第十八章　細胞凋亡顯像

細胞凋亡（apoptosis）存在于多種病理過程中，包括神經系統變性疾病、缺血性損傷、自身免疫病和多種腫瘤等。凋亡檢測的可視化對疾病診斷、新的治療方法開發與療效評價具有重要的意義。近年來，隨著人們對凋亡生物學過程的深入了解，針對體內凋亡靶點的分子探針包括熒光標記、生物發光、放射性核素標記和磁共振凋亡顯像的探針逐步得到開發應用。

第一節　概 述

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（programmed cell death），是多細胞生物在胚胎發育、正常組織穩態的維持與各種生理病理情況下機體清除多余細胞的重要方式。凋亡異常，如自身免疫性疾病與神經退行性疾病（細胞凋亡發生過多）或腫瘤組織生長（細胞凋亡發生過少），與凋亡的發生緊密相關。有效的治療如放療、化療、聯合放化療之后，均能引起腫瘤細胞的凋亡。因此，監測凋亡的過程具有重要意義。

細胞凋亡途徑主要歸納為以下三種：一是線粒體凋亡途徑，又稱內源性凋亡途徑，由Bcl-2超家族成員介導。二是死亡受體途徑，又稱外源性凋亡途徑，由特異的死亡受體與相應的配體結合而介導，如腫瘤壞死因子（TNF），TRAIL和FasL（與Fas受體結合的配體）。三是內質網應激反應介導的細胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspases）家族在程序性細胞死亡過程中發揮著非常重要的作用，通常情況下Caspase以酶原的形式存在于細胞質內。各種凋亡途徑最終都匯聚于執行分子Caspase-3的激活，Caspase-3的激活最終會導致poly-ADP-ribose polymerase（PARP）的激活，并伴隨凋亡細胞形態學改變。凋亡的一個早期變化是磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，在活細胞中PS分布于細胞膜脂質雙層的內側，一旦凋亡發生，PS便外翻至細胞脂質雙層的外側。隨著PS外翻，細胞質皺縮，隨后細胞皺縮，質膜出泡，細胞分裂為凋亡小體。由于在形態學與分子生物學上非常相似，凋亡常與其他類型細胞死亡混淆，如自噬與程序性壞死。因此，尋找區分凋亡與其他類型細胞死亡過程的方法對于治療具有重要作用。

目前已有多種方法用于凋亡檢測，主要包括光學顯微鏡、TUNEL分析、流式細胞儀等，這些傳統的體外檢測凋亡的方法是體內顯像方法的重要補充，但活體內凋亡顯像有助于無損觀察、了解凋亡發生的體內過程。因此，本文主要從凋亡的生理過程入手，討論顯微與宏觀的凋亡檢測，從而設計出合理的靶向生物化學變化的凋亡探針，為凋亡顯像的臨床應用提供相關的理論及指導。

第二節　凋亡的微觀檢測

近年來，關于凋亡的機制及生理過程的研究越來越多，從而使基于熒光的分析方法得到了發展，如通過光學顯微鏡、流式細胞儀觀察標記的凋亡標志物。以下部分將從化學水平介紹用于細胞水平凋亡分析的分子探針。

一、熒光標記的annexin探針

annexin Ⅴ是一種大小為35～36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，與PS（磷脂酰絲氨酸）具有高親和力（Kd = 0.1nmol/L）。在活細胞中，PS分布于細胞膜脂質雙層的內側，不與annexin Ⅴ結合。一旦發生凋亡，PS變外翻至細胞脂質雙層的外側，在Ca²⁺存在的情況下與annexin Ⅴ結合。在與膜上的PS結合后，annexin Ⅴ的結構由單體轉變為三聚體，以二維點陣的方式聚集，并以三聚體-三聚體相互作用的方式覆蓋于膜外側PS上。annexin Ⅴ標記熒光是一種快速、可靠的研究PS外翻的方法，也是發現早期凋亡的指示劑。這種試劑須在活細胞或組織洗滌和固定前15分鐘給藥。然而，PS同樣會出現于壞死細胞的表面，因此會引起假陽性結果。為了克服以上缺點，常將核酸染料PI與annexin Ⅴ聯合并通過光學顯微鏡或流式細胞儀區分活細胞、早期凋亡、晚期凋亡和細胞壞死。

在活細胞成像實驗中，熒光標記的annexin Ⅴ探針與凋亡細胞結合需要經歷不同階段，進行分析前首先要去除未結合的蛋白從而降低本底熒光。因此對于活細胞成像來說，annexin Ⅴ探針不是最佳選擇。pSIVA（細胞活性與細胞凋亡的敏感指示劑）是一種基于annexin Ⅻ的極性、敏感探針，用于凋亡與其他細胞死亡形式的時空分析。重組pSIVA蛋白可與一種靈敏的極性染料IANBD結合，只有當pSIVA與細胞膜結合時，才會發出熒光。與不可逆的annexin Ⅴ結合相比，這種膜結合依賴的熒光以及可逆結合是技術上的一大進步，為凋亡通路與細胞存活研究提供了更多信息。

二、基于顯色Caspase底物的探針

Caspase又稱半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是細胞內調控程序性細胞死亡的蛋白酶家族，它的激活在細胞凋亡中發揮重要作用。大多數凋亡信號通路使細胞內Caspase激活，并產生一系列復雜的生物化學變化從而傳導死亡信號。由于Caspase在凋亡過程的關鍵作用，人們構建了針對Caspases家族不同成員的特異性抑制劑與底物，用于監測早期的細胞凋亡。熒光標記的DEVD（天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸）是最常用的檢測Caspase-3/-7活性的多肽。當Caspase-3/-7被Caspase-3剪切后，可通過光學顯微鏡檢測釋放的熒光信號。Caspase-3底物DEVD-NucView 488，是一種帶負電荷DEVD多肽，通過結合具有DNA結合特性的染料而抑制染料與DNA結合，從而使DNA不顯示熒光。這種底物可以快速穿越細胞膜進入細胞質，經Caspase-3剪切而成為高親和力DNA染料NucView 488，被釋放的DNA染料遷移至細胞核并使之染色。因此，這種雙功能底物可用于檢測凋亡細胞的Caspase-3，同時可以將細胞核染色，而細胞核在凋亡過程中也會發生形態學改變。研究者們已構建了Caspase-3底物DEVD-NucView 488聯合其他熒光探針，用于不同事件時間與空間關系的研究。

三、基于親脂性陽離子染料的探針

線粒體是啟動凋亡的一種信號來源，在細胞凋亡中發揮重要作用，線粒體功能障礙會引起凋亡發生。線粒體功能障礙最早期的特點是線粒體膜電位改變，而后誘導凋亡發生。因此，越來越多的研究者開始關注完整細胞的線粒體膜電位。Cossarizza 等報道了使用 5，5′，6，6′-tetrachloro-l，l′，3，3′-tetraethylbenzimidazol-car bocyanine iodide（JC-1）監測完整活細胞線粒體膜電位的改變，JC-1是一種以單體形式存在的親脂性陽離子染料，經490nm波長的光激發后可以釋放出527nm波長的光。當處于高線粒體膜電位時，JC-1會形成J-聚集，釋放590nm波長的光并出現紅移現象。因此，健康細胞線粒體呈現鮮紅色熒光，而由于線粒體膜電位的破壞，JC-1無法聚集于線粒體，只能以單體形式留在細胞質中，表現為綠色熒光。從而可以輕松區分綠色熒光的凋亡細胞與呈現紅色熒光的健康細胞。此外，其他熒光染料如TMRE或TMRM，Rhodamine123同樣可以用于監測線粒體膜電位的變化。

四、TUNEL檢測

DNA在核小體間斷裂成碎片后稱為DNA條帶，是判斷細胞凋亡的重要標志，標記DNA片段是一種檢測細胞凋亡的重要方法。20世紀90年代初由Garvrieli等首先報道的TdT mediated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）檢測已成為使用最廣泛的檢測凋亡DNA片段的方法，此方法基于DNA斷裂后出現的缺口可被末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）識別。新的方法使用由熒光素或一些小分子物質如生物素（biotin）或溴鹽（bromine）標記的dUTPs，熒光素標記的核苷酸（如fluorescein-dUTP）可被直接檢測，由鏈霉親和素或抗體標記的核苷酸（如biotin-dUTP或Br-dUTP）則可被間接檢測。另一種方法是使用5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU），一種由炔修飾的dUTP，它較其他物質標記的核苷酸更易被TdT結合。與其他方法相比，這種新的方法不僅更快，特異性更高，而且無需將DNA變性。

第三節　凋 亡 顯 像

凋亡顯像用于監測體內細胞凋亡具有重要的臨床意義。現介紹幾種已明確的并已用于凋亡顯像的分子探針，如靶向PS、細胞表面暴露的組蛋白、膜電位以及細胞內靶點如Caspases、線粒體膜電位等。

一、放射性核素凋亡顯像

隨著SPECT與PET的發展，以及針對分子靶點的放射性核素示蹤劑的研制，使核醫學進入分子影像學的新時代。核醫學顯像示蹤劑發展的關鍵一步是放射性核素標記。下面討論幾種便捷的、有效的標記模式和針對體內凋亡靶點的放射性標記探針。

（一）放射性核素標記模式

將放射性核素與探針分子結合的方式很多，由于探針分子對靶點的特異性，因此，位點專一的放射化學技術對制備具有生物學活性的探針非常重要。

（二）放射性標記的annexin Ⅴ蛋白探針

annexin Ⅴ與PS結合是細胞凋亡顯像中使用最廣泛、最成功的一種。^99mTc標記annexin Ⅴ是目前為止用于凋亡檢測研究最多、使用最廣泛的放射性配體。^99mTc-BTAP-annexin Ⅴ是第一個用于活體研究的探針，但其制作過程煩瑣、耗時、放射性化學產率低。Blankenberg等1998年首次描述了^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ的制備方法，作為annexin Ⅴ放射性標記方法的替代。制備^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ需要合成HYNIC配體，這是一種煙酸類似物，具有雙功能螯合能力，一方面可與NH₂末端氨基酸和蛋白賴氨酸殘基相連，另一方面可以螯合^99mTc，即HYNIC與annexin Ⅴ相連，并在二價錫離子存在的情況下使用tricine作為共配體與^99mTc進行標記。HYNIC-annexin Ⅴ是一種穩定的復合物，可與^99mTc快速有效地進行標記。與^99mTc-BTAP-annexin Ⅴ相比，^99mTc-HYNICannexin Ⅴ的制備過程更快、更簡單，所需起始放射性活度（1.11～1.48GBq）較低。^99mTc-HYNICannexin Ⅴ是目前為止唯一一個用于非小細胞肺癌患者Ⅱ/Ⅲ期臨床凋亡顯像的放射性藥物，然而由于靶/非靶比值不高而停滯使用了。研究者使用annexin Ⅴ及它的突變體與 ^99mTc、⁶⁷Ga、¹¹¹In、¹⁸F等標記進行體內顯像的研究也正在進行中。

突觸結合蛋白Ⅰ的C2A結構域是一種具有鈣依賴性PS結合能力的神經系統蛋白，用于PET顯像的¹⁸F-C2A-GST是通過［¹⁸F］SFB標記C2AGST進行體內凋亡顯像。

此外，糖蛋白乳凝集素（又稱MFG-E8，PAS-6/7）在鈣離子存在的條件下也可與PS結合。^99mTc-HYNIC-乳凝集素具有乳凝集素一樣的磷酸結合特性，生物分布研究顯示，它可快速被血液清除并在肝臟聚集。與^99mTc-annexin Ⅴ相反，^99mTc-乳凝集素在腎臟有較低的攝取，因此可以用于腎臟細胞凋亡顯像的研究。

（三）放射性核素標記的多肽凋亡顯像探針

PSBP-6是一種能夠特異性靶向PS膜的14個氨基酸的小分子多肽，Song等發現^99mTc-SAACPSBP-6（SAAC：single amino acid chelae；PSBP：phosphatidylserine-binding peptide）γ顯像可以早期監測化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡，有望成為除¹⁸F-FDG之外的腫瘤早期療效監測的方式（圖18-1，圖18-2）。

細胞膜上出現磷脂酰乙醇胺（PE）也是凋亡的一種通用指示劑。耐久霉素（duramycin）是由19個氨基酸組成的二硫化交聯的肽，它可與PE特異性結合并具有高親和力。Duramycin由HYNIC共價修飾并由^99mTc標記，強大的結合能力與適宜的藥代動力學特性使^99mTc-Duramycin成為一種有效的體內凋亡顯像探針。

細胞表面暴露的組蛋白也是凋亡的一種蛋白，Wang等用噬菌體技術發現了一種可以靶向結合凋亡細胞膜表面組蛋白1（H1）的肽apopep-1。¹²⁴I-apopep-1 PET顯像可在體檢測腫瘤細胞凋亡，用于對腫瘤化療早期反應的監測。

（四）放射性標記的小分子探針

與蛋白、多肽探針相比，小分子具有合適的藥代動力學特性，快速擴散率、血池清除率，因此更具臨床應用潛力。Smith等使用Zn-DPA配合物作為靶向PS的另一種選擇。另有研究者使用¹⁸F標記Zn-cyclen體內PET顯像用于腫瘤治療后的凋亡監測。然而，由于Zn-DPA和Zn-cyclen探針在肝臟與其他器官聚集較高，因此尚需進一步進行優化。

ApoSense家族是另一種小分子凋亡探針，包括DCC、NST-732和dansyl-ML-10，它們可與凋亡細胞外翻的PS結合進行凋亡顯像。¹⁸F-ML-10凋亡顯像劑是第一個進入臨床前研究的PET顯像劑。臨床前研究表明，腦卒中區域腦組織對¹⁸FML-10的攝取與組織學證據一致。對志愿者進行Ⅰ期臨床試驗表明，¹⁸F-ML-10在體內具有高穩定性，適宜的藥代動力學特性。Ⅱa期臨床試驗階段，對急性腦卒中患者已獲得了神經細胞凋亡的PET影像。

Caspase是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在調控細胞凋亡中起關鍵作用，Isatin是Caspase的抑制劑。¹⁸F-ICMT-11是Caspase-3特異的小分子PET示蹤劑，具有非常高的放射性比活度。¹⁸F-ICMT-11已經在健康志愿者進行了體內生物分布與輻射吸收劑量的研究，結果顯示其快速聚集于肝臟與腎臟，隨后經腎臟與肝膽管清除。另一個Isatin系列的顯像劑是¹⁸F-WC-Ⅱ-89，在PET成像大鼠模型中，¹⁸F-WC-Ⅱ-89在治療組肝臟與脾臟攝取是對照組將近2倍，體內分布也與Caspase-3的活性良好相關。

另有一些主要用于凋亡顯像的小分子探針：¹⁸F-FBnTP靶向作用于凋亡早期階段跨越線粒體內膜的質子電化學梯度的崩解，HSP90是凋亡的主要抑制劑，GSAO［4-（N-（S-glutathionyl-acetyl）amino）phenyl-arsonous acid］可以快速在細胞質中聚集，并主要與HSP90 C-末端的高保守Cys-Cys域（Cys719和Cys720）通過共價進行交聯。使用DTPA和¹¹¹In修飾GSAO可對腫瘤模型細胞凋亡進行在體SPECT/PET成像。

二、光學成像探針

隨著活細胞熒光顯微鏡的出現，大量光學顯微模式應運而生。近年來，光學成像儀器與精細的光學探針的研發使對小動物整體，組織與細胞層面的非侵入性、實時顯像成為可能。尤其是近紅外光（near-infrared，NIR）熒光素與配體的結合大大擴展與改善了光學成像系統的性能。

（一）熒光標記的凋亡探針

近紅外光熒光染料Cy5.5標記的annexin Ⅴ，是第一個用于腫瘤細胞凋亡檢測的在體凋亡顯像探針，治療后腫瘤模型Cy5.5-annexin Ⅴ熒光信號比對照組明顯增高。熒光斷層顯像技術（FMT）可對深部組織進行定量三維成像，能精確地分辨出深部腫瘤對于化療的敏感性，克服了NIR低分辨率、缺乏量化的缺點。有研究者將Zn-DPA與NIR熒光素結合，模擬annexin Ⅴ的凋亡信號傳遞作用，其凋亡檢測能力已在動物模型中得到驗證。

（二）熒光-淬滅可激活探針

近年，“可激活探針”或“職能探針”已成為靶向光學顯像最具吸引力的一種新型探針，它能持續不斷的發射信號，屬于“永遠開啟”狀態。這種探針的缺點是，無論它們接近組織或細胞還是與組織或細胞相互作用，均會發射信號，因此會形成強大的背景信號。Bullok等制備了一種靶向Caspase的具有膜通透性的探針TcapQ647，能識別Caspase的效應序列DEVD，從而激活染料QSY 21/Alexa Fluor 647。研究表明TcapQ647是一種敏感的、用于檢測凋亡的職能探針。研究發現了另一種多肽序列KKKRKV探針，明顯提高了信號敏感性并且降低了細胞毒性。

納米粒子為不同的淬滅劑-熒光團組合如多對一或多對多提供了平臺，目前已成功研制出多聚和無機納米粒子依賴的可激活探針。Lee等報道了一種可激活納米探針，這種探針可有效地將雙淬滅Caspase-3敏感的熒光肽運送至細胞，使Caspase-3依賴的信號放大并進行體內、體外顯像。

（三）生物發光成像探針

大多數可激活探針使用熒光作為報告信息，而生物發光成像（BLI）由于它的高信-噪比成為另一種有前途的光學成像模式。大多數重組生物發光探針由“三明治”線性結構組成：Luc-DEVDreceptor。它們的分子非常大，且在凋亡過程中對DEVD片段酶切不足，從而使熒光信號的強度相對較低。Kanno等設計了一種基因編碼的環狀熒光素酶來檢測活細胞與動物蛋白酶活性。這一環狀熒光素酶可以定量檢測經胞外刺激的活細胞caspase-3活性，并可對小鼠caspase活性進行時間依賴非侵襲性成像。水母與螢火蟲熒光素酶的底物分別是腔腸素與D-熒光素，均已被用于檢測動物不同的生物學過程。使用兩種不同的熒光素酶或可激活熒光素酶用于兩種或更多的生物學過程成像，大大地提高了熒光成像的效用。

三、磁共振成像顯像劑

由于MRI在時間、空間分辨率方面的優勢，能夠進行單個細胞、器官，甚至動物模型的生物學過程監測。然而，MRI的敏感性低，對比造影劑的出現克服了這一缺點。Gd螯合劑與IONPs（超順磁性氧化鐵納米粒子）是應用最廣的MRI造影劑。MR凋亡成像造影劑的開發提供了另外一種新型的顯像模式。

（一）磁性標記模式

Gd（Ⅲ）螯合劑是臨床最常用的MRI造影劑之一。由于Gd（Ⅲ）具有內在毒性如嚴重的干預鈣離子通道、蛋白結合位點，所以不可直接以自由離子的形式注射。Gd（Ⅲ）離子需與螯合劑結合從而最大限度降低毒性。最常使用的螯合配體是DTPA、DOTA以及它們的衍生物。為了使Gd-DTPA、Gd-DOTA與生物相容性大分子結合，研究者研發了DTPA與DOTA的各種雙功能螯合劑。雙功能配體與小分子Gd螯合劑較易與許多大分子結合，如蛋白質、聚合物、樹狀大分子，這一結合是通過功能基如酸酐、疊氮化物、炔基、順丁烯二酰亞胺等來完成的。超順磁性氧化鐵納米粒子（IONPs）是另一種常用的MRI造影劑。IONPs適宜的物理化學屬性與表面性能已被用于MR成像研究。表面修飾常會提高安全性、生物相容性、穩定性和親水性，并可形成用于進一步結合的末端功能基。通過高分子聚合物或表面活性劑如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯亞胺（PEI）和甲硅烷等可形成納米顆粒表面涂層。已成功制訂了各種方法使PEG與納米顆粒相連，如納米顆粒聚合作用與表面甲硅烷嫁接法。

（二）示蹤Gd（Ⅲ）螯合劑

高自旋順磁性Gd（Ⅲ）螯合劑可以有效增加T₁弛豫速率（1/T₁），常被用作T₁造影劑，并產生陽性影像對比。體內造影劑通過依附于脂蛋白、線性聚合物、膠粒結構、樹狀大分子與固體脂質納米顆粒（SLNs）而被用于顯像、放大信號。為了檢測凋亡細胞暴露的PS，生物素化的annexin Ⅴ通過親和素與Gd-DTPA標記的生物素化脂質體共價結合而與其連接。小鼠心臟體外研究心肌細胞凋亡顯示，在早期凋亡階段的心肌細胞區域MRI信號強度明顯增加。凋亡細胞annexin Ⅴ結合的造影劑顯示明顯增加的弛豫速率，這表明靶向納米顆粒可應用于在體凋亡細胞檢測。Gd螯合劑標記的突觸結合蛋白Ⅰ的C2A域同樣可以檢測凋亡細胞，而用于MRI技術檢測細胞凋亡。通過直接吸附法制備Gd-DTPA-C2A-GST造影劑，體內T₁加權成像顯示腫瘤組較對照組有更多的造影劑聚集。

多肽類與有機小分子也可與Gd螯合劑進行標記，Burtea等通過噬菌體技術確定六肽hexapeptide（LIKKPF）對PS有高度親和力，由Gd-DTPA復合物標記的hexapeptide可顯示動脈粥樣硬化斑塊中的細胞死亡。

目前，¹H MRI酶活性測定正在進行中。但通過¹H MRI觀察酶活性的不足是本底信號干預了探針信號的采集。因此，研究者開始關注一種在動物體內幾乎沒有本底信號的¹⁹F MRI。Gd-DOTA-DEVD-Tfb是一種¹⁹F MRI探針，可用于檢測Caspase-3活性。

（三）氧化鐵納米顆粒凋亡顯像

超順磁性氧化鐵納米顆粒是最具代表性的T₂顯像劑，可以有效增強T₂弛豫速率（1/T₂），并產生陰性顯像對比。交聯氧化鐵（CLIO）是一種單分散氧化鐵的高穩定性交聯衍生物，可用于分子成像。每2.7個annexin Ⅴ蛋白通過二硫鍵與一個CLIO納米顆粒相連而成annexin Ⅴ-CLIO，可以作為凋亡檢測有效的MRI探針。

C2A結構域作為另一種PS結合方式，可與超順磁性氧化鐵納米顆粒結合。已有體內、體外實驗證明，可用于治療后腫瘤細胞的凋亡測定。

四、多模態凋亡顯像

（一）多模態標記策略

臨床上常用的多模式顯像包括光學成像、MRI、CT、US、PET和SPECT，它們具有各自不同的解剖與功能成像特點，因此將不同的成像模式進行整合，可以獲得不同成像模式的優點，同時降低各自的局限性。

（二）基于納米顆粒的多模式探針

靶向凋亡的多模式探針已有較深入研究。Schellenberger等研究了磁電機/光學形式的annexin Ⅴ，即Anx-CLIO-Cy5.5的合成過程，將SATAylated annexinⅤ與SPDP激活的熒光CLIO納米顆粒反應而獲得。這種結合方式，可以使體內、體外有效維持annexin Ⅴ與凋亡細胞相互作用的強度，并易于被標準MRI與NIRF光學方法所檢測。van Tilborg等發明了annexin Ⅴ結合的雙峰納米顆粒，這些納米顆粒是由封裝在順磁性微團中的量子點組成的，使其可以同時用于光學成像與MRI。將annexin Ⅴ結合的納米顆粒用于凋亡檢測的特異性已得到了熒光顯微鏡與MRI的證實，確認了它用于雙顯像模式在體檢測凋亡的潛能。annexinⅤ-CCPM允許體內、體外通過核技術與光學技術顯示腫瘤細胞凋亡。研究顯示，雙標記的annexinⅤ-CCPM有助于評估病情和治療反應如非正常細胞死亡。Zhang等利用一種基于人類單克隆抗體PGN635，靶向PS的脂質體納米探針PGN-LIO/DiR，SPIO被裝入脂質體的核心，而近紅外染料DiR則是親脂性雙分子層的一部分。通過體內、體外縱向MRI與光學成像表明，靶向PS的脂質體可為腫瘤顯像劑定向投放、潛在的抗腫瘤藥物治療提供一個有用的平臺。然而，使用納米顆粒進行腫瘤多模態成像仍處于初級研究階段，需要進一步研發靶向凋亡（PS之外的靶點）的多功能納米粒子。

（三）小分子多模式探針

小分子標記的不同報告基團可用于多模態成像。有報道稱可使用一種光學-核雙重模式分子探針顯示Caspase-3的活化。分子探針LS498由三部分組成，DOTA用以螯合⁶⁴Cu，一個近紅外的熒光團-淬滅劑對、Caspase-3特異的底物肽段。通過體內、體外研究已經證實，使用放射性核素顯像可以定位與量化分子探針的分布，使用光學成像可以報告診斷酶的功能狀態。標簽的相對缺乏限制了探針的使用，然而，在組織中快速擴散的潛力使其在體內應用中具有一定的吸引力。

第四節　放射性核素凋亡顯像的應用

一、腫瘤放療和化療效果評估

臨床上常使用解剖成像如MRI、CT對腫瘤治療療效進行評估，然而，通常在治療后的1～2個月才能發生明顯的結構改變，因此，患者需承擔接受無效治療的風險；另一方面，臨床試驗需要經歷很長一段時間才能顯示出對治療的反應。因此，患者與制藥業均得益于對療效的早期評估。通過分子功能水平而非解剖水平獲得信息的診斷方法可以對此提供有效的解決方案。近年來，在分子成像方面的技術進步使生物過程在體成像成為可能。大多數抗腫瘤治療方法通過誘導細胞凋亡對抗腫瘤。研究表明，治療后早期腫瘤細胞凋亡的程度反映腫瘤組織對治療的敏感性，并可基于細胞凋亡的程度早期評價治療的效果、預測疾病的轉歸。

^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ是目前研究最多的顯像劑，多數^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ凋亡顯像應用于頭頸癌（HNC）、濾泡性淋巴瘤（FL）、非小細胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌（BrC）患者。Van de wiele等于2003年首次報道了^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ在腫瘤患者的應用，結果發現腫瘤組織對^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ的攝取與凋亡細胞數成正相關。Lan等發現，荷瘤小鼠環磷酰胺治療后24小時，治療組可見清晰的腫瘤組織^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ顯像，而在生理鹽水對照組小鼠的腫瘤部位只觀察到少量放射性標記的示蹤劑，腫瘤部位顯像較弱（圖18-3）。^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ可作為凋亡顯像示蹤劑，并對化療后早期療效進行監測和評估。Yang等利用紫杉醇治療腫瘤后，^99mTc-ECannexin顯像發現腫瘤組織對^99mTc-EC-annexin攝取明顯增加。

兔VX2肺癌模型紫杉醇化療后72小時進行¹⁸F-C2A-GST PET顯像，發現治療組腫瘤¹⁸F-C2AGST攝取明顯增加，最大標準攝取值明顯高于對照組（0.47 ± 0.28 vs 0.009 ± 0.001；p ＜ 0.001），¹⁸F-C2AGST可作為化療后早期凋亡的預測指標。Qin等利用¹⁸F-rh-His10-annexin Ⅴ監測A549荷瘤小鼠單次紫杉醇化療后120分鐘圖像，結果示治療后腫瘤組織對¹⁸F-rh-His10-annexin Ⅴ的攝取量較治療前明顯增加（SUV_max 0.35 ± 0.13 vs 0.04 ± 0.02，p ＜ 0.001）。Nguyen等給予荷瘤小鼠環磷酰胺治療，于治療后24小時、48小時行¹⁸F-ICMT-11 PET顯像，結果顯示治療后24小時，腫瘤組織對¹⁸F-ICMT-11的攝取達到高峰，這與體外實驗觀察到cleaved Caspase-3活性在24小時達到高峰一致，并通過TUNEL染色證實凋亡細胞存在；且腫瘤組織對¹⁸F-ICMT-11的攝取與¹⁸F-FDG的攝取負相關。¹⁸F-ICMT-11有望成為腫瘤化療后與Caspase-3相關的一種非侵入性凋亡檢測標記物，目前正在進行三期臨床實驗中。

二、腦梗死的凋亡顯像

腦卒中是最常見的神經系統病變，隨著對卒中病理生理過程的深入認識，研究者提出了神經血管單元（neurovascular unit，NVU）的概念。NVU包括緊密相關的神經元、內皮細胞和膠質細胞，壞死是腦卒中超急性期NVU細胞死亡的主要形式，然而，凋亡在隨后的階段發揮重要作用。尋找非侵入性、實時監測腦卒中細胞死亡的顯像劑對組織損傷區域的評估、治療的監視發揮重要作用。

¹⁸F-ML-10是一種由¹⁸F標記的小分子PET顯像劑，可與凋亡細胞外翻的PS結合。Reshef等于大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）阻塞小鼠（MCAO mice）模型建立后24小時給予小鼠注射¹⁸F-ML-10，并行動態PET掃描。結果顯示，缺血MCA區域¹⁸F-ML-10攝取明顯增加。體外研究結果表明，受累大腦半球¹⁸F-ML-10吸收劑量較對照組增加2倍，梗死區¹⁸F-ML-10吸收劑量較對照組增加6～10倍，且腦組織對¹⁸F-ML-10的攝取與細胞死亡的組織學證據相關。表明¹⁸FML-10顯像有助于描述缺血相關的腦組織損傷區域，監測疾病的發展與治療效果。

Zhang等首先建立了兔左側大腦中動脈缺血-再灌注模型，于再灌注21～24小時后靜脈注射^99mTc-labeled duramycin，并于注射后1～2小時行腦動態SPECT顯像。TTC染色評估病灶體積，cleaved caspase-3染色觀察細胞凋亡。結果示，模型動物左側大腦半球有明顯的放射性濃聚（熱點），對^99mTc-labeled duramycin的攝取明顯高于右側大腦半球，缺血部位對其攝取的多少與缺血程度相關。放射自顯影結果示，TTC染色陰性區域與大腦放射性濃聚區一致，TTC染色陰性區域代表缺血半暗帶，免疫組織化學結果同樣顯示cleaved caspase-3陽性染色主要存在于缺血半暗帶。實驗結果表明，^99mTc-labeled duramycin SPECT顯像可用于大腦缺血-再灌注引起的凋亡神經元的檢測和定量。

三、心肌細胞凋亡顯像

心血管疾病是當今世界發病率與死亡率最高的疾病。臨床實踐中，體內識別引起心臟病發作的動脈粥樣硬化病變依舊困難。成像技術為檢測有臨床意義的冠脈粥樣硬化改變提供了參考標準。在心肌缺血再灌注過程中，凋亡是引起再灌注損傷心肌細胞死亡的重要形式。

Thimister等在AMI急性期行^99mTc-MIBI心肌灌注顯像，結果顯示，所有AMI病例均見心肌梗死部位為放射性缺損區，PTCA術后^99mTcannexin Ⅴ顯像結果示這些區域為放射性濃聚區。亞急性期（心梗發作4天后）^99mTc-MIBI心肌灌注顯像示放射性缺損區較急性期明顯縮小（9%～43% vs 3%～25%，p ＜ 0.05），但仍與 ^99mTc-annexinⅤ放射性濃聚區一致。部分病例亞急性期^99mTcannexin Ⅴ攝取較急性期不斷減少，甚至不攝取，即此時^99mTc-annexin Ⅴ凋亡顯像陰性，之后，心肌灌注顯像結果完全正常。這些均表明，急性期^99mTc-MIBI放射性缺損與^99mTc-annexin Ⅴ放射性濃聚與可逆性心肌損傷相關。若^99mTc-annexin Ⅴ顯像顯示有心肌細胞凋亡存在，則可通過凋亡抑制治療來防止心肌細胞死亡，同時可對治療效果進行評價。

為評估心肌梗死的治療效果，將心肌梗死小鼠分為生理鹽水對照組與PTH治療組，術后2天行⁶⁸Ga-annexin A5 PET顯像，術后6天，30天行FDG-PET檢查評估左心射血分數與梗死區域。結果示，術后2天對照組梗死區⁶⁸Ga-annexin A5攝取值高于治療組（7.4%ID/g ± 1.3%ID/g vs 4.5%ID/g ±1.9%ID/g，p = 0.013），TUNEL 染色結果示對照組梗死區細胞凋亡數明顯高于治療組（64% ± 9% vs 52% ± 4%，p = 0.045），FDG-PET 示治療組梗死區面積明顯降低，而對照組增加。實驗表明，⁶⁸Gaannexin A5 PET可以作為凋亡標志監測PTH對MI的治療效果。

此外，凋亡顯像也用于動脈粥樣硬化斑塊的顯像，用于在體顯示不穩定斑塊的巨噬細胞或平滑肌細胞的凋亡過程，黃代娟等研究表明，應用^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ動脈粥樣硬化斑塊顯像，在不穩定性動脈粥樣硬化斑塊部位顯像劑攝取明顯增高（圖18-4）。

四、新生兒缺氧缺血性腦損傷細胞凋亡顯像

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）發生后腦部微循環相對小的波動就會引起細胞凋亡。壞死與梗死會導致腦細胞立刻發生不可逆性損傷，而新生兒HIBI引起的凋亡要經歷一段時間發展、變化，是腦細胞遲發性死亡的重要形式，這種類型的腦細胞死亡可能是腦癱的預兆。凋亡的發展需經歷多級過程，阻斷凋亡的級聯反應就可能中斷細胞程序性死亡。通常腦癱患兒的癥狀在2～3歲才逐漸顯露，因此，若在疾病發生早期便可監測到細胞凋亡，就可盡早給予治療。

D’Arceuil等對新生兔HIBI模型進行^99mTcannexin Ⅴ凋亡顯像，結果顯示，模型組兔腦組織有局灶性^99mTc-annexin Ⅴ攝取，小腦攝取最多，對照組無攝取。而MRI檢查未見缺血后血腦屏障崩解與灌注異常。

五、其他

凋亡顯像在疾病診斷與療效預測方面的優勢有助于個體化治療的發展，對藥物開發也發揮重要作用。

甲狀腺炎、藥物引起的肝細胞凋亡均可用annexin Ⅴ評估，另外，藥物所致心肌毒性引起的細胞凋亡可用¹⁸F-CP18進行評估。

小 結

凋亡是細胞死亡的一種重要形式，有效的放化療后可引起腫瘤細胞的凋亡。臨床前研究與臨床研究表明凋亡顯像可以用來檢測有效治療后腫瘤細胞的早期凋亡，從而判斷腫瘤治療后的早期療效。隨著人們對凋亡生物學過程的認識深入，設計靶向細胞凋亡的多模態探針成為可能。基于納米顆粒、蛋白質、肽段、小分子多肽的凋亡成像模式探針，體內凋亡成像對臨床的發展起著重要作用。然而，由于開發臨床應用的顯像探針存在困難，迄今為止，還沒有任何一種顯像劑進入臨床應用。總體來說，一個有臨床應用潛力的凋亡顯像探針應具有以下特性：①凋亡細胞高選擇性、高特異性；②體內、體外具有高穩定性；③合適的藥代動力學；④與成像設備、標記技術具有兼容性；⑤低免疫原性與毒性；⑥經濟上可行。凋亡檢測為研究者與臨床醫生提供了疾病治療的新視角，相信在不久的將來一定會有一種或多種分子探針能夠克服藥物研發階段的各種困難而最終進入臨床應用。

（宋少莉）

參考文獻

[1] De Biasi S，Gibellini L，Cossarizza A. Uncompensated Polychromatic Analysis of Mitochondrial Membrane Potential Using JC-1 and Multilaser Excitation. Curr Protoc Cytom，2015，72：7.32.1-11.

[2] Gavrieli Y，Sherman Y，Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol，1992，119（3）：493-501.

[3] Blankenberg FG，Katsikis PD，Tait JF，et al. Imaging of apoptosis（programmed cell death）with 99mTc annexinⅤ. J Nucl Med，1999，40（1）：184-191.

[4] Song S，Xiong C，Lu W，et al. Apoptosis imaging probe predicts early chemotherapy response in preclinical models：A comparative study with 18F-FDG PET. J Nucl Med，2013，54（1）：104-110.

[5] Wang K，Purushotham S，Lee JY，et al. In vivo imaging of tumor apoptosis using histone H1-targeting peptide. J Control Release，2010，148（3）：283-291.

[6] Smith BA，Akers WJ，Leevy WM，et al. Optical imaging of mammary and prostate tumors in living animals using a synthetic near infrared zinc（II）-dipicolylamine probe for anionic cell surfaces. J Am Chem Soc，2010，132（1）：67-69.

[7] Bullok K，Piwnica-Worms D. Synthesis and characterization of a small，membrane-permeant，caspase-activatable far-red fluorescent peptide for imaging apoptosis. J Med Chem，2005，48（17）：5404-5407.

[8] Lee S，Choi KY，Chung H，et al. Real time，high resolution video imaging of apoptosis in single cells with a polymeric nanoprobe. Bioconjug Chem，2011，22（2）：125-131.

[9] Kanno A，Umezawa Y，Ozawa T. Detection of apoptosis using cyclic luciferase in living mammals. Methods Mol Bio，2009，574：105-114.

[10] Schellenberger EA，Sosnovik D，Weissleder R，et al.Magneto/optical annexin Ⅴ，a multimodal protein.Bioconjug Chem，2004，15（5）：1062-1067.

[11] Van Tilborg GA，Mulder WJ，Chin PT，et al. Annexin A5-conjugated quantum dots with a paramagnetic lipidic coating for the multimodal detection of apoptotic cells.Bioconjug Chem，2006，17（4）：865-868.

[12] Zhang L，Zhou H，Belzile O，et al. Phosphatidylserinetargeted bimodal liposomal nanoparticles for in vivo imaging of breast cancer in mice. J Control Release，2014，183：114-123.

[13] Van de Wiele C，Lahorte C，Vermeersch H，et al. Quantitative tumor apoptosis imaging using technetium-99m-HYNIC annexin Ⅴsingle photon emission computed tomography. J Clin Oncol，2003，21（18）：3483-3487.

[14] 蘭曉莉，張永學，何勇，等.凋亡顯像劑99mTc-HYNICannexin Ⅴ對腫瘤模型化療療效早期評價的可行性.中華腫瘤雜志，2008，30（10）：737-740.

[15] Yang DJ，Azhdarinia A，Wu P，et al. In vivo and in vitro measurement of apoptosis in breast cancer cells using 99mTc-EC-annexin Ⅴ. Cancer Biother Radiopharm，2001，16（1）：73-83.

[16] Qin H，Zhang MR，Xie L，et al. PET imaging of apoptosis in tumor-bearing mice and rabbits after paclitaxel treatment with（18）F（-）Labeled recombinant human His10-annexinⅤ. Am J Nucl Med Mol Imaging，2014，5（1）：27-37.

[17] Nguyen QD，Smith G，Glaser M，et al. Positron emission tomography imaging of drug-induced tumor apoptosis with a caspase-3/7 specific ［18F］-labeled isatin sulfonamide. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（38）：16375-16380.

[18] Reshef A，Shirvan A，Waterhouse RN. Molecular imaging of neurovascular cell death in experimental cerebral stroke by PET. J Nucl Med，2008，49（9）：1520-1528.

[19] Zhang Y，Stevenson GD，Barber C，et al. Imaging of rat cerebral ischemia-reperfusion injury using（99m）Tc-labeled duramycin. Nucl Med Biol，2013，40（1）：80-88.

[20] Thimister PW，Hofstra L，Liem IH，et al. In vivo detection of cell death in the area at risk in acute myocardial infarction. J Nucl Med，2003，44（3）：391-396.

[21] 黃代娟，蘭曉莉，張永學，等.99mTc-HYNICAnnexin Ⅴ動脈粥樣硬化斑塊顯像的實驗研究.中華核醫學雜志，2008，28（3）：206-208.

[22] D’Arceuil H，Rhine W，de Crespigny A，et al. 99mTcannexin Ⅴ imaging of neonatal hypoxic brain injury.Stroke，2000，31（11）：2692-2700.