第十七章　受體放射分析

放射配基結合分析直接測定配基和受體的復合物，方法較簡便，敏感性高，特異性強。如果放射性標記配基制備恰當，可以不改變原有配基的親和力。因此用途廣泛，有些方面如受體數量的測定是迄今為止其他方法無法取代的。

第一節　受體和配基結合反應的基本規律

受體和配基的可逆性結合反應決定了它們服從可逆性化學反應的質量作用定律（mass action law）。設配基和受體的初始濃度為LT和RT，反應一段時間后部分配基和受體結合成復合物，其濃度為RL，未結合的（游離）配基和受體濃度減少到L和R，形成復合物的速率為v₁，其結合速率常數（association rate constant）為k₁。因為是可逆反應，RL又要解離成R和L，設解離速率常數（dissociation rate constant）為v₂，其解離速率常數為k₂。于是按照質量作用定律，有如下關系式（公式17-1）：

其中 v₁ = k₁ × R × L，v₂ = k₂ × RL。當反應達到平衡時，v₁ = v₂，于是 k₁ × R × L = k₂ × RL，習慣上把k₁/k₂稱為平衡結合常數KA（equilibrium association constant），也稱平衡親和常數（equilibrium affinity constant）。其倒數k₂/k₁則稱為平衡解離常數KD（equilibrium dissociation constant）。在受體研究領域中常用KD來反映親和力（affinity）的大小，KD越大親和力越小。因為配基和受體的初始濃度LT和RT分別有一部分變為RL，所以L = LT - RL，R = RT - RL，所以有以下等式（公式 17-2）。

不論用放射配基結合分析解決什么問題，有兩個共同性的問題必須先行處理好。一是測定到的復合物放射性，稱總結合（total binding，TB），包括配基和受體的特異結合（specific binding，SB）及非特異結合（nonspecific bind，NSB）兩部分，必須將TB減去NSB得到SB，才代表受體的特異結合。二是實驗測定的是復合物的放射性，需要將放射性換算成受體的量（通常以mol數表示）。

NSB由標本中的雜蛋白及分離復合物的材料引起，屬低親和力、高容量，故隨LT增加而線性上升，不被非標記配基取代。如實驗時作平行管，管內除放射配基和受體外還加100～1 000倍濃度的非標記配基，則該管內的SB絕大部分被非標記配基取代，而NSB不被取代，故該管測得的放射性代表NSB。相應的TB管放射性減去NSB管放射性就是SB（圖17-1）。

SB的放射性實際上來自配基，單位是cpm，所以可先按公式17-3換算成配基的mmol數。

多數受體和配基以1∶1的比例結合，則配基的mmol數亦即受體的mmol數。如果一個受體分子結合兩個分子配基（如煙堿樣膽堿受體），或者兩個受體分子結合一個分子配基（如生長激素受體），則再按該比例計算受體量。如再除以管中的細胞數或蛋白量，就是通常所謂的受體密度。蛋白量需另設平行管測定，常用的方法是Lowry法和考馬司亮藍法，后者只適用于可溶性蛋白。

下面介紹的放射配基結合分析法都是以已減去NSB，并已換算成受體的mmol數為起點。

一、飽和曲線法測定受體的數量和親和力

配基和受體的結合服從可逆反應的質量作用定律，其基本方程將公式17-2展開重排，就得到飽和曲線的方程（公式17-4）：

實驗時取一系列試管，各加相等量的受體標本RT，同時向各試管中加不同量（從0起逐管遞增，盡量覆蓋飽和區）的放射配基LT，孵育一定時間使反應達到平衡（正向和反向的速率相等），分離復合物測放射性RL，就得到飽和曲線。將各點的LT作為自變量、RL作為應變量代入17-4式，經過計算機曲線擬合就可得到飽和曲線，并給出RT和KD。

應當指出：①放射配基的選擇對獲得可靠結果非常重要。很多標本都含有同一種受體的不同亞型，如果用選擇性放射配基，而選擇性又不很高，則難以保證所選濃度對各種亞型都已達到飽和區（圖17-2）。因此應當選擇無選擇性的放射配基，得到的是該種受體各亞型的總量。如要測定某種亞型的量，應選用后面將述及的雙位點法；②由于受體密度和蛋白量有關，而雜蛋白量的多少和所用勻漿方法、離心介質和速率有關，所以各實驗室的正常值不會等同，即使同一實驗室所得數據也應當用同批配對的方法作統計處理。

二、受體與配基結合反應的動力學

上述求RT和KD的方法要求反應達到平衡后才能分離復合物測定，達到平衡需要一定孵育時間，這個時間和孵育溫度及k₁、k₂的值有關。可以通過動力學實驗求得。受體與配基開始接觸，v₁ = k₁ × R × L 由最大逐漸變小，v₂ = k₂ × RL 由最小逐漸變大，復合物的凈生成率是v₁-v₂，所以開始時復合物增長很快，逐漸變慢，當v₁ = v₂時就不再增長，也就是達到動態平衡。一般達到平衡都較快，在數十秒至數十分鐘間。當周圍的游離配基急劇下降，或非標記配基濃度急劇升高時，放射性復合物的解離也很快，而且服從一級動力學（圖17-3）。這種快速結合和快速解離對保證受體的迅速反應有很重要的意義。

三、通過Scatchard函數判斷結合反應屬簡單單位點系統還是較復雜的系統

將公式17-2寫成KD =（RT - RL）× L/RL再進行簡單的重排，即得到著名的Scatchard函數（公式17-5）：

可以看出，當RT和KD固定時，RL/L和RL是線性關系，若以RL為橫坐標，以RL/L為縱坐標，將得到一條直線。橫截距即為RT值，直線斜率的負倒數就是KD（圖17-4）。所以在沒有計算機曲線擬合的程序時Scatchard函數也可用來對多點法實驗求RT和KD。但是由于直線化需進行坐標轉換以及橫坐標RL本身是實驗值，所以Scatchard作圖法求RT和KD往往誤差較大。類似的直線化方法還有Woolf函數和雙倒數函數，也有類似缺點，現已少用。

如果反應系統中配基和受體有兩種以上的親和力，則Scatchard函數作圖不是一條直線，所以Scatchard函數作圖迄今仍被用來幫助判斷系統中是否存在二種以上親和力。當有兩種受體亞型對配基親和力不同時，將呈現為向上凹的曲線。當系統存在正協同（positive cooperativity）或負協同（negative cooperativity）現象時，將分別呈現向上凸或向下凹的曲線。所謂協同現象，就是當一個受體結合位點和配基結合時，會影響鄰近結合位點的構象，使它和配基的親和力發生變化（KD變大或變小），而且這種變化隨著受體和配基結合量的增加而越來越顯著，受體調節一章中還將進一步討論。

四、用Hill函數作圖求Hill系數

用Hill函數作圖求Hill系數幫助判斷系統中是否一個分子和一個配基分子結合，如果每一個受體分子與n個配基分子結合，則按質量作用定律有以下關系式：該式也可寫成該式重排，兩邊取對數，就得到Hill函數（公式17-6）：

當以LogL為橫坐標，LogRL/（RT-RL）為縱坐標作圖時，為一上升直線，這就是Hill作圖（圖17-5）。斜率為n，稱為Hill系數。如果受體分子與配基分子以1∶1結合，則n = 1，如以1∶2結合，則n = 2。有時n介于0.5和1或1和2之間，則往往和Scatchard函數作圖時呈曲線相仿，提示有兩種以上親和力的存在，或由于有兩種以上亞型，或由于有正負合作現象。

五、用競爭性取代反應比較不同配基對受體的親和力

如果在放射配基和受體的反應系統中加入另一種不帶標記的配基，而且該配基也能和受體發生特異性的可逆性結合，則會與放射配基競爭有限的受體結合位點，使放射配基形成的復合物減少，減少的程度和所加配基的親和力及濃度有關。這就是競爭性取代反應（competitive replacement reaction），也稱競爭結合反應（competitive binding reaction）。競爭取代反應也是動態過程，也需要一定時間才達到平衡，由于系統中有兩種配基，所需平衡時間較長，而且在很大程度上取決于親和力較低的配基。

以所加的競爭劑濃度（絕對值或以不加非標記配基時為100%的相對值）為橫坐標，復合物的放射性為縱坐標作圖，將得到一條逐漸下降的曲線，若改用競爭劑劑量的對數為橫坐標，將得到一條反S形的競爭曲線。越是親和力高的非標記配基，曲線下降越快，S形曲線的位置越是在圖的左側（圖17-6）。

圖中還給出了IC₅₀，亦即取代50%時的非標記配基濃度，濃度越小，說明非標記配基的競爭性越強，亦即親和力越高。此處是指競爭劑的親和力，用KI表示。IC₅₀的大小除和非標記配基的親和力有關外，還和所用放射配基的親和力及濃度有關，KI則是非標記配基的常數。兩者可用公式17-7進行換算。

用競爭性取代反應比較不同配基對受體的親和力，只需一種放射配基就可以觀察很多不同的非標記配基，所以很明顯，對篩選受體的拮抗劑和激動劑有重要用途。

六、用雙位點飽和實驗研究受體亞型

前已述及，如果一個標本中有兩種亞型，而且它們對配基有不同親和力，則用多點法作飽和曲線實驗，每一個LT給出的RL都是兩種亞型的總和，而且兩種亞型的比例隨LT的增加而不斷改變（圖17-4）。遇到這種標本，如果只需要了解總受體數，可以改用無選擇性的放射配基，給出總的RT和總的KD。如果需要了解不同亞型的RT和KD，則必須選用有選擇性的放射配基，借助一定的數學模型和計算機程序，求出高親和力受體亞型的RT₁和KD₁以及低親和力受體亞型的RT₂和KD₂。

由于計算機編程的具體需要，雙位點飽和實驗的數學模型需從Scatchard函數開始。將Scatchard函數寫成如下形式（公式17-8）：

當系統中有兩種亞型，測得的RL是RL₁和RL₂的總和，RT是RT₁和RT₂的總和，各自的親和力分別用KD₁和KD₂表示，于是得到雙位點飽和曲線的Scatchard函數如下（公式17-9）：

上式中RL和L是實驗值，RT₁和RT₂、KD₁和KD₂是待求參數。只要實驗點數足夠多（10點以上），得到足夠多的RL和L，就可以通過曲線擬合，求出曲線并分解成高低親和力兩條直線，同時給出四個待求參數（圖17-7）。也可以進一步還原成飽和曲線。用雙位點飽和實驗的主要缺點是低親和力受體亞型不易飽和，加以Scatchard函數作圖需要坐標轉換，因此誤差較大，而且所需放射配基量大，成本高。所以研究亞型用得更多的是雙位點競爭取代反應。

七、用雙位點競爭取代反應研究受體亞型

為了克服雙位點飽和實驗的缺點，也可用雙位點競爭取代反應來研究受體亞型的參數。用非選擇性的放射配基和所有受體亞型結合，用有選擇性的非標記配基進行競爭取代反應，則兩種亞型對非標記配基有高低親和力之分。非標記配基濃度低時取代的多為高親和力亞型，隨著非標記配基濃度增加，被取代的低親和力亞型逐步增多，形成一條非典型的中間有轉折的競爭曲線。兩種亞型和非標記配基的親和力差異越大，轉折越明顯（圖17-8）。為了建立數學模型，以便用計算機求解兩種亞型的參數，我們參照Molinoff的報道推導出以下方程。實驗的做法和單位點競爭取代反應基本相同，得到一系列對應于各個IT的RL。以不加IT時的RL減去其他各管的RL即得到一系列對應于IT的RI。于是公式17-4～公式17-6中四個待求參數就可通過擬合算出。再按公式17-7算出KI₁和KI₂，通過公式17-10得出RI。圖17-9是一個M受體的實例。

上述兩種處理雙位點的方法都是對高親和力亞型的誤差較小。它們也可用于多位點系統，但此時所選非標記的競爭劑應當只對其中一種亞型具有高親和力，而對其他亞型都是低親和力。例如pirenzipine只對M₁亞型有高親和力，對其他4種亞型都是低親和力，因此用同樣的程序將競爭曲線分為高低親和力兩條曲線，高親和力的一條就代表M₁，低親和力的一條是4種亞型的混合，沒有意義。如需求M₂亞型的參數，則應改用對M₂有高親和力的甲氧曲胺（methoxytyramine）。

綜合以上7個方面，可以看到，放射配基結合分析用途廣泛，能較精確地求出有關受體的很多參數。因此直到目前仍是研究受體極為常用而且非常有用的方法。

第二節　受體放射分析的基本方法

建立一個優良的離體RBA系統，應根據實驗目的和研究對象而有不同，在方法學上考慮的要點如下。

一、受體標本的制備

在受體結合的實驗研究中，所用的受體標本為組織切片、完整的單層培養細胞或游離活細胞、粗制的或純化的細胞膜受體，以及可溶性的受體蛋白等。

1.組織切片

冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標記配基進行反應，反應結束后用冰冷緩沖液洗去未結合的多余標記配基即可，切片厚度一般為8～50μm。用組織切片的主要目的是研究受體的分布，即用放射自顯影法或免疫組織化學法。

2.游離的完整細胞懸液

完整活細胞可以是血細胞、培養的單層細胞、腫瘤的腹水細胞或經處理的原代細胞等。完整細胞的優點是在研究受體結合特性的同時進行生物效應的測定。完整細胞的膜受體在37℃時會發生受體內化現象（internalization），這會破壞結合反應的平衡狀態，在此情況下測定的KD值就不正確。如EGF受體，完整細胞在37℃溫育時約有80%的受體內化，而在4℃溫育，內化現象可被阻止。使用完整細胞的優點可歸納為：①受體處于原有的正常環境，膜、膜內pH、離子梯度等均未受擾亂，受體與其相連的效應器（如G蛋白）也保存完好；②在受體功能完好的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體的結合以及細胞的生物效應，所得結果更能反映受體的生理特性；③能直接給出每一個細胞的受體數。

但完整細胞的受體分析必須盡可能選用不易穿透細胞膜雙層磷脂的標記物，否則由于游離配基進入細胞內可引起較大誤差。此外還必須注意防止操作過程可能導致細胞表面生理活性的改變。

3.分離亞細胞組分

大多數受體的RBA需經差速離心法分成胞膜、胞質、胞核，取所需的組分進行分析。其優點是：①除去大部分雜蛋白和內源性配基，減少NSB或其他干擾因素；②受體蛋白得到初步濃縮，使富集的受體制劑獲得可靠的分析結果。

亞細胞組分（即細胞膜和細胞質受體）的分離一般都采用差速離心法。一般先制成勻漿，再在含0.25～0.3mol/L蔗糖的緩沖液中先后以不同離心力進行離心，分離不同的亞細胞組分。為保證受體標本的結合活性，整個制膜過程必須在4℃下操作；緩沖液應有適宜的離子強度、pH值、EDTA和Mg²⁺等；有時需加蛋白酶抑制劑，防止受體蛋白被內源性蛋白酶水解。分離的細胞組分如圖17-10所示。

受體組織的來源主要是實驗動物或人，在血液供應停止后必須盡快取材。以防組織自溶的影響。必須注意及檢驗組織冷凍對受體結合的影響。一般來說，保存膜制劑比保存整塊組織更好，有些受體的膜制劑于-70℃可保存數月之久，但嚴禁反復凍融。

（1）粗膜制劑（crude membranous preparation）：

冷凍的組織塊切碎后加低滲緩沖液進行勻漿。低速離心（800～3 500 × g）10～15 分鐘，上清液再高速離心（10 000～30 000 × g）10～15 分鐘（均在4℃下進行）。所得即為膜制劑或粗膜制劑。兩次離心的好處是可更好地去除可溶性物質（如內源性配基、GTP等），以免干擾結合分析。

（2）洗膜制劑（washed membranous preparation）：

有時上述粗制劑經洗膜步驟后可有效進一步降低非特異結合及內源性配基的結合。但洗膜過程必須防止受體蛋白的分解。目前抑制受體蛋白分解作用的主要方法有：①用新鮮組織；②低溫狀態下操作膜的制備；③加蛋白酶抑制劑。

洗膜制劑的方法各家報道不一，較多的是反復高速離心，有的加用EDTA，有的中間增加冰浴振蕩最后得到的沉淀可-70℃保存數月之久。膜制備過程中以及制成品應以受體結合試驗（與標記配基的結合率）及酶活性作指標來判斷膜制劑的純度。還可用電子顯微鏡觀察膜制劑有無其他亞細胞組分。

4.可溶性受體蛋白

大多數跨膜受體用1%（V/V）TritonX-100能有效地將受體蛋白從雙脂層中溶解出來，也有用Digitonin或Tween-80等物質來溶解。溶解受體時常加蛋白酶抑制劑以保護可溶性受體蛋白不被水解。一般用100 000 × g的超速離心法分離可溶性和不可溶性的物質。所有操作都應在4℃下進行，以免受體蛋白產生凝結、變性。假如受體蛋白還需進一步純化，常用特異的配基或抗體，以親和層析法分離受體蛋白。

二、標記配基的選擇

受體的放射配基結合分析法沒有標準品作參照，而是通過已知放射配基的放射性活度和比活度，以及測定結合部分的放射性活度，用數學模型求出受體的有關參數。因此對所用的標記配基有很嚴格的要求。

1.對放射配基的基本要求

（1）高比活度：

由于RBA的標本中受體數量一般都很低，在0.01～1pmol/mg蛋白的水平，要得到滿意的結果就必須使用高比活度的標記配基。一般要求比活度在 3.7 × 10¹¹Bq（10Ci）/mmol以上。比活度高，可減少加入反應管的放射配基量，對標本量少的實驗尤為重要。

（2）高親和力：

親和力高的標記配基在濃度較低時便可達到飽和，因此可節省用量。此外，這種配基與受體形成的復合物往往解離較慢，有利于結合和游離配基的分離。不少拮抗劑的親和力比激動劑高，因此使用較多。

（3）高特異性：

與其他種類的受體交叉反應要盡量少，否則需要采取措施預先除去標本中有交叉反應的受體。對于有兩種以上亞型的標本，還需注意配基對亞型的選擇性。例如腦標本內有5種M受體的亞型，如果目的是測定總的M受體密度，則應選對5種亞型都沒有選擇性的配基；如果目的是測M₁亞型，則應選只對M₁有高親和力而對其他亞型都只有低親和力的標記配基如哌侖西平做飽和實驗，或選非標記哌侖西平做競爭取代實驗。

（4）高放射化學純度及高穩定性：

RBA中受體參數的計算是以標記配基的用量和比活度為依據，較多的放射性雜質有時可導致計算錯誤。一般要求放化純度在95%以上。

2.對放射配基的用量

不同受體、不同配基、不同實驗方案所需的放射配基用量差異可以很大，需通過預實驗來選定。

（1）多點飽和曲線實驗：

每一受體標本做6～8個實驗點（雙位點需更多些），逐點增加標記配基的量，低劑量應覆蓋不飽和區，高劑量應覆蓋飽和區，以便得到較典型的飽和曲線。此法能給出較多參數，如RT、KD、反映實驗誤差大小的平均殘差等，可信度也較高，但工作量較大。

（2）單點法：

通常根據多點飽和實驗結果來選定一個能與受體基本飽和結合的標記配基量，根據結合部分的放射性活度算出受體結合位點的摩爾數。該方法操作簡便，所需標本量少，適宜臨床檢驗和藥物篩選，但只能給出一個參數即受體的最大結合容量Rmax，而且所得結合容量略小于飽和曲線法。

（3）競爭結合實驗：

如果競爭結合實驗是為了判斷非標記化合物屬競爭抑制劑還是不可逆阻斷劑，所用放射配基是從零開始逐漸增大，和一般飽和實驗相同。如果目的是比較不同競爭劑的親和力大小，實驗中改變的是IT，而LT是固定值。對此類實驗，要求LT遠大于RT，否則由KI轉換成IC₅₀將有明顯誤差。

三、非標記配基的選擇

非標記配基有兩個作用。一是測定NSB，二是在競爭取代反應中作競爭劑。測定NSB時的方法是：在測定上述多點法或單點法的總結合TB時，同時設置一系列平行管，在加入標記配基及受體標本的同時，另加非標記配基，后者可以是標記配基的同一化合物，也可以是該受體的另一種配基。但必須能與標記配基競爭同一受體，并且非標記配基對受體的特異性和親和力應盡較高，使之有較高競爭能力。一般非標記配基的用量為標記配基的500～1 000倍，可占據幾乎所有的受體位點，使絕大多數受體不再與標記配基結合，這樣，測得的結合部分放射性就代表非特異結合（NSB）。

測定NSB時，所需的非標記配基濃度一定要通過實驗來選定。因為，如果濃度不足，則對受體位點封閉不夠；如濃度過高會使一些非特異性結合位點被占據，產生特異性結合（SB）被抑制過多的假象。另外，所用非標記配基最好和放射性配基不是同一化合物，這樣不容易出現非特異性結合位點被占領的情況。

四、溫度與孵育時間

溫度是影響反應速率的重要因素。溫度高，結合快，達到反應平衡時間短。但溫度低，反應終止時容易降溫，減少分離過程中復合物的解離。另外，溫度低對配基及受體的穩定性有利，但原有的內源性配基不易解離。不同受體結合系統的最佳溫育溫度要經過試驗選定。

對于飽和或競爭取代試驗，反應達到平衡的時間較長，故溫育時間應比簡單的飽和實驗長。溫育溫度與平衡時間是緊密相關的，不同的受體結合系統的反應平衡時間因親和力、溫育溫度、配基及受體濃度的不同而不同。必須注意，在測試最佳溫育時間時，應以低濃度的放射性配基為準，因為低濃度配基更不易達到平衡。

一般室溫操作比較方便（22℃），但有人認為使用生理溫度37℃更好，活細胞的膜受體存在內化（internalization）問題。4℃溫育，平衡時間雖然長一些，但其結果之重復性更好。

五、結合與游離部分的分離

RBA流程中分離的目的是將反應達到平衡后所形成的標記配基和受體的復合物與游離標記配基分開，然后才能測定復合物的放射性活度。一旦分離，原有的反應平衡被破壞，因此在分離過程中要使復合物的解離降低到最低程度。低溫和快速是最有效的措施。常用的分離方法有過濾、離心、吸附、透析、電泳等，凡RIA中用的分離方法基本都可以采用。

1.對完整細胞、胞膜、胞核受體樣本的分離，目前最常用的分離方法是過濾法。過濾材料主要是玻璃纖維濾膜，此法操作簡便、分離效果較滿意。但是對有些游離的標記配基有非特異吸附能力，使NSB升高，需要采取一定措施例如預先用牛血清白蛋白、非標記配基或PE（Ipolyethylenimine）等浸泡。對于KD較大亦即親和力較低的受體反應標本，過濾過程可能引起較多的復合物重新解離，導致較大誤差。對此，可以考慮改用離心法，原因是離心過程并沒有破壞原來的游離配基和復合物的平衡。但是離心法不能完全去除游離配基，因此NSB較高而且波動較大。

2.對溶脫的核受體、存在于胞質中的核受體以及溶脫的膜受體樣本，往往采用葡聚糖涂膜活性炭法（DCC，終濃度0.5%左右）來分離。DCC將游離配基吸附并離心除去，受體復合物留在上清液中，因此分離過程也會造成原來平衡的破壞。必須在低溫下進行，而且嚴格控制每一反應管的分離時間相同。對低親和力的可溶性受體，DCC不是理想的分離方法，近年來出現了不少利用小層析柱的方法，和上述顆粒性標本利用離心法的原理相仿，以減少在分離過程中平衡的破壞。

第三節　受體放射分析的數據處理

受體放射分析所得測定數據都是放射性強度單位，如cpm，dpm等，而受體分析沒有標準品，不能通過標準曲線查到所需結果，只能靠數據換算來解決。如換算成每毫克蛋白或10⁶細胞所含受體數（通常以fmol或受體分子數表示）或平衡解離常數（通常以nmol/L表示）。另外，較多的受體放射分析是各種多點法（如單位點或雙位點的多點飽和分析法，單位點或多位點的競爭結合分析法等），實驗得到的是若干點的實測值，需要經過用一定的數學模型進行直線或曲線擬合，才能得到所要的結果。所以受體放射分析的數據處理包括兩個方面，一是正確的單位換算，二是各種手工或計算機的數據擬合。下面將逐一介紹。

一、單點飽和分析法的單位換算

單點飽和法只能得到受體最大結合位點數RT（或稱受體密度）。是將測得的復合物放射性強度cpm換算成受體的fmol數，再算成RT（fmol/mg蛋白）。通常都是計算飽和區的RT，也稱最大結合容量 Bmax（maximum binding capacity）。因為多數復合物中受體和配基是1∶1的關系，所以單位換算的公式是（公式17-11）：

如果受體和配基以1∶2的關系形成復合物，則上式還應被2除。注意上式中分子是樣本的特異結合，實際測量到的總結合TB和非特異結合NSB，TB減去NSB才是樣品的特異結合SB。配基比活度的通用單位是Bq/mmol，此處應先換算成dpm/fmol。樣本的蛋白濃度需用生化方法測定，主要是兩種方法，即Lowry法和Bradford法。前者包括一步強堿處理，適用于可溶性及顆粒性蛋白，后者只適用于可溶性蛋白，用于顆粒性蛋白時誤差較大。定出蛋白后就可將RT計算成fmol/mg蛋白。對于完整細胞，也可不測定蛋白濃度而是對細胞數進行計數，得到的RT值以fmol/10⁶細胞數或受體分子數/10⁶細胞表示（1fmol = 6.02 × 10⁸個分子）。

若測得復合物的放射性是2 000cpm（已扣NSB），受體以1∶1分子比例關系與配基結合，標記配基的比活度是1.85 × 10¹²Bq/mmol（= 111dpm/fmol），儀器的測量效率是30%，則標本中的受體量計算如下：

如果該樣本的受體密度欲以每毫克蛋白為單位，則60fmol除以實測蛋白的毫克數即可。如果欲以每一細胞所含受體數表示，則fmol應進一步換算成受體數。因為每mmol物質所含分子數是常數（6.02 × 10²⁰或近似 6 × 10²⁰），故標本所含受體分子數為 60 × 10^-12× 6 × 10²⁰ =360 × 10⁸

若標本細胞數是 7.5 × 10⁶，受體密度 = 360 ×10⁸/（7.5 × 10⁶）= 4 800/細胞。

二、多點飽和分析法求受體的密度和親和力

目前數據處理都通過預先編程的計算機來完成。受體數據的手工計算很費時間和精力，并且都是將曲線直線化后來進行數據處理，結果誤差較大。由于計算機技術的高度發展和應用的普及，加之已有不少成熟的受體數據處理應用軟件，可對曲線直接進行擬合，得到的結果更為科學可靠。而且使用方便，所以現都采用計算機軟件處理。例如國外常用的LIGAND軟件包，國內上海交通大學醫學院編制的受體數據軟件包等可以調用。

因此很少再用坐標轉換的方法如Woolf函數、Lineweaver-Burk函數來計算RT和KD值。Scatchard作圖和Hill作圖雖然還是應用，但目的不是求RT和KD，而是考察實驗結果是否符合不區分亞型的簡單單位點數學模型。主要模型的函數式都來自質量作用定律，推導過程相對簡單，詳見本章第一節“受體和配基結合反應的基本規律”。

標記配基飽和法 多點飽和結合實驗求受體的密度和親和力，配基濃度應在0.1～10KD范圍內經過預實驗加以挑選，覆蓋非飽和區和飽和區。計算程序通過穩健回歸或最小二乘回歸直接給出RT和KD，并可根據使用者的要求打印原始數據、中間運算數據、運算結果及曲線圖。例見表17-1～表17-3及圖17-11。如有需要也可指令計算機打印Hill函數和Scatchard函數的作圖。

（胡雅兒）

參考文獻

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