第二節 免疫檢測入門簡介

免疫檢測利用試劑識別樣本中的微量分析物并產生信號，從而進行測試。比如，免疫檢測類似于用磁鐵在水里收集鐵屑。我們把一個磁鐵固定在繩子末端并置于水中，水中的鐵屑會被吸引到磁鐵上。在免疫檢測中，抗體（antibody）代替了磁鐵用于捕獲分析物，固相基質代替繩子用于固定抗體。抗體具備很高的選擇性，可以在復雜的樣本體系中識別目標分析物。通常樣本中的目標分析物濃度極低，僅僅捕獲它們仍難以得到檢測結果。因此，人們引入另一試劑來識別被捕獲的分析物并產生信號。在不同分析物濃度下，免疫檢測中信號強度存在差異，通過對信號的強度水平進行測量和計算即可反映出待測分析物的濃度。

免疫檢測具有特異性強、靈敏度高和設計靈活的特點，這些優勢源自試劑中抗體具有的以下優點：

● 抗體能夠廣泛地識別天然或人造的各類物質，如化合物、生物分子、細胞、病毒等。

● 抗體針對結合的目標物質具備優異的特異性。

● 抗體與目標分析物的結合具備一定強度。

抗體可通過對目標動物體內接種抗原產生，這一過程被稱為免疫接種（Immunization）。

一、免疫計量法

免疫檢測中最簡單的設計是免疫計量（Immunometric）法（圖1-2-1）。在此類檢測中，一個抗體被固定在塑料表面（如微孔板中的樣本孔），用于從樣本中捕獲（capture）分析物；另一個抗體，特異性識別分析物的另一結構并用于構建信號生成系統（signal generation system）。后者被稱為“標記”抗體，如放射性同位素是一種常見的標記物。在檢測過程中，標記抗體識別并結合目標分析物，而未結合的標記抗體通過清洗被洗脫。檢測體系中被保留的標記抗體會產生信號，信號強度與樣本中分析物濃度存在一定的比例關系，通過對信號的測量即可實現對分析物濃度的測定。

免疫檢測中被標記并產生信號的成分通常被稱為示蹤劑（tracer）。在檢測中通過清洗可以有效地去除未結合的示蹤劑，即分離（separation）。分離的效果對檢測結果的準確性至關重要。免疫檢測中固定抗體的材料稱為固相（solid phase）載體，其中以塑料材質最為常用。在免疫計量分析法中，捕獲抗體、分析物和標記抗體形成 “三明治夾心”結構，因此該方法也稱作夾心（sandwich）檢測法。

與之類似，當待測物為血樣中的抗體時，人們選擇合適的抗原作為“誘餌”對分析物進行捕獲，這種設計廣泛應用于感染性疾病的檢測。如病毒表面的抗原可以被固定在塑料基質上，固定的抗原可以識別并捕獲血樣中由病毒誘發產生的人源抗體。已捕獲的待測抗體可被標記的動物抗人抗體所識別，從而產生信號（圖1-2-2）。通常這一類動物抗人抗體稱為第二抗體，即二抗（second antibody）。

除了放射性同位素，酶（enzyme）也可以通過化學方式與抗體偶聯（conjugate）作為示蹤劑（圖1-2-3）。酶與抗體類似，也是能夠與特定目標分子結合的蛋白質。同時，酶具有催化特性。酶催化反應中的起始原料稱為底物（substrate）。酶與合適的底物分子進行催化反應時，能夠產生顏色、熒光、化學發光等信號，這些信號可以被光學或電子設備測定。每一個酶分子可以催化眾多底物分子產生高強度信號，使檢測系統具備高靈敏度。采用酶標記物為發光源的免疫檢測的分析方法稱為酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

二、競爭法

免疫計量法適用于大分子檢測，待測物需具備足夠表面積并可同時被兩個不同抗體分子所識別。但是當待測物為小分子時，如藥物分子，則通常選擇競爭性（competitive）免疫分析法（簡稱“競爭法”）（圖1-2-4）。競爭法通常只采用一種抗體，且在反應體系中抗體數量相對于待測物質數量是有限的或不足的。示蹤劑通過標記目標分析物的類似物進行制備，其能夠產生待測信號，如放射性同位素或酶。示蹤劑與樣本中的待測物共同競爭有限的抗體位點，被捕獲示蹤劑的數量與樣本中分析物的濃度成間接比例關系。在競爭法中，固定化抗體和示蹤劑的準確數量至關重要，這類檢測有時也稱為試劑限量（reagent limited）。與之對應，夾心法（三明治法）免疫檢測則稱為試劑過量（reagent excess）。

抗原（antigen）是指能夠引起機體抗體響應的物質。在免疫檢測中，與抗體結合的物質也被稱為抗原。在競爭法中，有時待測分子過小無法引發動物體內的抗體響應，常引入化學手段將其與較大分子連接（偶聯）以產生抗體。在偶聯物的刺激下，動物體內也會形成可以識別游離小分子的抗體。這種需偶聯才能在動物體內形成抗體的小分子稱為半抗原（hapten），使動物產生免疫反應的游離分子或偶聯分子稱為免疫原（immunogen）。

三、均相免疫檢測

上述免疫檢測均需要在信號檢測前去除未結合的示蹤劑，因此這類方法稱為非均相（heterogeneous）免疫檢測。在非均相免疫檢測中，通過對體系中未結合示蹤劑的有效分離（如在信號產生之前用緩沖液對固相進行徹底的清洗）使檢測信號隨樣本濃度變化。與之對應，另一類免疫檢測無須分離操作，示蹤劑僅在與免疫計量中分析物結合后或與競爭法中抗體結合后才可產生信號，稱為均相（homogeneous）免疫檢測（圖1-2-5）。

四、定標

免疫檢測過程中產生的信號與分析物濃度成比例關系，采用標準曲線（standard curve）匹配上述比例關系用于分析物定量的過程稱為定標（calibration）。標準曲線通過一系列測試而建立。標準曲線建立時采用與樣本分析時相同的方法進行測試，樣本選擇由已知分析物濃度樣本稀釋形成的具備濃度梯度的樣本。在商品化檢測試劑盒中，標準曲線通常由用戶對一組預先標定濃度的溶液進行檢測而獲得。這些溶液稱為校準品（calibrators），使用校準品產生的曲線稱為校準曲線（calibration curve）。

通過標準曲線或校準曲線獲得分析物濃度的免疫檢測為定量（quantitative）檢測。另一類免疫檢測無須得到準確定量結果，僅需判斷樣本中是否含有待測分析物，即定性（qualitative）檢測，如指示尿樣來自懷孕婦女或非懷孕婦女。妊娠檢測為日常生活中常見的定性測試。

五、小結

為了更深入地了解免疫檢測，讀者可參閱第一節“如何使用本書”，以確認免疫檢測構建形式、組成成分、應用領域等具體信息的書內位置。

（張軼　譯，何建文　審）