三、牛病毒性腹瀉

牛病毒性腹瀉（黏膜?。┦怯膳２《拘愿篂a病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV，屬于黃病毒科瘟病毒屬）引起的傳染病，各種年齡的牛都易感染，以幼齡牛易感性最高。病毒可感染牛、羊、豬等多種家畜，尤以牛為主。感染?？杀憩F為多種臨床癥狀，如肺炎、腹瀉、流產、出血性綜合征、急性感染及持續性感染等。該病分布廣泛，世界上大多數養牛國家都存在，給養牛業造成了巨大的經濟損失。我國自20世紀80年代初由國外引進的綿羊、奶牛和凍精中分離出該病毒。近年來，因大批地從外國引進種牛，使許多地區傳入本病。因此，必須給予足夠的重視。

（一）病毒特征

BVDV為黃病毒科、瘟病毒屬。是一種單股RNA、有囊膜的病毒。新鮮病料作超薄切片進行負染后，電鏡下觀察可見病毒顆粒呈球形，直徑24～30nm。病毒在牛腎細胞培養中，有三種大小不一的顆粒，最大的一類直徑80～100nm，有囊膜，呈多形性，最小的一類直徑只有15～20nm。

病毒對乙醚和氯仿等有機溶劑敏感，并能被滅活，病毒懸液經胰酶處理后（0.5mg/ml，37℃下60min）致病力明顯減弱，pH5.7～9.3時病毒相對穩定，超出這一范圍，病毒感染力迅速下降。病毒粒子在蔗糖密度梯度中的浮密度為1.13～1.14g/ml；病毒粒子的沉降系數是80～90S。

病毒在低溫下穩定，真空凍干后在－70～－60℃下可保存多年。病毒在56℃下可被滅活，氯化鎂不起保護作用。病毒可被紫外線滅活，但可經受多次凍融。

BVDV的分離株之間有一定的抗原性差異，但是用常規血清學方法區分病毒分離物之間的差異是非常困難的，一般認為一種BVDV產生的抗體能抵抗其他毒株的攻擊。BVDV可在胎牛的腎、睪丸、脾、氣管、鼻甲骨等牛源性細胞上生長，并且對胎牛睪丸細胞和腎細胞最敏感，做病毒分離時最好采用這兩種細胞。BVDV也能在牛腎繼代細胞（MDBK）上生長良好，因取用方便，所以常用MDBK和牛鼻甲骨細胞進行診斷實驗和制造疫苗。病毒不能在雞胚上繁殖。

（二）臨床癥狀

本病自然感染的潛伏期為7～10d，短者為2d，長者為14d。人工感染的潛伏期多為2～3d。臨診上主要有如下表現形式：

急性型病牛呈雙向熱，病牛突然發病，體溫升高至40～42℃，維持2～3d，下降后又第2次升高，流漿液性、黏性鼻液，咳嗽，呼吸急促，鼻鏡、舌頭、口腔黏膜糜爛，唾液增多，口氣惡臭，繼而發生嚴重的腹瀉，排出青灰色惡臭水便，之后糞便變稠，混有大量黏液和氣泡，有時混有血液。起初伴發蹄葉炎而見跛行，持續性或間歇性腹瀉而迅速消瘦，急性的多于2周左右死亡，慢性的2～6個月后死亡。病毒可通過胎盤傳染胎兒，導致出生的犢牛小腦缺陷或致流產。

（三）病理變化

主要表現為消化道黏膜有大量爛斑和潰瘍，惡性卡他熱消化道黏膜充血并有爛斑。食道黏膜有排列成直線形、大小不一的爛斑，鼻鏡、口腔、咽喉有潛在的小爛斑；真胃水腫并有爛斑，小腸有急性卡他性炎癥，大腸有糜爛、出血或壞死。

（四）流行病學特征

該病常發生于冬季和早春，舍飼和放牧牛都可發病。

家養和野生的反芻獸及豬是本病的自然宿主，自然發病病例僅見于牛，黃牛、水牛、牦牛沒有明顯的種間差異。各種年齡的牛都有易感性，但6～18月齡的幼牛易感性較高，感染后更易發病。綿羊、山羊也可發生亞臨診感染，感染后產生抗體。

病毒可隨分泌物和排泄物排出體外。持續感染?？山K生帶、排毒，因而是本病傳播的重要傳染源。本病主要是經口感染，易感動物食入被污染的飼料、飲水經消化道感染，也可由于吸入由病畜咳嗽、呼吸而排出的帶毒的飛沫而感染。病毒可通過胎盤發生垂直感染。病毒血癥期的公牛精液中也有大量病毒，可通過自然交配或人工授精而感染母牛。

（五）預防及治療

目前無特效的治療方法，對癥治療和加強護理可以減輕癥狀，增強機體抵抗力，促使病?？祻?。

為控制本病的流行并加以消滅，必須采取檢疫、隔離、凈化、預防等獸醫防制措施。預防上，我國已生產一種弱毒凍干疫苗，可接種不同年齡和品種的牛，接種后表現安全，14d后可產生抗體并保持22個月的免疫力。

（六）實驗室檢測

牛病毒性腹瀉/黏膜病診斷技術規范

依據標準：GB/T 18637—2018。

1.病毒分離鑒定

（1）儀器　倒置熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、臺式離心機（最高離心速度不低于5000r/min）、超聲波裂解儀、細胞計數儀、生物安全拒、恒溫培養箱（37℃±2℃）、CO2恒溫培養箱（37℃±2℃）、高速臺式冷凍離心機（最高離心速度不低于12000r/min）、渦旋混合蕩器、研缽、組織勻漿器、冰箱（2～8℃、－20℃、－70℃）、單道（或多道）微量移液器（10μl、100μl、200μl、300μl、1000μl）。

（2）耗材　離心管（1.5ml、2ml、15ml、50ml、100ml）、采樣管（5ml）、細胞培養瓶（25cm2、75cm2、175cm2）、細胞培養板（96孔、48孔、24孔、6孔）、移液器吸頭（10μl、200μl、300μl、1000μl）、剪刀（含彎頭剪刀）、鑷子（含彎頭鑷子）、采樣專用商品化棉拭子、一次性采血管（含針頭）、注射器（5ml、10ml、20ml）、標簽。

（3）試劑

PBS：配方見附錄A。

PBST：配方見附錄A。

細胞培養液與細胞維持液：配方見附錄A。

BVDV陽性參照毒株：BVDV-1（Oregon C24V株）、BVDV-2（890株）。

FBS（無BVDV及其抗體）或馬血清，－20℃保存。

中和試驗對照血清：BVDV-1陽性血清、BVDV-2陽性血清和陰性血清（已56℃水浴滅活30min）。

病毒液：BVDV-1（Oregon C24V株）和BVDV-2（890株）分別接種MDBK細胞收獲的培養物，測定TCID50后，分裝于小管，－70℃以下保存備用。

細胞：MDBK傳代細胞或BT傳代細胞，細胞形態良好。

（4）試驗步驟

1）制備單層細胞　將MDBK傳代細胞或BT傳代細胞用25%EDTA胰酶消化液消化分散后，用細胞培養液分散為濃度為1×106～2×106個/ml，分裝細胞培養瓶，37℃恒溫培養箱或5% CO2培養箱中靜置培養24～48h，形成單層備用。

2）接種細胞　每份樣品接種3瓶細胞，另設細胞對照2瓶。接種前，先棄去細胞培養瓶中的培養液，按最終細胞維持液體積的10%加入已經處理好的樣品，37℃吸附2～3h，補加細胞維持液（配方見附錄A）。細胞對照瓶不接種樣品，棄去培養液后加入等量細胞維持液。均置于37℃恒溫培養箱或5% CO2培養箱中培養。

3）觀察和記錄　每天觀察并記錄。如對照細胞單層完好，細胞形態正?；蛏杂兴ダ?，接種病料的細胞如出現CPE，且70%以上細胞出現CPE時，取出并置－70℃以下凍存備用。無CPE的細胞瓶，于接種后96～144h，取出并置－70℃以下凍存備用。

4）盲傳　將第1代無CPE的細胞培養物凍融3次后混合，3000r/min離心10min，取上清液按2）接種細胞，按3）進行觀察、記錄、收毒，盲傳第2代。此過程中培養物仍無CPE則按同樣的方法繼續盲傳第3代，培養結束后無論是否出現CPE均收毒，置－70℃以下凍存備用。取盲傳3代的培養物進行檢測。

5）熒光染色鑒定

① 按1）方法制備濃度為（1～2）×106個/ml的MDBK傳代細胞或BT傳代細胞，分裝于96孔細胞板中，0.1mol/孔，將細胞板置于37℃、5% CO2培養箱中培養24h。

② 將3）和4）備用樣品凍融3次后混合，3000r/min離心10min，取上清液接種于長成80%以上細胞單層的96孔細胞板中（接種前棄去培養板孔中的細胞營養液），0.1ml/孔，每個樣品接種4孔，同時陽性對照BVDV-1毒株和BVDV-2毒株各接種4孔。設不接毒的正常細胞對照4孔。

③ 接種后細胞板置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養吸附2～3h，每孔補加維持液0.1ml，置37℃、5% CO2培養箱中繼續培養72～120h，其間顯微鏡下觀察每一個孔是否出現CPE。

④ 培養結束后，棄去細胞板孔中液體，用PBS輕輕洗滌一次，吸干，加入80%的冷丙酮，0.1ml/孔，4℃固定10～15min。

⑤ 固定好的樣品進行免疫熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察各細胞孔中的熒光情況并記錄觀察結果，具體操作如下：

a.棄去孔中丙酮，室溫自然晾干。每孔分別加入FITC標記的抗BVDV熒光抗體（同時抗BVDV-1和BVDV-2）工作液50μl，37℃孵育1h；或每孔先加入?？笲VDV-1和?？笲VDV-2特異性陽性血清混合工作液或BVDV-1和BVDV-2單克隆抗體混合工作液50μl，37℃孵育1h后，PBS洗滌3次，再每孔加入FITC標記的抗牛IgG熒光抗體或FITC標記的抗鼠IgG熒光抗體工作液50μl，37℃孵育1h。

b.PBS洗滌3次后，棄去孔中液體。

c.在倒置熒光顯微鏡下觀察各細胞孔中的熒光情況并及時記錄，記錄可分為：

（－）——無熒光；

（+）——熒光微弱，細胞形態不清晰；

（++）——熒光較亮，細胞形態清晰；

（+++－++++）——熒光較強，明亮閃爍，細胞形態清晰。

⑥ 根據熒光染色觀察結果，按照以下條件及標準進行試驗結果判定。

a.試驗成立的條件如下：⑤、c.項正常細胞對照應為（－），2個陽性對照均應為（++）或（+++－++++），否則判為結果無效，應重檢。

b.在試驗成立的前提下，樣品檢測結果判定為：當⑤、c.項被檢樣品的結果為（++）或（+++－++++）時被檢樣品為BVDV陽性，當⑤ 、c.項被檢樣品結果為（+）時應重檢，重檢結果與首次結果一樣時，判定被檢樣品為BVDV陽性。其他情況判定被樣品BVDV陰性。

6）Real-time-PCR檢測法鑒定

① 樣品核酸提取　將3）和4）備用樣品凍融3次后混合，3000r/min離心10min，取上清液，按2）提取核酸。

② 擴增試劑的準備與配制　按2、（4）、3）準備與配制擴增試劑。

③ 加樣　按2、（4）、4）加樣。

④ Real-time RT-PCR　按2、（4）、5）進行Real-time RT-PCR檢測。

⑤ 結果判定　按2、（4）、6）進行結果判定。

7）綜合結果判定

5）和6）可以單獨使用或聯合使用進行BVDV鑒定。當單獨使用時，按照相應鑒定方法的結果判定進行檢測結果判定。當聯合使用時，按5）、⑥或（和）6）、⑤結果判定被檢樣品為BVDV陽性的，判定被檢樣品為BVDV陽性；按5）、⑥和6）、⑤結果判定被檢樣品均為BVDV陰性的，判定被檢樣品為BVDV陰性。

2.實時熒光RT-PCR檢測

（1）儀器　臺式離心機（最高離心速度不低于5000r/min）、高速臺式冷凍離心機（最高離心速度不低于12000r/min）、熒光PCR檢測儀及配套反應管（板）、旋混合振蕩器、冰箱（2～8℃、－20℃、－70℃）、單道微量移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、300μl、1000μl）。

（2）耗材　無核酸酶離心管（1.5ml）、采樣管（5ml、10ml）、剪刀（含彎頭剪刀）、鑷子（含彎頭鑷子）、采樣專用商品化棉拭子、標簽、PCR反應管、無核酸移液器吸頭（10μl、200μl、300μl、100μl）。

（3）試劑

1）總則：除另有說明，所用試劑均為分析純，所用液體試劑均需使用無RNA的容器進行分裝。

2）TRIzol（2～25℃）、氯仿（2～8℃）、異丙醇（－20℃）、 Catrimox-14，均為商品化試劑。

3）DEPC水：見附錄A。

4）75%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，－20℃預冷。

5）PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和鏈霉素）：配方見附錄A。

6）BVDV Real time RT-PCR檢測引物、探針序列，反應液配方見附錄B。

7）Real-time RT-PCR試驗陽性、陰性對照應滿足以下要求：

① 陽性對照為滅活BVDV的細胞培養物（制備方法見附錄C）或BVDV5’-UTR基因體外轉錄cRNA溶液（制備方法見附錄C）。

② 陰性對照為正常MDBK傳代細胞培養液或已知BVDV陰性的動物組織懸液。

（4）試驗步驟

1）實驗室的標準化設置與生物安全管理　本方法的實驗室設置與管理見GB/T 19438.1—2004。

2）樣品核酸提取

① 在樣本制備區進行。采取TRIzol裂解法提取，也可采用其他等效的RNA提取方法，如柱式提取法。

② 待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5ml離心管，逐管編號。

③ 每管加入600μlTRIzol。

④ 每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200μl充分混勻。

⑤ 每管加入200μl氯仿，充分顛倒混勻。于4℃、12000r/min離心15min。

⑥ 新取n個滅菌的1.5ml離心管，逐管編號，每管加入500μl異丙醇。

⑦ 吸取⑤中各管中的上清液500μl，轉移至⑥中相應的管中，避免吸出中間層，顛倒混勻。

⑧ 于4℃、12000r/min離心15min，輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，瀝干液體，不同樣品應在吸水紙不同位置瀝干。

⑨ 逐管加入600μl 75%乙醇，顛倒洗滌。

⑩ 于4℃、12000r/min離心10min，輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，瀝干液體，不同樣品應在吸水紙不同位置瀝干。

? 4000r/min離心10s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量移液器盡量將其吸干。

? 室溫干燥3min。

? 每管加入25μl DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，獲得RNA溶液，冰浴保存備用。

3）擴增試劑的準備與配制

① 在反應混合物配制區進行。

② 每個檢測反應體系需使用15μl Real-time RT-PCR反應液。根據2）、②中設定的n值，按表1-22配制反應液，充分混勻后分裝，每管15μl。轉移反應管至樣本制備區。

4）加樣

① 在樣本制備區進行。

② 在上述3）、②的反應管中分別加入2）、?中制備的RNA溶液10μl，使每管總體積達到25μl，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時離心。

5）Real-time RT-PCR

① 在檢測區進行。

② 將在4）、②加樣后的反應管放入熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定FAM作為報告基團，BHQ1作為無熒光淬滅基團。反應參數設置如下：

a.第一階段，反轉錄42℃/30min；

b.第二階段，預變性94℃/3min；

c.第三階段，92℃/15s，45℃/30s，72℃/60s，5個循環；

d.第四階段，92℃/10s，56℃/60s，40個循環，在c.第三階段每個循環的退火延伸時收集熒光。試驗結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。

6）結果判定

① 結果分析條件設定：根據儀器噪聲情況對閾值進行調整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴增線的最高點為準。

② 質控標準同時滿足以下兩個條件，試驗有效，否則，此次實驗視為無效：

a.陰性對照應無Ct值并且無擴增曲線；

b.陽性對照的Ct值應≤28，并出現典型的擴增曲線。

③ 根據Ct值對實驗結果進行描述及判定：

a.無Ct值，且無擴增曲線，表示樣品中無BVDV核酸，判為陰性；

b.Ct值≤35，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中存在BVDV核酸，判為陽性；

c.Ct值>35，且出現典型的擴增曲線的樣品需復檢。復檢仍出現上述結果的，判為陽性。

附錄A

（規范性附錄）

溶液配制

以下所用試劑均為分析純：

A.1　PBS配方

A.1.1　A液

0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6g，溶于去離子水中，最后定容至1000ml，備用。

A.1.2　B液

0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6g（或NaH2PO4·12H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g），加去離子水溶解，最后定容至1000ml，備用。

A.1.3　0.01mol/L pH7.2 PBS的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl 8.5g，用去離子水定容至1000ml，經過濾除菌后，備用。

A.1.4　PBST的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl 8.5g、0.5ml吐溫-20，用去離子水定容至1000ml。經過濾除菌后，備用。

A.1.5　0.01mol/L、pH7.2 PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和鏈霉素）的配制

取A液14ml、B液36ml，加NaCl8.5g、牛血清白蛋白5g，用去離子水定容至1000ml，經過濾除菌后，無菌條件下分別按10000U/ml，加入青霉素和鏈霉素，備用。

A.2　細胞培養液與細胞維持液

A.2.1　細胞培養液

Eagle’s-MEM培養液　　　　87.5ml

FBS　　　                            　10ml

7.5%碳酸氫鈉　　　           　1.5 ml

調節pH至7.2～7.4，充分混勻，現配現用。

A.2.2　細胞維持液

Eagle’s-MEM培養液　　　　95.5ml

FBS　　　                            　2 ml

7.5%碳酸氫鈉　　　          　1.5ml

調節pH至7.2～7.4，充分混勻，現配現用。

A.3　DEPC水

將DEPC加入去離子水中至終濃度為0.1%，充分混勻后作用12h，分裝，121℃±2℃高壓滅菌30min，冷卻后冷藏備用。

附錄B

（規范性附錄）

引物探針序列及Real-Time RT-PCR反應液配方

B.1　引物探針序列（見表1-19）

B.2　Real-Time RT-PCR反應液配方（表1-20）

附錄C

（規范性附錄）

Rel-time RT-PCR試驗陽性對照制備方法

C.1　滅活BVDV的細胞培養物制備方法

取毒價達5.6×105TCID/0.1ml的 BVDV Oregon C24V毒株的細胞培養物，根據稀釋后的體積添加0.5%甲醛溶液滅活，37℃過夜。

C.2　BVDV5’-UTR基因體外轉錄cRNA溶液制備方法

BVDV5’-UTR基因體外轉錄cRNA溶液，是通過回收BVDV Oregon C24V毒株5’UTR基因的RT-PCR擴增產物（引物序列見表1-21，反應液配方及反應條件見表1-22），長度為386bp，與pMD-T20載體進行連接，轉化TOP10感受態細胞，裂解法提取質粒DNA，經PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組質粒（命名為pMD20-BVDV-5U），再以純化的質粒為模板，將質粒線性化之后，用試劑盒進行體外轉錄，將體外轉錄產物用Dnase除去其中的DNA模板再經TRIzol提取RNA進行濃度測定后，即得到制備BVDV陽性對照所需的RNA陽性對照品母液。將母液10倍系列稀釋之后，可作為 BVDVReal-time RT-PCR方法的陽性對照使用。