析物之間的結合反應。不同檢測方法間，結合反應的性質可能存在很大差異，這些性質對開發有效的檢測方法具有重要的意義。早期的免疫檢測往往需要溫育過夜，以達到反應平衡。當前的免疫測定方法只需要相對較短的溫育時間，而不要求反應達到平衡狀態。在這些檢測方法的設計中，更重要的是理解抗體-分析物結合反應動力學的一些簡單概念。

抗體和抗原之間的反應以用質量作用定律簡單地描述：

式中［Ag］是抗原濃度；［Ab］是抗體濃度；［Ag-Ab］是抗原-抗體復合物；k_a是結合速率常數，也稱為k_on；k_d是解離速率常數，也稱為k_off。

初看時，人們很難理解為什么動力學由兩個速率常數而非一個常數定義。通過監測不同抗體-抗原的結合反應，可以更好地理解這種區別的重要性。利用生物傳感器技術，可以實時生成分析物與固定在傳感器表面的抗體間的結合信號（參見本部分第九節“表面等離激元共振在結合位點、動力學和濃度分析中的應用”相關內容）。在實驗中，大量緩沖液流過包被抗體的傳感器表面，然后將分析物加入到設備中，與傳感器表面包被的抗體結合。隨著結合分析物增多，反應信號增強。幾分鐘后，以緩沖液取代分析物溶液，便可以觀察分析物與抗體結合的穩定性。圖2-1-1顯示了一種分析物與3種不同單克隆抗體結合過程的信號響應。

3種單克隆抗體與分析物結合速率的差異，表現為三者結合常數的差別。當分析物的供應停止后，會產生不同的后續信號響應。結合速率最高的抗體，其解離速率也最高。如果使用該類抗體進行免疫檢測，在分離未結合的標記物時，如使用緩沖液清洗的步驟中，已結合的分析物會與抗體解離，因此這類抗體對大多數免疫檢測類型不適用。

上述解釋了理解k_a和k_d的重要性。然而，同樣重要的是，我們要認識到式（2-1-1）中的模型代表了過度簡化的一般情況。該模型基于以下假設：

● 抗原由單一分子組成并且以均相形式存在。

● 抗體也處于均相狀態。

● 抗原具有一個可結合的表位。

● 抗體具有單一的結合位點，識別抗原的一個表位。

● 結合應一致，無正或負變構效應（分析物上一個位點與抗體的結合對另一個位點的結合不產生影響）。

● 反應處于平衡狀態。

● 必須從游離抗原中完全分離出結合的抗原。

● 不應有非特異性結合（NSB），如與反應孔壁的結合。

盡管所有這些假設在實踐中不可能完全成立，但質量作用定律為從理論上理解免疫檢測技術的熱力學原理提供了一個有效的框架。

兩個速率常數的比值稱為平衡常數（equilibrium constant，K_eq），表示結合的與未結合的分析物和抗體之間比值，又稱為親和常數（affinity constant）。K_eq是衡量免疫檢測中抗體有效結合能力的關鍵指標。

從式（2-1-1）可以得出，當達到平衡狀態時：

式中K_eq=平衡常數。

代入：

公式重排：

式中［Ab_t］是抗體的總濃度，［Ab］+［Ab-Ag］；［Ag_t］是抗原的總濃度，［Ag］+［Ab-Ag］；［B］是結合抗原的濃度；［F］是游離抗原的濃度。

式（2-1-5）表示［結合］/［游離］抗原的比值與結合抗原的濃度呈線性關系。依據這種關系繪制的圖形稱為斯卡查德圖（Scatchard plot）（Scatchard，1949，圖2-1-2）。

從圖中可以得出兩個實用參數：平衡常數K_eq，即直線的斜率，以及抗體結合位點的總濃度［Ab_t］，即x軸上的截距。因此，可以推斷：

圖2-1-3顯示了在保持抗體結合位點濃度不變的情況下增加平衡常數的效果，圖2-1-4顯示了改變抗體的量但保持平衡常數不變的情況。

需要注意的是，并非所有預估的［B］/［F］和［B］數據點都具有相同的權重。［B］/［F］的比值偏高或者偏低對測量誤差的影響程度可能不同。因此，在構建斯卡查德圖時需要謹慎，以便合理設置抗原濃度從而確保結果盡可能準確。

結合狀態與游離狀態抗原不可能100%分離，而一些殘余的游離抗原濃度可能被計入結合抗原部分。斯卡查德圖中低［B］/［F］比值區域通過結合抗原的截距來估算總抗體的濃度，在這一區域中誤差會對結果產生不成比例的影響，因此非特異性結合（non-specific binding，NSB）需要被盡可能準確確定。

圖2-1-5顯示具有不同平衡常數的多克隆抗體血清的典型斯卡查德圖。此例中的曲線，能夠簡單地將相關抗體分成兩類：高親和力抗體和低親和力抗體。

有時，使用倒數圖（也稱為Langmuir或Steward-Petty作圖法）能夠更加準確地估計抗體濃度。

重新排列式（2-1-3）：

代入：

圖2-1-6展示了一個1/［B］對1/［F］的典型倒數關系圖。

在游離抗原數量足夠多時，抗體完全飽和，即：

在斯卡查德圖上確定最準確的曲線以估計K_eq 的值可能比較困難，對于多克隆抗血清（包含親和力不同的抗體混合物）尤其如此。在這種情況下，平均平衡常數可能是衡量抗體親和力唯一有效的指標。兩種簡單的作圖方法可以獲得抗體平均平衡常數。第一種方法是取抗體結合位點半飽和狀態時的值近似為K_eq。

從式（2-1-2）可知，當抗體結合位點為半飽和時：

以［B］對log［F］作圖，如圖2-1-7所示（使用對數是為了考慮到值的范圍）。在100%飽和狀態的一半處畫一條平行于x軸的直線，過直線與曲線的交點，畫一條垂直于x軸的直線，該直線與x軸交點的橫坐標即1/K_eq的合理平均估值。

第二種作圖方式是Sips圖法（Nisonoff and Pressman，1958）。該方法需要利用斯卡查德圖或倒數圖估計總抗體結合位點。

重新排列公式（2-1-2）：

當：

即處于半飽和狀態時，

可以通過如下二變量作圖：

當：

同時：

該方法如圖2-1-8所示，K_eq表示平均親和力常數的估計值。

常見的抗體平衡常數范圍為106L/mol到1012L/mol。平衡常數小于108L/mol的抗體一般不適用于免疫檢測。需要注意，抗體濃度是針對抗體結合位點的總數。對于小分子半抗原，IgG上的兩個結合位點都可以與抗原結合，即效價（valence）為二。對于一些大分子蛋白質，位阻效應可能會阻止抗體兩個結合位點同時與抗原結合。當抗原是多價時（具有重復表位），分析斯卡查德圖會變得困難。在這種情況下，與每個抗原結合的抗體分子的數量服從泊松分布（Poisson distribution），因此需要更復雜的模型來估計K_eq和［Ab_t］的值。

質量作用定律也可用于預測［B］/［F］比值隨抗原［Ag］濃度（或劑量（dose））增加而變化的情況，即劑量-響應曲線（dose-response curve）。

根據式（2-1-2），結合抗原與游離抗原的比值［B］/［F］為：

游離［Ag］和［Ab］為：

結合抗原與游離抗原的比例可由式（2-1-20）和式（2-1-21）重新排列獲得：

結合式（2-1-2）與式（2-1-19）：

將式（2-1-21）與式（2-1-23）代入式（2-1-24）：

乘以1+［B］/［F］來簡化：

化簡為熟悉的二次方程，ax2+bx+c=0。x的解為：

因此，在K_eq和［Ab_t］都準確已知時，對于任何給定的［Ag_t］都可以計算出對應的［B］/［F］；或者相反，對給定［B］/［F］可以求解對應的［Ag_t］。換言之，通過確定［B］/［F］的比值，可以計算抗原含量。為了確定［B］/［F］的比值，需要分離結合抗原和游離抗原，并確定兩者的相對比例。然而，實際測量結果可以更直接關聯為結合抗原相對于總抗原的百分比，因此使用下式更為方便：

圖2-1-9顯示了典型的結合百分比與［Ag_t］的圖。

如圖2-1-10所示，抗體濃度增加時，結合百分比（%Bd）曲線向右（即向更高抗原濃度 ［Ag_t］的方向）移動。

如圖2-1-11所示，抗體平衡常數K_eq增大時，反應的斜率提升。

二、免疫檢測的設計

多年來，人們開發出了不同設計原理和反應模式的免疫檢測方法。這些設計主要可分為兩大類：第一類設計包含基本原理，主要依據免疫分析技術的基本特性。第二類設計在免疫檢測基本原則基礎上繼續深化，以提高分析精密度，減少孵育時間，簡化技術或使方法更易實現自動化。本節僅討論免疫檢測方法的基本設計。本書第七部分將詳細介紹建立在這些基本原理基礎上的各種設計方案。

（一）競爭法（試劑受限）

由上述可知，在已知平衡常數和抗體濃度的條件下，對于任何給定濃度的抗原，可以計算出結合/游離抗原（B/F）的比值，進而推導出結合百分比。反之，如果測定出結合百分比，可以計算出溶液中的抗原濃度。Yalow和Berson提出的人血清胰島素測定方法是第一種免疫分析方法（Yalow和Berson，1959），其基于上述原理建立。在本書中，這種免疫檢測的模式稱為競爭法（competitive assay）。

確定結合/游離抗原比值需要將溶液中的結合抗原與游離抗原分離，并確定兩種抗原的相對含量。結合抗原與游離抗原的分離可以簡單地通過從反應混合物中分離抗體組分實現；此時抗體-抗原復合物被分離，而游離抗原則被留在溶液中（圖2-1-12）。

在Yalow和Berson開發的方法中，微量的、經放射性標記的125I-胰島素（示蹤劑）被加入到反應體系中。隨后通過監測放射性物質在結合和游離胰島素之間的分布可以確定胰島素在這兩部分之間的分配。實際應用中，K_eq或抗體濃度均難以具備足夠的準確度，因此難以準確推測抗原的濃度。將已知抗原濃度的樣本作為標準品（standards）或校準品（calibrators），根據標準品中抗原濃度可以繪制其結合部分活性占總活性百分比的校準曲線。根據校準曲線可以計算未知樣本中的抗原濃度（圖2-1-13）。

該類檢測方法通常稱為競爭法，但是只有在抗體結合位點完全飽和的情況下才會發生競爭性結合，因此該說法某種程度上存在誤導。競爭法中，抗體結合位點并非完全飽和，標記抗原僅用于評估結合部分抗原和游離部分抗原之間的分配情況。

Ekins將這種檢測方法稱為試劑受限（reagent limited），以與后文中的試劑過量（reagent excess）檢測方法區分（Ekins，1977）。然而，該術語并未長期流行，競爭法這個術語更為直觀，且僅使用一個單詞，因而被最終認可和廣泛使用；相應地，術語試劑過量被免疫計量檢測法（immunometric）代替。

不同的分離和檢測系統被用于競爭法的設計。詳見第三部分“固相和其他分離系統”、“信號產生及檢測系統”兩節以及本部分第二節“均相免疫測定”相關內容。

采用標記抗原的檢測方法在理論和實際應用均存在一定缺點。首先，這類檢測方法的靈敏度主要取決于抗體的平衡常數，但與其他設計方式不同，競爭法難以充分利用抗體的結合潛能。其次，在抗原標記過程中，分析物的關鍵表位可能會被影響或被掩蓋，導致抗體對其識別效果減弱甚至消除。在某些情況下，如果標記位點與半抗原偶聯形成免疫原時位點相同，標記后抗原可能增強抗體的識別效果，這種現象稱為橋聯識別（bridge recognition）。詳見第三部分第一節“抗體”。

（二）單位點免疫計量分析法

1968年Miles和Hales使用標記抗體代替標記抗原設計免疫檢測方法，這是免疫檢測設計中的首個主要進展（Miles和Hales，1968），其基本原理如圖2-1-14所示。首先，樣本或抗原標準品與標記抗體共同孵育；反應結束后，通過加入過量的固相偶聯抗原，將未結合的標記抗體從溶液中除去。

從經驗上講，這種設計有兩種主要的變體，兩者代表這類設計的極端情況。第一種設計變體中，檢測方法與競爭法類似，使用有限濃度的抗體。例如，在游離甲狀腺激素的測定中，標記抗體在溶液中的游離激素和固相結合的激素之間分配，這兩種反應同時發生。有關此檢測方法的配置，請參閱本部分第四節“游離分析物免疫檢測”。

第二種設計使用過量的標記抗體。如果僅從經驗角度考慮，大量標記抗體的存在將使抗原和抗體結合反應完成度高于競爭法（式2-1-1），從而克服后者設計中平衡常數對檢測靈敏度的限制。實際上，檢測方法的靈敏度很大程度上取決于測定目標來自哪一部分，即溶液中與樣本結合的抗體或是通過固相分離提取的抗體。前者的測定在很大程度上受到無免疫活性的標記示蹤劑的影響；后者的測量借助固相分離。當標記抗體濃度較高時，靈敏度取決于能否在兩個較大的測量值之間檢測出非常小的差異，因此后者難以實現。

在實際應用中，使用高濃度標記抗體的單點免疫測定法在靈敏度方面難以對競爭法形成優勢，因此并未廣泛普及。

（三）雙位點免疫計量分析法（試劑過量）

許多蛋白質具有多個表位，而且這些表位在空間上充分分離，使其可以同時與兩種抗體結合。1970年，Addison和Hales依據上述原理最早提出的雙位點免疫檢測方法（Addison和Hales，1970）。兩種抗體的結合可能是依次或同時發生，基本原理如下：首先樣本與捕獲（capture）抗體溫育，捕獲抗體與蛋白上的第一個表位反應并與固相結合。然后清洗固相以除去未反應的組分，并進一步與標記的檢測（detecting）抗體溫育。此時，檢測抗體與捕獲抗體-抗原復合物結合。最后，再次清洗以除去未反應的過量檢測抗體，并最終確定來自固相的信號強度（圖2-1-15）。

典型的劑量-響應（校準）曲線如圖2-1-16所示。如果捕獲和檢測抗體反應尚未完成，那么劑量-響應曲線將接近直線。許多檢測方法都是如此，尤其是低濃度情況。有些檢測方法具備足夠的線性，可以對標準曲線進行單點校準。

該種設計在增加分析方法特異性上具有明顯優勢。例如，糖蛋白激素促甲狀腺素（TSH）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、促卵泡激素（FSH）和黃體生成素（LH）共用一種α-亞基，而各分析物生物特異性是由差別相對較小的β-亞基決定。通過設計特異靶向TSH β-亞基表位的捕獲抗體，可以在樣本中存在大量具有相同α-亞基的hCG的條件下（如妊娠期），特異性捕獲TSH。清洗除去未反應的組分后，采用抗α-亞基的抗體可以檢測結合復合物。隨著具有單一表位特異性的單克隆抗體（monoclonal antibodies）的出現，這種設計類型才真正呈現出實用性。許多雙位點免疫計量分析法采用一步溫育模式，在這一過程中，樣本中的抗原同時與捕獲和檢測抗體結合。

免疫計量分析法也常被稱為夾心法（三明治法，sandwich）。將抗體或抗原包被在固相上，并使用酶標記物進行檢測的免疫計量分析法，也稱為酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）。

（四）檢測方法靈敏度的決定因素

了解有關分析測定方法設計的基本原則是應用的關鍵前提條件。但在免疫檢測技術的概念出現多年后，人們仍未足夠重視其檢測原理。

Roger Ekins是主張基于基本原則設計免疫檢測方法的最主要倡導者之一。在1979年的著作和后來的許多場合中，他對當時免疫檢測設計的實際狀態——許多設計方案基于文獻中重復的出現的經驗概念，以致經驗逐漸被公認為理論表達了失望。

早期免疫檢測方法的性能受到多種現實因素的制約，如抗原分離、純化和標記相對困難，而且難以獲得足夠特異性的抗血清。因此某種程度上，可以理解人們采用經驗方式設計免疫檢測方法。同時，還有一種普遍的想法，當幾個簡單的實驗能夠獲得同樣的結果時，人們幾乎沒有動力去求助于看起來相對復雜的數學公式。

大多數關于免疫檢測的理論分析聚焦于決定測試靈敏度的因素上。高靈敏度是所有分析技術本身需要的性能。事實上，免疫檢測所提供的高靈敏度是（且將持續是）其使用和繼續發展的主要原因。對于某些分析物，如果目標濃度范圍高于現有的靈敏度，更高的靈敏度可能不是必須追求的性能。選擇高靈敏度還應考慮如下因素：

● 更高靈敏度檢測方法可能為以前未認識或無法診斷的疾病提供新的診斷機會。例如，第三代促甲狀腺激素（TSH）檢測方法的發展，為區分甲狀腺功能正常和甲狀腺功能亢進提供了可能（見第七部分第二節“甲狀腺”中“促甲狀腺激素”部分）。

● 高靈敏度方法可以分析更小樣本量或更容易獲得的樣本，如從新生兒毛細血管獲得的血樣或唾液樣本。

● 小樣本量還有另一個重要優勢。很少有免疫測定方法完全不受生物體液中不良因素的干擾。含有等量分析物的不同樣本，可能會測定出不同的結果。樣本在整個反應體系中所占的比例越小，這些基質效應（matrix effects）對測量準確性的影響就越小。因此，高靈敏度分析的結果可能更加穩健。

盡管各種各樣的設計中最佳測定條件和試劑濃度存在差異，但一些結論對于免疫檢測方法設計是普遍適用的。

在任何分析技術中，靈敏度定義為分析物能夠被可靠判斷的最小濃度，或者可以更正式地定義為在沒有分析物的情況下，在統計學上不可能成為信號范圍一部分的分析物的最低濃度。比如，濃度為零時的信號值加上2倍的標準差所對應的濃度值。這個概念廣泛應用于幾乎所有測量領域中：在電子學中，其通常被稱為信噪比（signal-tonoise ratio）。信噪比是與音樂相關的概念，很適合用于描述靈敏度。與盒式磁帶相比，光盤的音質改善并非通過提升音量，而是通過消除背景噪聲實現的。因此，靈敏度取決于兩個因素：分析物存在時的信號增益幅度和分析物不存在時的測量誤差（圖2-1-17）。

Yalow和Berson最初認為競爭法分析靈敏度主要由劑量-響應曲線的斜率決定（Berson和Yalow，1970；Berson和Yalow，1973），因此許多工作人員專注于優化這一參數，而未考慮測量誤差。

然而，Ekins將注意力集中在測量時的誤差上。他駁斥了斜率的影響，認為如果將其繪制在不同的參照系中，如結合物或1/結合物對抗原濃度作圖（Ekins，1979；Ekins and Newman，1970），相同的測試方法會得到不同的斜率，因此關于反應物的最佳濃度會得到相反的結論。Yalow和Berson的論點某種程度上是正確的，其基于結合百分比的斜率分析，因此被測信號的變化率，而非添加反應物的總量，決定了兩種測量方法之間的差異。

任何理論分析都必須結合熱力學和統計學元素，而非單獨使用。需要注意的是，在完全沒有任何誤差的情況下，將不會存在最佳設計。

因此，免疫檢測方法優化可被簡化為兩個步驟：識別誤差來源，以及確定將誤差最小化的合理試劑濃度。

雖然只有數學模型才能給出試劑最佳濃度的定量判斷，但Ekins證明可以通過測量抗體結合位點是否被占用而定性判斷試劑最佳濃度：抗體占用原則（Ekins，1991）。

1.抗體占用原則

所有的檢測方法，不管哪個組分被標記，基本上可以用如下兩種方式之一來描述：測量被抗原占用的抗體結合位點，或間接測量未被占據的結合位點（圖2-1-18）。

在競爭法中，標記抗原結合未被樣品抗原占據的抗體結合位點。在此體系中加入未標記的（樣本）抗原會導致未被占據的抗體結合位點數量減少。

在夾心法中，標記抗體測定被抗原占據的結合位點。因此，從沒有分析物的背景信號開始，測量信號隨著抗原濃度的增加而上升。一般來說，在低背景下測量強信號要比測量兩個強信號之間的差異容易得多。基于這個原因，夾心法理論上具備比競爭法更高的靈敏度。

對于競爭法的設計而言，當標記抗原量相對較少時，加入未標記的樣本抗原后引起的信號變化率更大。

相反，在評估被占據的抗體結合位點時，如夾心法設計，標記抗體的濃度高則結合過程導致的信號變化最大。

在競爭法設計中，標記抗原量較少，因此抗體也需要較低的濃度，以最大限度地減少估計未占據位點時的誤差。由于結合位點的占有率百分比主要由抗體對抗原的親和力決定，所以在設計競爭法時，平衡常數是決定方法靈敏度的主要限制因素。

這些定性分析的結論需要在預估的誤差范圍內判斷。

在競爭法中，標記抗原的濃度趨于零，所以測量誤差非常大。低濃度標記抗原的測定精密度是一個限制因素。

同時，NSB（非特異性結合，non-specific binding）標記抗原的總濃度有關，標記抗原結合百分比低會使得NSB及其誤差與特異性結合相關性加強，因此也值得關注。NSB的變化是造成總體精密度低的主要原因。

總之，競爭法的靈敏度受3個因素的影響：平衡常數、信號測量的精密度和非特異性結合水平（在特異性結合中占很大比例）。在沒有其他因素的情況下，每個因素會單獨占主導地位。如果NSB和測量標記抗原時的誤差不大，可以在初始結合率很低的情況下（如1%或2%）達到最佳靈敏度，這與實踐經驗大相徑庭。在這種情況下，分析的靈敏度僅受殘留誤差（如移液）和平衡常數的影響。當NSB顯著時，需要更高的抗體水平以增加標記抗原結合的百分比，從而提高信噪比。在這種情況下，靈敏度是關于K_eq和非特異性結合水平的函數。最后，如果信號測量時存在顯著誤差，則需要加入大量標記抗原，在這種情況下靈敏度還取決于檢測試劑的比活度（specific activity）。

夾心法中直接測定被占據的抗體位點，情況與競爭法相反。高濃度的捕獲和標記抗體都能保障高比例抗原被結合。因此，隨著抗體濃度逐漸增加，檢測方法的靈敏度也會提高。然而，標記抗體用量增加時NSB也會升高。NSB是標記抗體添加總量的函數，隨著系統中添加更多的標記抗體，NSB及其誤差也隨之增加，并最終達到NSB水平的增速高于特異性結合速率的程度。換言之，信噪比存在一個最大值。最大靈敏度點取決于NSB的水平和其相關誤差，以及低水平信號的測定誤差。

綜上所述，平衡常數在確定夾心法靈敏度方面影響較低，而主要影響因素是NSB水平和NSB不精密度，以及信號的測量誤差。因此，高靈敏分析方法需要與抗原濃度相對應的高濃度抗體、低NSB和高特異性標記。在NSB不顯著時，信號測量誤差是影響靈敏度最重要的因素。當測量誤差和NSB都不顯著時，靈敏度限制因素是平衡常數和其他一些實驗誤差。因此，高靈敏度的免疫分析依賴于實現低NSB和采用高特異性的檢測試劑。

當利用固相分離多余標記抗體，以估算未占據的抗體結合位點時，單位點免疫計量檢測設計可以被看作為競爭法。相反，如果測定溶液中與分析物結合的標記抗體，進而估算被占據的結合位點，這類設計更類似于夾心法。

2.理論模型和定量預測

（1）任何理論優化模型都需要考慮如下變量：

● 抗體平衡常數。

● 抗體濃度（雙位點免疫計量分析法中的兩個抗體都需考慮）。

● 標記抗原的添加量（選擇競爭法時考慮）。

● 樣本和溫育體積。

● 檢測試劑的活性（如放射性檢測中同位素標記試劑的比活度）。

● 檢測試劑的非特異性結合水平。

（2）方法優化還需要建立測量誤差的模型，這些誤差來自于：

● 非特異性結合平均水平的變化。

● 移液器的不精密度。

● 操作誤差（離心、分離、洗滌）。

● 最終信號的測量精密度。

（3）最后需要對反應機制做出假設：

● 雙分子反應，并遵循質量作用定律。

● 所有試劑是均相的，獨立反應且無變構效應。

● 所有反應物在反應混合物中均勻分散。

● 分離過程不會影響平衡。

3.競爭法的設計

兩種不同的方法可用于確定理論分析靈敏度和反應物的最佳濃度。第一種方法是分別評估誤差和劑量-響應（校準曲線）斜率；第二種方法依賴于將誤差與斜率相結合的統一方程。

第一種方法在概念上最簡單，并且給出的值與Ekins（Ekins和Newman，1970）使用的相同標準的響應/誤差方程得到的值非常接近。將試劑濃度的值代入式（2-1-28），得出結合百分比的估計值。然后使用結合百分比來計算未標記抗原添加劑量為零時的信號，以及由于其測定中的誤差之和而產生的標準偏差。以結合百分比計算靈敏度，并將數值代入劑量-響應方程，以確定在極限靈敏度條件下對應的抗原濃度。Borth（1970）和Ezan（1991）提出了類似的方法。

由于移液和其他實驗操作造成的誤差，通常在寬泛的測定條件和反應物濃度范圍內是恒定的。誤差的準確值只能通過實驗來確定。然而，如果以變異系數（coefficient of variation，CV）表示操作誤差，其數值可能處于1%～3%。相反，在低濃度的標記抗原和/或低特異性結合的情況下，結合標記抗原的測量不精密度可能會顯著增加。例如，使用放射性檢測或發光檢測，10 000個累積信號事件的CV將為1%（誤差是總計數的平方根占總計數值的百分比，即100/10 000），而100個事件的CV將為10%（10/100）。NSB的誤差也可能對整體誤差做出很大貢獻，尤其是其在整體結合事件中占比很大的情況下。NSB的平均水平處的變化可能相當大。例如，通過離心分離抗體-抗原復合物時，傾析離心管后剩余的游離抗原量可能存在很大差異。這三種誤差來源需要分別進行評估，然后根據它們的標準偏差進行合并。

分析過程分為以下幾個步驟：

（1）式（2-1-28），如前文所述，可以用來確定任何濃度的反應物的結合部分/游離部分比例。在沒有添加未標記抗原的情況下，平衡常數、總抗體和標記抗原濃度的值可代入方程，并確定［B］/［F］比和結合部分（B_f）：

（2）總信號響應（R_t）可以由抗原的總濃度、比活度、反應體積和信號測量時間來確定：

式中Ag_t是標記抗原的總濃度，單位為mol/L；S是標記抗原的比活度，單位為信號/mol/s（放射性標記的比活度，單位為Bq/mol）；V是反應混合物的總體積，單位為L；T是信號測量的時間，單位為s。

（3）計算由特異性抗體-抗原結合（R_o）引起的信號響應：

（4）由非特異性結合（R_nsb）引起的信號響應可以通過游離抗原占比的函數計算：

式中：NSB游離抗原非特異性結合的部分。

（5）在未添加無標記抗原時，特異性結合信號的標準差僅由實驗誤差（s.d._e）引起：

式中CV_e是由于實驗誤差引起的變異系數。

（6）計算非特異性結合引起的信號響應的標準差（s.d._nsb）：

式中CV_nsb是非特異性結合的平均水平的變異系數。

（7）放射性信號、化學發光信號和熒光信號遵循泊松分布。在沒有未標記抗原的情況下，檢測到的總信號響應是特異性結合信號R_o和非特異性結合信號R_nsb的和。測量的標準差（s.d._m）是總信號響應的平方根：

（8）信號的總組合標準偏差（s.d._a）為：

（9）在沒有未標記抗原的情況下，對應于信號分布95%置信區間（通過單側測試）的信號值（R_det）為：

（10）因此，可以估計靈敏度極限（［B］/［F］_det）下的結合部分比例（B_det）和［B］/［F］比值：

（11）方程（2-1-28）可以重新排列，由其他試劑濃度、平衡常數和［B］/［F］比值給出靈敏度極限下存在的總抗原濃度：

（12）在極限靈敏度下代入［B］/［F］_det可以計算存在的總抗原濃度（標記的和未標記的），因此靈敏度可以推導為：

式中［Ag_det］是檢測限條件下的標記和未標記抗原的總濃度；［Ag_t］是標記抗原的濃度。

上述靈敏度是針對反應混合物而言。如果測定方法的靈敏度為1pmol/L，但樣本被試劑稀釋為1/5，則說明實際靈敏度為5pmol/L。

這些簡單的方程非常有用，可以通過改變反應物濃度和平衡常數來進行“假設”計算。將相關參數代入式（2-1-28）可以得到理論劑量-響應曲線，求解二次方程即可以得到［B］/［F］，進而得到結合百分比。圖2-1-19顯示了平均平衡常數為1×1010L/mol的反應體系中，結合抗原的百分比隨著抗體稀釋倍數變化情況。曲線a、b、c、d和e代表抗原濃度從10-9到10-11范圍內遞減（對應于10/K_eq到0.1/K_eq）。

結合抗原百分比隨抗原濃度的降低而增加。隨著抗原濃度的降低，對于任何給定濃度的抗體，結合抗原百分比趨向于更高的上限。在圖2-1-20中可以更清楚地看到這種現象，其中抗體濃度范圍從10-9到10-11（10/K_eq到0.1/K_eq），而抗原濃度連續變化。

對于任何給定的抗體濃度，增加抗原濃度僅在超過（抗原濃度）臨界范圍后改變結合抗原百分比。臨界值以下的區域，結合比例恒定，抗原濃度的變化對總結合抗體百分比沒有顯著影響。臨界值隨著抗體濃度的降低而降低。對于競爭法而言，使用低濃度抗原時需要對應使用低濃度抗體，以保證添加未標記抗原與已結合標記抗原競爭時能產生可檢測的信號，即處于臨界點右側。

圖2-1-21顯示了當抗體濃度為1×1010（1/K_eq）時，平衡常數對結合百分比的影響。高平衡常數下抗體結合位點的占據比率增加，因此隨著未標記抗原的加入，信號響應的變化率提升。

對于一個給定的平衡常數，標記抗原和抗體濃度降低到何種程度能增加檢測靈敏度，與低信號響應下的測量誤差有關。隨著這些誤差降低，最佳結合百分比降低，最終非特異結合產生的誤差會影響信號測量的精密度。因此，任何給定特異性和非特異性結合的組合都可以確定特定的標記抗原濃度和抗體濃度，以達到最大靈敏度。

通過一個例子可以很好地理解上述結論。假設反應體系的終體積為1ml，抗體平衡常數為1×1010L/mol，其中125I為標記物，計數時長1min，抗原通過1mol/mol 125I標記，比活度為8.02×1016/s（Bq/mol；假定計數器效率為100%）。圖2-1-22由抗體和標記抗原濃度函數繪制，其預測了檢測體系的靈敏度。對該檢測體系而言，最大靈敏度為4.1×10-12mol/L。其一方面與測量不精密度有關，另一方面與質量反應有關。圖2-1-23和圖2-1-24顯示了在平均非特異性結合水平附近5%變異系數的條件下，對應1%或者5%游離標記抗原非特異性結合的效果。降低標記抗原的濃度和增加抗體濃度可以提高特異性結合，并部分彌補非特異性結合增加的影響，從而獲得最佳的靈敏度。即便是試劑濃度進行了調整，當非特異性結合為1%或5%時，檢測靈敏度也會分別降低到4.3×10-12mol/L或5.8×10-12mol/L。

類似地，圖2-1-25到圖2-1-27顯示了在標記抗原特異性更高（1×1023/s個信號事件，即每秒每6個分子中大約有1個可給出檢測信號）的條件下，非特異性結合分別為0%、1%和5%的影響。

如前所述，試劑濃度的重新優化只能部分彌補非特異性結合增加造成的影響：當非特異性結合水平分別為0%、1%和5%時，對應的預測靈敏度分別為2.1×10-12、2.8×10-12和4.5×10-12mol/L。

表2-1-1總結了上述示例中的最優試劑濃度、結合百分比和信號檢測誤差。還顯示了一個基于更“傳統”檢測設計的計算結果，其中標記抗原濃度基于可接受的125I標記信號響應［每分鐘40 000次分裂（dpm）］進行選擇，抗體濃度調整到50%百分比結合的水平（檢測d）。同時，假定非特異性結合為5%。在文獻和市售產品中可以找到許多類似檢測方法設計的案例。

值得注意的是，在沒有任何非特異性結合的情況下，標記抗原和抗體的最佳濃度比傳統上認為的濃度要低得多。事實上，對于某種具備無限比活度的標記，抗體和標記抗原的最佳濃度趨于零，Jackson和Ekins（1983）從理論上證明了此情況下靈敏度為：

式中CV_e是實驗誤差。

在上述的例子中，在沒有非特異性結合的條件下，最大靈敏度是2.06×10-12mol/L，與無限比活度模型下靈敏度預測值2.0×10-12mol/L相近。

如此低濃度的抗原和抗體對應的結合水平遠低于正常水平（通常結合水平需要30%～60%），尤其是在非特異性結合水平可忽略不計的情況下。例如，在不存在非特異性結合（檢測a）的情況下，預測的最佳結合百分比約為11%。

上述的例子可以用來闡釋檢測方法設計中的兩個常見誤區。其一是對劑量-響應曲線歸一化表達式斜率的過度關注，而忽略了實際測量的結果，即信號響應本身。其二是未考慮劑量-響應關系中的誤差。圖2-1-28顯示了檢測c（優化）和檢測d（未優化）的劑量-響應曲線，以熟悉的結合百分比的形式展示劑量-響應關系。

基于傳統的檢測方法設計理念，未優化的檢測d劑量-響應曲線的初始斜率較大，因此可能被認為更敏感。而根據實際測量的數據重新繪制圖形會得到相反的結論（圖2-1-29）。

兩種劑量-響應曲線如圖2-1-30所示，歸一化為結合/零濃度下的結合（B/B₀）形式，并在零劑量下預估出信號響應誤差和靈敏度（優化測定條件下為5.8×10-12mol/L而未優化條件下為10.3×10-12mol/L）。

對于競爭法，信號測量誤差和非特異性結合影響均不顯著，影響靈敏度的主要因素來自實驗殘余誤差和平衡常數。抗體的最大平衡常數約為1012L/mol，假設實驗誤差控制在CV為1%，如果標記物的比活度無限高，那么檢測方法的試劑靈敏度上限為2×10-14mol/L（2×0.01/10-12mol/L）。圖2-1-31顯示了一系列抗體平衡常數下使用3H（1.07×1015Bq/mol）標記，125I（8.02×1016Bq/mol）標記，或其他非無限比活度的標記能達到的最佳靈敏度。

對于K_eq小于1010L/mol的抗體，標記方式從125I變為非同位素標記，對檢測靈敏度而言幾乎沒有優勢。然而，3H標記抗原（過去曾用于類固醇測定）的比活度要低的多。在這種情況下，選擇125I或更高活性的非同位素進行標記將會獲得顯著優勢。上述計算結果強調，對競爭法的優化需要重點關注非特異性結合和實驗誤差，而非檢測試劑。

需要謹慎對待Ekins關于計算競爭法靈敏度的解釋。這些內容經常被文獻引用，但人們并未充分理解其推導過程中使用到的基本假設（Ekins，1991；Gosling，1990）。第一，應當注意，原始計算（Ekins等，1968，1970；Ekins和Newman，1970）針對零劑量時誤差的1倍標準偏差，而非95%的置信區間（2倍標準偏差）。第二，這一理論假定沒有非特定的結合。第三，靈敏度表現在測定反應中，而非樣本中（雖然對樣本而言更有實際意義）。第四，它假定實驗誤差控制在CV為1%內。計算還基于如下假設：標記和未標記抗原處于均相，反應存在單一平衡常數，以及反應保持平衡狀態。在實踐中，幾乎沒有免疫檢測方法符合所有上述假設。

4.夾心法的設計

與競爭法設計一致，兩種方式可應用于建立夾心法靈敏度預測和優化的理論模型。Ekins和他的同事們根據與競爭法相同的反應/誤差之間的關系的概念，推導出了這些檢測方法的劑量-響應關系和誤差的統一模型（Jackson等，1983）。

統一的數學模型復雜，需要簡化假設以得到代數解。另一種方法是上文介紹的用于競爭性檢測的相關方法，其中誤差需單獨考慮，并用于估算與靈敏度相對應的劑量-響應曲線上的信號。然后將信號代入劑量-響應方程，可以確定相應的試劑劑量。在這個模型和Jackson 等人開發的模型中，使用基于兩個結合反應相繼發生的最簡設計而進行計算，其假設如下：

● 第一個抗體連接到固相載體上，與抗原溫育使兩者結合反應達到平衡，然后清洗除去未反應的抗原。

● 將上述完成第一步結合的固相復合物與標記抗體溫育并達到平衡，洗滌除去未結合的標記抗體并測定結合的標記抗體產生的信號。

在理想情況下，夾心法免疫檢測在沒有抗原的情況下就不會檢測到信號。然而，實際上夾心法檢測時仍會有背景信號產生，主要來自：

● 測量儀器本身，假定在給定的信號測量時間內信號值恒定。

● 由于標記抗體的非特異性吸附而產生的信號，假定為總標記抗體的一部分。

因此，在沒有抗原的情況下，檢測體系的總信號R₀可以表示為：

式中M是來自儀器的背景信號，單位為信號事件/s；T是信號測量時間，單位為s；NSB是第二輪溫育中標記抗體的非特異性結合比例。例如0.01代表總標記抗體的1%的結合量；［Ab2_t］是第二輪溫育中標記抗體的總濃度，單位為mol/L；S是標記抗體的比活度，單位為信號事件/mol/s；V是第二輪溫育的體積，單位為L；此外，需要考慮變量中的誤差。

假定信號符合泊松分布，信號的標準差（s.d._m）由累積信號的平方根得出。

分類錯誤會產生誤差，因此實際非特異性結合的部分也會發生一些變化。假定這些滿足正態分布，即：

式中s.d._nsb是分類錯誤產生誤差的標準差；CV_nsb是由于移液和操作錯誤導致的錯誤分類造成的NSB的變異系數。

根據R_o的標準差，可以估計整體誤差：

式中s.d._a是不存在抗原時信號的整體標準差；s.d._e是實驗誤差的標準差。

因此，在靈敏度極限（R_det）下信號水平的增加被定義為：

換言之，信號必須高于儀器背景和非特異性結合總和至少R_det，以提供抗原存在的可靠信號（95%置信區間）。

假設質量作用定律可以應用于固相免疫檢測，已結合標記抗體的濃度［Ab2_b］（這一概念可能并不嚴謹）可以由靈敏度極限下的信號響應、比活度、反應體積和信號測量周期來計算：

從總抗體濃度中減去結合的標記抗體［Ab2_b］的濃度可以得到游離的標記抗體濃度［Ab2_f］：

重新排列式（2-1-2），可以根據平衡常數、結合抗體和游離抗體的濃度獲得總抗原濃度：

代入：

式中［Ag2_t］是第二次溫育中與固相結合的抗原的總濃度；K2_eq是標記抗體的平衡常數。

在檢測的第一階段，通過以上公式可以計算第一個結合反應中所需的抗原濃度，以計算出在第二次溫育中靈敏度極限處的抗原濃度。第一個反應中結合抗原濃度［Ag1_b］與占據的捕獲抗體結合位點的濃度［Ab1_b］相同，并且等于第二個反應中抗原的總濃度［Ag2_t］：

捕獲抗體的總濃度減去結合的捕獲抗體濃度可以獲得第一次溫育中未結合的捕獲抗體濃度：

所以在使用式（2-1-52）之前，需要已知第一次溫育中的抗原濃度，以獲得先前在第二次溫育計算中的抗原濃度。這與測定的靈敏度相對應：

式中［Ag1_t］是第一次溫育中產生特異性信號R_det所需的總抗原濃度，即靈敏度。K1_eq是第一次溫育中捕獲抗體的平衡常數。

將典型數據代入上述公式，可以基于“假設（的數據）”建立模型，從而考察試劑成分和檢測誤差的影響。

夾心法分兩個階段進行，其反應體積通常為0.2ml，因此微量滴定板反應孔的體積也通常選擇0.2ml。

假設捕獲抗體和標記抗體的平衡常數都是1×1010L/mol，信號響應在1min之內檢測，儀器的背景是每秒檢測一個信號事件。同時，對此類檢測而言，根據實際情況，假設非特異性結合占比為0.1%，而由于實驗操作或錯誤分類造成平均水平附近的波動占5%。圖2-1-32顯示了基于檢測抗體和捕獲抗體濃度的方程計算得到的靈敏度，其中檢測抗體用1mol /mol 125I標記（比活度8.02×1016Bq）。

夾心法免疫檢測有兩個主要特征。首先，最高的靈敏度對應于標記抗體的最適濃度。抗體濃度過高時，非特異性結合增加的程度高于特異性結合增加的程度，即信噪比（signal-to-noise ratio）降低。與此相反，低濃度的標記抗體對應的信號測量和質量作用因素都會增大誤差，限制反應的靈敏度。其次，反應靈敏度取決于標記抗體濃度而非捕獲抗體濃度，所以在上述假設中捕獲抗體濃度大于1×10-9mol/L時幾乎不會影響靈敏度。對于上述測定條件，最適標記抗體濃度為1.24×10-10mol/L時，最高靈敏度趨近于5.5×10-14mol/L，比靈敏度極限的抗原濃度高2 000倍。為簡單起見，在隨后的實驗中假定捕獲抗體的濃度為1×10-6mol/L，該濃度下捕獲抗體足以在第一次溫育過程中結合幾乎全部的抗原。Jackson等（Jackson等，1983；Jackson和Ekins，1983）做出了類似的假設，以簡化統一的劑量-響應/誤差關系模型。

下面依次分析能夠影響靈敏度的限制因素。圖2-1-33顯示了達到最高靈敏度時，標記抗體的平衡常數對所需標記抗體濃度的影響。

對于任何給定的標記抗體濃度，增加平衡常數會增加劑量-響應曲線的初始斜率，因此靈敏度也隨之增加。

當K_eq從1×1012L/mol降至1×108L/mol時，最適標記抗體濃度從1.1×10-11mol/L增加到1.3×10-9mol/L，伴隨著相應靈敏度從1.9×10-14mol/L降低到1.3×10-12mol/L。

對競爭法的理論分析表明，增加標記試劑的比活度對提高檢測靈敏度具有一定局限性，特別是在平衡常數低于1×1010L /mol的情況下更加明顯。對于夾心法來說情況相反（圖2-1-34），當比活性從1016增加到1021，夾心法的靈敏度從大約2.2×10-13增加到1.0×10-14。可見，夾心法中標記抗體的最適濃度隨著比活性的增加而降低。

圖2-1-35顯示使用125I標記抗體，將非特異性結合水平從1%改變至0.000 01%時的情況。可見，夾心法標記抗體的最適濃度隨非特異性結合的降低而增加。

Jackson和Ekins證明（Jackson和Ekins，1983）在沒有信號測量誤差（無限比活度）的情況下，夾心法的靈敏度極限可用以下關系來描述：

式中K₃是非特異性結合分數（上文使用的術語NSB表示）；CV_nsb是零抗原濃度下反應的相對誤差；K₂是標記抗體的平衡常數。

例如，給定抗體親和力為1×1012L/mol，非特異性結合為0.1%和信號響應的誤差為1%，代入方程可計算最高靈敏度約為2×10-17mol/L，比具有同等條件下競爭法的最高靈敏度高3個數量級。

圖2-1-36（a）和圖2-1-36（b）總結了夾心法設計中涉及決定靈敏度中的各種影響因素，與競爭法的呈現形式類似。圖2-1-36（a）顯示了使用125I標記抗體，在最大結合量為1mol/mol時，不同平衡常數下非特異性結合水平與靈敏度的關系。圖2-1-36（b）展示了是在1×1023信號事件/（mol·s）比活度時，不同非特異性結合水平下標記抗體平衡常數與靈敏度的關系。

與競爭法不同，夾心法中使用比125I活性更高的檢測系統，特別是與高親和力抗體同時使用時，具有明顯優勢。因此為尋找更靈敏的標記和檢測系統提供了主要的動力。

5.理論模型的適用性

抗體-抗原反應的熱力學理論模型可以用于確定合適的反應條件和試劑濃度以達到最高靈敏度，但這些模型依賴于相關反應遵循一階質量作用定律的假設，以及關于誤差來源和強度的其他假設。因此，盡管可以將通過理論計算得到的試劑濃度作為起始濃度，但任何免疫測定技術的最終優化結果都必須通過實驗來確定。

理論建模的主要成功之處在于確定了在每種檢測設計類型中影響靈敏度的關鍵因素，并因此重點聚焦于最有利于提升靈敏度的組分和測定過程優化中。深入理解相關原理可以推動新型檢測設計的開發和發展，如Ekins（1991）提出的環境溫度分析物免疫測定（ambient analyte immunoassay）（參照“環境溫度分析物免疫測定”，該部分未譯，有興趣的讀者可參考原書——譯者注）概念，該方法通過在“微量測定盤”上使用小體積、離散抗體點來同時測定多種分析物，實現對環境濃度下分析物的采樣和分析。

另一方面，理論建模可以作為培訓和教育的手段。希望本節中給出的方程和模型足夠詳細，以便用于演示免疫檢測設計的一些基本原理。許多公式的推導更加巧妙但相對復雜。選用相對簡單的公式有兩方面原因：第一是為了讓讀者更容易理解推導邏輯和數學處理過程，第二是相比于復雜方程，簡單的公式更容易正確地放置于電子表格中。通過構建簡單的模型，讀者對不同組分的濃度和抗體親和力的影響可以進行“假設”性測試，并且很容易得到結果，如繪制劑量-響應曲線。以本人（譯者注：原章節作者Chris Davies）的經驗來看，這種用電子表格模型進行的訓練或實驗具有很高價值，它們可以補充并強化免疫檢測方法優化的理論，此外也可以有效應用于實際方法設計中。

通過上述模型可以計算出沒有未標記抗原時信號響應的誤差，并由此得出零劑量時的精密度。在上述方程中簡單地添加一個未標記的抗原項，便可在劑量-響應曲線上預測不同點的誤差，由此可以分析檢測方法在整個抗原濃度范圍內的理論精密度情況（Ekins，1983；Jackson et al.，1983）。

（五）抗體的定性檢測和定量分析

以上大部分討論都集中在使用抗體來測量抗原。抗原分析基于抗體是否與抗原相連，抗體分析同樣如此，只是描述變為抗原是否與抗體相連，因此免疫檢測法也可以用來分析抗體。抗原檢測設計時相應的熱力學和統計學概念同樣可以應用于抗體檢測的設計中。然而，在抗體檢測設計和結果解釋方面仍有一些重要事項值得關注。

● 與抗原檢測不同的是，抗體檢測評估的并非抗體濃度，而是抗體活性，即功能結合位點的濃度及其親和力的組合。從臨床角度來看，生物活性可能比質量濃度更重要。不同的抗體檢測設計中，親和力和濃度對方法性能貢獻不一致，增加了結果解釋的難度。例如，使用夾心法設計時，可以添加足量的抗原來結合大部分抗體。在這種情況下，劑量-響應更多地反映抗體的濃度而非親和力。與之相反，競爭法中結合的程度更多的受到抗體親和力的影響。因此，對同一樣本使用不同設計類型的方法進行分析時，即使每個檢測方法都采取相同的國際參考制劑進行標準化，也很少能得到相同的定量結果。

● 在表位識別和親和力方面，循環抗體具有高度的異質性。與細菌或病毒的裂解物相比，使用純化或重組的抗原進行測定通常會得到不同的定量結果，偶爾也會有不同的定性結論。此類檢測結果并沒有很好地與基于整體裂解物的臨床資料進行關聯，因此其檢測特異性的增加是否無用，或者臨床解釋是否應該為了此類檢測提供的微特異性而改變，均存在爭議。對于診斷檢測產品的制造商來說，有時改變測定方法以反映既定的結論比試圖改變（有可能改善）臨床解釋更容易。

● 一定比例的循環抗體，特別是在感染的急性期，可能已經與抗原結合。因此，另一個需要考慮的因素是抗體的預飽和程度。

● 交叉反應性可能是檢測特定同型抗體的一個主要問題。特別是在過敏測試中，IgG可能干擾IgE的結合。

常規抗體檢測使用如下設計方式。

1.液相檢測

液相檢測（liquid-phase assays）是最早應用于抗體活性測量的定量檢測形式，它與液相競爭法測定類似。標記抗原與稀釋后的患者血清抗體結合，由此產生的免疫復合物或總抗體通過物理或免疫技術沉淀。然后，測定沉淀復合物的信號。在早期的檢測中，沉淀復合物通過放射性信號進行檢測。與競爭法不同，抗體液相檢測的劑量-響應曲線隨抗體活性的增加而升高。

液相檢測方法現在很少使用，絕大多數免疫檢測方法通過某些種類的固相載體對結合和游離抗體進行分離，而后進行分析。

2.固相免疫測定

抗體固相免疫檢測通常包含四種主要類型。第一種是在競爭法抗體檢測中，樣本中的抗體與標記抗體競爭性結合吸附在固相上的抗原。與競爭法抗原檢測類似，這種方法的劑量-響應曲線會隨著樣本中抗體活性的增加而下降（圖2-1-37）。

這類檢測方法的一個主要缺點是需要保持固相表面抗原數量均勻，但某些抗原與固相的組合可能難以實現。針對這一問題，人們通常選擇中間體將抗原和固相進行連接。這種技術通常選擇特異性抗體包被在固相表面，并通過抗體作為橋連分子識別抗原的非關鍵表位，從而將抗原均勻固定在固相載體上。該方法可以對純度有限的抗原進行有效純化。此外，還可以通過生物素化抗原和鏈霉親和素包被的反應板進行橋連。此時，該方法只需要一種被包被的固相載體，而且生物素化抗原可以在溫育開始時添加而不需要預包被。

第二種設計基于夾心法，即捕獲橋接法（capture bridge assay），可以利用抗體的多價特性來進行檢測。該方法利用樣本中的抗體將固相表面包被的抗原與溶液中標記的抗原連接起來（圖2-1-38），從而進行檢測。

在同步溫育的情況下，過多的抗體會掩蓋固相抗原和標記抗原的表位，并影響兩者之間的連接，即高劑量鉤狀效應（high-dose hook effects）（參見第四部分第三節“免疫檢測中的干擾”）。在連續溫育的情況下，微量的抗體濃度可能與固相抗原發生雙價結合，因此結果可能被低估。

與抗原檢測類似，這兩種檢測方法的靈敏度是由抗體親和力決定的。如果抗體親和力較低（常見情況），那么只有很少量的抗體會與固相結合。如果用新的固相重新測定這種方法的上清液，難以確定新情況下信號更高或更低，即其攝取量太小，無法與樣本中所含的樣本量比較。因此，這些技術雖然確實在簡易性和通量方面有一定優勢，但可能不具有應用所需的靈敏度。此外，這些設計都不是同種型特異的。

第三種是最常用的夾心法抗體檢測形式，首先將樣本抗體與包被在固相上的抗原結合，洗滌去除未反應的組分，然后在第二次溫育時用同型特異性的標記二抗檢測被結合的抗體。如果將固相抗原作為捕獲試劑（圖2-1-39），這種設計可類比為抗原的雙位點夾心法（ELISA）。

當免疫球蛋白的某種亞型活性占主導地位時，可能會抵消或增強其他亞型的活性，如在過敏檢測中IgE是占主導地位的亞型。通常，過敏的患者對相同抗原會產生IgG抗體。IgG的數量可能遠高于IgE，并且伴隨著親和力成熟的過程，IgG對抗原親和力通常比IgE更高。當試圖區分急性感染（檢測IgM）和既往感染（檢測IgG）時，也需要考慮類似的因素。

第四種設計為捕獲法（class-capture assay），可以滿足同型特異性的要求（即使存在大量的具有交叉反應活性的同型抗體）。在捕獲法中，包被在固相上的同型特異性抗體首先捕獲目標的抗體類型。清洗后，通常采用兩種方法進行檢測，即直接法和間接法。在直接法中，加入標記抗原進行定量測定結合抗體。在間接法中，加入未標記抗原，然后用特異性標記抗體檢測對應抗原。后一種方法更為復雜，但具備一定程度的免疫純化，這對于抗原純度不足情況尤為重要（圖2-1-40和圖2-1-41）。

與抗原夾心法免疫檢測類似，抗體夾心法檢測的靈敏度主要受抗體親和力和非特異性結合量的影響。然而，在抗體檢測中，決定靈敏度的主要因素之一是固相表面功能表位的密度。

統一的熱力學和統計學模型對抗原免疫檢測設計有很大的幫助，而在抗體免疫檢測領域的應用卻很少得到重視。抗體免疫檢測的設計通常以經驗判斷和實驗優化相結合。這是因為抗體檢測中還需要考慮下列更加實際的因素：

● 臨床需求，即該檢測方法主要用于定性檢出還是定量測量抑或是監測濃度變化。

● 抗原的可用性、純度、穩定性和批間差。

● 抗原是否能直接標記，而不影響抗原關鍵表位。

● 抗原直接或間接與固相結合的難易程度，以及結合時是否會影響抗原表位的呈現。

有關抗體免疫檢測方法的深入介紹，請參閱本部分第六節“傳染病相關抗體的檢測”相關內容。

（六）固相免疫檢測的考量要點

固相免疫檢測法的普遍使用引入額外的復雜性，尤其是在理解抗原-抗體相互作用的熱力學方面。固相分析與液相分析在兩個方面存在差異，一是抗原或抗體包被在固相表面時的反應性；二是液相反應和固相反應的動力學差異。

1.表面固定化的影響

在抗原與抗體吸附或偶聯的過程中，固相不應被視為被動組分。雖然蛋白質可能與固相進行化學偶聯，但許多固相免疫檢測仍依賴于非共價吸附。盡管人們對吸附過程不甚了解，但幾乎可以確定固相吸附主要由疏水作用驅動。考慮到天然狀態下，大多數親水基團趨向位于蛋白質的外部，疏水基團趨向位于蛋白質的內部，因此疏水基團結合到聚合物表面時會不可避免的導致吸附蛋白質的構象發生改變。這種現象可能是有益的。在吸附前將抗體短暫地暴露于低pH甘氨酸緩沖液中，會使抗體的疏水性增加，增強其在聚合物表面的吸附率。

抗原在固相表面包被時可能會因為吸附過程構象變化（空間結構隱藏）或者關鍵表位偏疏水（關鍵表位吸附在固相表面），而導致關鍵表位的丟失。構象的變化也有可能會暴露之前被隱藏的表位。微觀上，聚合物表面并不像圖片中呈現的那樣光滑，空間的限制可能在確定反應動力學時起主要作用。

抗體也會產生構象變化，這不僅影響活性結合位點的數量，還影響其對抗原的親和力。在溶液中與抗原結合良好，但固定化后與抗原結合變差的抗體并不罕見；單克隆抗體比多克隆抗體更易受到影響，這可能由于后者中抗體多樣性更高所造成。

2.動力學上的約束

免疫檢測設計理論模型中，通過多種假設保持質量作用定律的簡化。大多數假設對液相免疫檢測的影響并不大；相比之下，許多假設對于固相免疫檢測不適用，如濃度的概念。所以對于固相免疫檢測而言，需要應用新的約束條件，并提出不同的假設。

對于多數固相檢測來說擴散是一個限制因素。結合速率常數取決于周圍介質的黏度和對于反應物（大小相同且具有一致反應性）而言的最小幾何因子。擴散不受抗體結合位點與抗原表位之間結合強度的影響。當反應物大小不同時，結合速率常數會增加；對于結合位點數量有限的反應物，結合速率常數會降低。沒有持續混勻時，擴散僅受分子大小及溶液黏度的影響，抗體與半抗原分子之間的結合速率常數通常為1×109/（mol·s）數量級（Stenberg和Nygren，1988）。大多數結合速率常數小于這一數值。Stenberg和Nygren提出在方程式中引入附加項，即黏附系數（sticking coefficient），以此來反映抗原和抗體僅在兩者取向正確時才能夠結合。當其中一個組分與固相結合時，黏附系數可能會徹底變化，使得結合速率常數顯著降低。

固相邊界層（boundary layer）會抑制正向反應速率，從而限制達到平衡的時間。在固相表面，抗原會被結合的抗體快速消耗，而抗原的補充受擴散的限制。因此需要在本體溶液、邊界層和固相結合抗原之間形成近似的穩態（圖2-1-42）。

在邊界層中，抗體的局部濃度非常高。因此，固相解離動力學與在游離溶液中建立的解離動力學可能完全不同。已有研究表明，固相表面吸附抗體上的結合反應基本上是不可逆的。這并不意味著平衡常數本身增加；相反，它反映了解離的抗原從局部高濃度抗體“逃逸”的概率低。

另一個有趣的效應與抗體分子吸附到固相時的空間取向有關。通常，人們認為固相表面是均勻的，因此結合的抗體也會均勻地隨機分布在固相表面。然而事實并不完全如此，有證據表明抗體可能形成分形簇（fractal clusters），即固相表面形成高度有序的抗體“島”，這個過程類似于晶體結構形成和生長的過程（圖2-1-43）。

在物理化學領域，新近發展的異相分形動力學理論（theories of heterogeneous fractal kinetics）在展示固相表面的復雜反應動力學方面發揮了重要作用，并發現了一些非常規現象，如基本雙分子反應的分形排列、反應物的自排序和自離析、雙分子速率系數的時間依賴性等（Kopelman，1988）。同樣的復雜的動力學在固相免疫檢測中也可能起作用。抗體分形簇的緊密排列性質可能導致明顯的正協同效應：的確有證據表明固相免疫分析中的結合速率常數是可變的（Werthen等，1990）。抗體簇極高濃度的抗體可以有效地防止解離的抗原離開局部環境。因此，觀察到的分形簇中的抗原解離速率常數將遠低于游離在溶液中的解離速率常數，這在一定程度上解釋了固相吸附抗體與抗原的結合所表現出基本不可逆的現象。

（七）實驗和理論免疫檢測性能的比較

免疫檢測相關文獻中一個主要的問題是，比較各種檢測設計類型的性能特征，尤其是評估靈敏度時，缺乏標準化的術語和實踐。體積、溫育時間、重復次數、信號檢測的整合時間等區別都可能導致同一檢測中宣稱靈敏度的顯著差異。因此，很難基于文字報道對不同檢測方法進行比較。

然而，確定理論預測是否可以定量地轉化到實踐中十分重要。如果理論和實踐有本質的區別，那么理論的基本假設很可能是錯誤的。如果理論和實踐存在定量差異，那么可以對理論模型進行數值優化。

對于如下條件：平衡常數為109～1011L/mol的抗體、比活度高標記抗原、1%實驗誤差，理論模型［式（2-1-44）］預測其靈敏度范圍為0.2～20pmol/L。Gosling（1990）回顧了一些最靈敏的類固醇檢測方法。這些方法全部使用125I或過氧化物酶進行標記，而最靈敏的方法采用固相結合抗體，其非特異性結合的誤差可以最小化。這些檢測方法宣稱的靈敏度范圍為4～9pmol/L，處于在理論預測的范圍內。

在競爭法設計中，理論與實踐之間在一定程度上保持一致。這可能由于使用固相和非同位素檢測系統，一方面在于它們具有低檢測誤差和低非特異性結合的內在優勢，另一方面在于它們對更“傳統”的分析優化方法的限制。許多種競爭性放射免疫檢測法，由于傳統原因以及客戶對診斷公司的期望和要求，可以達到30%～50%的零劑量結合率和高信號。對固相、非同位素檢測中的結合百分比難以估計：它們對研發專家和客戶都是未知的。擺脫了這些心理上的約束，檢測方法的優化可以專注于其他方面，比如誤差最小化，這正是Ekins在理論基礎上提倡的路線。

夾心法免疫檢測的最高靈敏度主要由實驗誤差決定，而實驗誤差又會有一定程度的變化，因此其無法估計。目前從已發表的文獻中很難獲得關于誤差的詳細細節，以估計實際靈敏度與理論靈敏度的一致性。然而，對于常見的抗體，可以假設非特異性結合最低為0.1%，非特異性結合中的誤差最低為1%，并且使用無限高比活性的標記物，那么檢測方法的最高靈敏度為0.20～20fmol/L，抗體親和力范圍為109～1011L/mol［來自式（2-1-56）］。應用該理論開發超敏免疫檢測的示例請參見“數字ELISA測定單個蛋白質分子”一節。

精確測定極低濃度的TSH具有重要的臨床意義。因此，如此多的關注都集中在提高TSH檢測的靈敏度上就不足為奇了。Thonnart（Thonnart et al.，1988）和McConway（McConway et al.，1989）等回顧了14種市售高靈敏TSH檢測方法的性能：各TSH檢測方法宣稱的靈敏度為0.005～0.1mIU/L，其中最靈敏的是非同位素分析方法。人類TSH的活性為5IU/mg，相對分子質量為28 000Da，因此上述靈敏度范圍可轉換為35～714fmol/L。Cook和Self（1993）介紹了一種使用酶放大和熒光檢測技術的胰島素原檢測方法，靈敏度為17fmol/L。假設非特異性結合率為0.1%，報道的靈敏度可能處于理論預測值的數量級之內。Rissin和Walt（2006）以及Rissin等（2010）最近證實，數字ELISA免疫檢測的靈敏度能夠達到阿摩爾（attomole）級別，（參見第二部分第十節“數字ELISA方法測定單個蛋白質分子”）。

目前已經開發出極其靈敏的檢測系統，所以為了獲得更高密度的活性抗體和更低的非特異性結合率，了解和優化這些系統的表面化學結構可能大有益處。此外，更復雜的理論模型，尤其是考慮到固相反應動力學和液相反應動力學之間差異的模型，可以使人們更好地理解固相界面動力學的基本性質，并可能有助于設計更加靈敏的檢測形式。

三、參考文獻

四、進一步閱讀

（黃晶、楊廣民　譯，何建文　審）