四、綿羊痘和山羊痘

綿羊痘和山羊痘是由綿羊痘病毒和山羊痘病毒引起的綿羊和山羊的一種急性、熱性傳染病，是OIE規(guī)定的A類動物疫病，也是我國劃定的一類動物疫病。

綿羊痘又名綿羊天花，是各種家畜痘病中危害最為嚴重的一種熱性、接觸性傳染病。其特征是無毛或少毛部位皮膚和黏膜上發(fā)生特異的痘疹，可見到典型的斑疹、丘疹、水泡、膿皰和結(jié)痂、脫落等病理過程。該病在非洲的赤道以北地區(qū)、中東、土耳其、伊朗、阿富汗、巴基斯坦、印度及尼泊爾等地區(qū)呈地方性流行，1984年以后還流行于孟加拉國。現(xiàn)由于引種頻繁等原因我國也有該病發(fā)生。

（一）病毒特征

病原是綿羊痘病毒和山羊痘病毒，屬于痘病毒科羊痘病毒屬的成員。綿羊痘病毒（Sheep pox virus）為雙股DNA病毒，病毒粒子呈磚形或橢圓形，大小為115～194nm，較其他動物痘病毒稍小而細長。病毒主要存在于病羊皮膚、黏膜的丘疹、膿皰以及痂皮內(nèi)，鼻分泌物、發(fā)熱期血液內(nèi)也有病毒存在。

痘病毒對皮膚和黏膜上皮細胞具有特殊的親和力。病毒侵入機體后，先在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增殖，后進入血液（病毒血癥），擴散全身，在皮膚和黏膜的上皮細胞內(nèi)繁殖，引起一系列的炎癥過程而發(fā)生特異性的痘疹。

病毒對熱、直射陽光、堿和多數(shù)常用消毒藥均較敏感，如58℃ 5min或37℃ 24h即可殺死病毒。但對寒冷和干燥的抵抗力較強，凍干至少可保存3個月以上；在痂皮中痘病毒能耐受干燥，自然環(huán)境中能存活6～8周，在動物毛中保持活力2個月。

病毒可在綿羊、山羊、犢牛等睪丸細胞和腎細胞以及幼倉鼠腎細胞內(nèi)增殖，并產(chǎn)生細胞病變；也可經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種于發(fā)育的雞胚內(nèi)增殖。通常可于增殖細胞內(nèi)產(chǎn)生包涵體。

（二）臨床癥狀

綿羊痘潛伏期平均為6～8d，典型病羊體溫升高達41～42℃，食欲減少，精神不振，結(jié)膜潮紅，有漿液、黏液或膿性分泌物從鼻孔流出，呼吸和脈搏增速，經(jīng)1～4d出現(xiàn)痘疹。

痘疹多發(fā)生于皮膚無毛或少毛部位，如眼周圍、唇、鼻、乳房、外生殖器、四肢內(nèi)側(cè)和尾內(nèi)側(cè)。開始為紅斑，1～2d后形成丘疹，突出皮膚表面，隨后丘疹逐漸擴大，變成灰白色或淡紅色、半球狀的隆起結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)在幾天之內(nèi)變成水泡，水泡內(nèi)容物起初呈漿液性，后變成膿性，如果無繼發(fā)感染則在幾天內(nèi)干燥成棕色痂塊，痂塊脫落后形成紅斑，隨著時間的推移紅色逐漸變淡。

非典型病例不呈現(xiàn)上述典型癥狀或經(jīng)過，僅出現(xiàn)體溫升高和黏膜卡他性炎癥，不出現(xiàn)或僅出現(xiàn)少量痘疹，或僅出現(xiàn)硬結(jié)塊，在幾天內(nèi)干燥后脫落，不形成水泡和膿皰，此為良性經(jīng)過，即所謂的頓挫型。有的病例見痘疹內(nèi)出血，呈黑色痘。還有的病例痘皰發(fā)生化膿和壞疽，形成很深的潰瘍，發(fā)出惡臭。常為惡性經(jīng)過，病死率達20%～50%。

山羊痘的臨診癥狀和剖檢病變與綿羊相似，其特征是發(fā)熱，有黏液性、膿性鼻漏，在皮膚和黏膜上形成痘疹。在診斷時注意與羊的傳染性膿皰鑒別，后者發(fā)生于綿羊和山羊，主要在口唇和鼻周圍皮膚上形成水泡、膿皰，后結(jié)成厚而硬的痂，一般無全身反應。

（三）病理變化

特征性病變是在咽喉、氣管、肺、肝和前胃或第四胃黏膜上出現(xiàn)痘疹，有大小不等的圓形或半球形堅實的結(jié)節(jié)，單個或融合存在，有的病例還形成糜爛或潰瘍。咽和支氣管黏膜亦常有痘疹，在肺見有干酪樣結(jié)節(jié)和卡他性肺炎區(qū)，腸道黏膜少有痘疹變化。此外，常見細菌性敗血癥變化，如肝脂肪變性、心肌變性、淋巴結(jié)急性腫脹等。病羊常死于繼發(fā)感染。

（四）流行病學特征

易感動物：在自然情況下，綿羊痘病毒只感染綿羊，不傳染給山羊和其他家畜；山羊痘病毒感染山羊，少數(shù)毒株則可感染綿羊，并引起綿羊和山羊的惡性痘病。不同品種、性別、年齡的綿羊都有易感性，以細毛羊最為易感；羔羊比成年羊易感，病死率亦高。妊娠母羊易引起流產(chǎn)，因此在產(chǎn)前流行羊痘，可導致很大損失。但本土動物的發(fā)病率和病死率較低，主要感染從外地引進的綿羊新品種。

傳染源：主要是病羊和帶毒羊。病毒由本病病羊分泌物、排泄物和痂皮排出。

傳播途徑：主要途徑為皮膚的傷口，在流行時可通過呼吸道傳染，也可由廄蠅等吸血昆蟲叮咬而感染。飼養(yǎng)管理人員、護理用具、皮毛、飼料、墊草、外寄生蟲等是傳播的媒介。

流行因素及形式：本病多發(fā)生于冬末春初，呈地方性流行。氣候嚴寒、雨雪、霜凍、草缺乏和飼養(yǎng)管理不良等因素都可促使本病發(fā)生和病情加重。

（五）預防及治療

預防措施：平時加強飼養(yǎng)管理，抓好秋膘，特別是冬春季適當補飼，注意防寒過冬。在綿羊痘常發(fā)地區(qū)的羊群，每年定期預防接種；受威脅的羊群均可用羊痘雞胚化弱毒疫苗進行緊急接種，注射后4～6d產(chǎn)生可靠的免疫力，免疫期可持續(xù)1年。

撲滅措施：當發(fā)現(xiàn)病例時，立刻按照《中華人民共和國動物防疫法》的規(guī)定采取緊急、強制性的控制和撲滅措施。封鎖疫區(qū)，對病羊隔離、撲殺，并作無害化處理，徹底消毒被病畜污染的環(huán)境。

治療措施：本病尚無特效藥，常采取對癥治療等綜合性措施。發(fā)生痘疹后，局部可用0.1%高錳酸鉀溶液洗滌，擦干后涂抹紫藥水或碘甘油等。康復羊血清有一定的防治作用。預防量：成年羊每只5～10ml，小羊2.5～5ml；治療量加倍，皮下注射。若已進入膿皰期則加大劑量。如用免疫血清早期治療，效果更好。抗菌藥物對本病無效，但可防止并發(fā)感染，可根據(jù)實際情況合理應用。

（六）實驗室檢測

綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)

依據(jù)標準：NY/T 576—2015。

實驗室診斷技術(shù)

（1）樣品采集　取活體或剖檢羊的皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結(jié)用于病毒分離和抗原檢測；病料采集時間為臨床癥狀出現(xiàn)后1周之內(nèi)。采集病毒血癥期間的組織進行病理組織學檢查，病料為病變及病變周圍組織，采集后迅速置于10倍體積的10%福爾馬林溶液中。經(jīng)頸靜脈無菌采集血液，分離血清，置于－20℃保存，用于血清學檢測。

（2）樣品運輸　福爾馬林浸潤的組織在運輸時無特殊要求，用于病毒分離和抗原檢測的樣品應置于4℃或－20℃保存。如果樣品在無冷藏條件下需要運送到較遠的地方，應將樣品置于含10%甘油的 Hank’s液中，用于血清學檢測的樣品，應置于加冰的冷藏箱內(nèi)運輸。

（3）病原鑒定

1）病毒分離

① 材料。MEM培養(yǎng)液（配制方法見附錄A）、待檢組織、綿羊羔睪丸細胞（制備方法見附錄B）、胎牛血清細胞培養(yǎng)瓶。

② 方法

a.樣品制備：取待檢組織，無菌剪碎，用組織勻漿器研磨；按1∶10的比例加入MEM培養(yǎng)液制備組織懸液，4℃過夜；1500r/min離心10min，取上清備用。

b.接種：取25cm2細胞培養(yǎng)瓶，待綿羊羔睪丸細胞形成90%單層后，接種1ml病料上清液，置37℃吸附1h。棄去瓶內(nèi)液體，補足細胞維持液，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。同時，設立正常細胞對照1瓶。

c.培養(yǎng)及觀察：每日觀察細胞培養(yǎng)物是否出現(xiàn)CPE，持續(xù)培養(yǎng)14d，在培養(yǎng)期間可適時更換MEM培養(yǎng)液。如果14d仍未見CPE，將細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，取上清液繼續(xù)接種綿羊羔睪丸細胞，一旦出現(xiàn)CPE，可進行包涵體染色檢查。

③ 判定。羊痘病毒感染綿羊羔睪丸細胞的特征性CPE為細胞收縮變圓、界限明顯、間隙變寬，形成拉網(wǎng)狀細胞脫落，并形成嗜酸性包涵體。包涵體大小不等，最大的約為細胞核的一半。

2）電鏡負染檢查法

① 材料。待檢組織載玻片、400目電鏡、碳網(wǎng)膜、Tris EDTA（pH7.8）緩沖液、1.0%磷鎢酸（pH7.2）。

② 方法

a.樣品制備：取待檢組織，無菌剪碎，用組織勻漿器研磨，按1∶5的比例加入MEM培養(yǎng)液制備組織懸液。

b.制片。取一滴組織懸液置于載玻片上，將碳網(wǎng)膜漂浮于液滴上1min；將 Tris EDTA（pH7.8）緩沖液滴加到碳網(wǎng)膜上浸泡20s；用濾紙吸干膜上液體，滴加1.0%磷鎢酸（pH7.2）染色10s，用濾紙吸干膜上液體，待其自然干燥后用透射電鏡觀察。

c.病毒形態(tài)判定。在電鏡下觀察，病毒粒子呈卵圓形，大小為150～180nm。

3）包涵體檢查

① 材料。組織病料（置于福爾馬林溶液中或4℃保存?zhèn)溆茫⑤d玻片、蘇木精-伊紅（H.E）染色液。

② 方法。取組織病料，用切片機切成薄片置于載玻片上，或直接將病料在載玻片上制成壓片（觸片）。經(jīng)H.E染色，置于光學顯微鏡下觀察。

③ 判定。羊痘病毒感染細胞的細胞質(zhì)內(nèi)應有不定形的嗜酸性包涵體，細胞核內(nèi)應有空泡。

4）中和試驗

① 材料。MEM培養(yǎng)液（配制方法見附錄A）、綿羊羔睪丸細胞（制備方法見附錄B）、羊痘抗原及陽性血清、待檢羊組織。

② 方法

a.樣品制備。按1）的方法將待檢樣品接種細胞，并培養(yǎng)至出現(xiàn)CPE時收獲凍融后的細胞懸液，備用。

b.抗原及陽性血清。陽性血清，恢復至室溫備用。標定羊痘抗原滴度，并將抗原液用 Hank’s液進行系列稀釋至100TCID50/0.1ml。

c.加樣。取96孔細胞培養(yǎng)板，待檢樣品的細胞懸液、羊痘抗原（100TCD50/0.1ml）各加2孔，每孔0.1ml，向其中一孔加入等量陽性血清，向另一孔內(nèi)加入等量 Hank’s液；陽性血清加1孔，每孔0.1ml，再向孔內(nèi)加入等量 Hank’s液，作為陽性血清對照；Hank’s液加1孔，每孔0.2ml，作為空白對照。

d.感作。將96孔細胞培養(yǎng)板搖勻后置于37℃水溶液中1h，其間每15min振搖1次。

e.培養(yǎng)。取生長良好的綿羊羔睪丸細胞單層1瓶，按常規(guī)方法消化，調(diào)整細胞濃度至10個/ml，每孔接種細胞懸液0.1ml。接種后，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

f.觀察。培養(yǎng)4～7d，每日觀察CPE情況。

③ 結(jié)果判定。當正常細胞對照孔、羊痘抗原中和對照孔、陽性血清對照孔的細胞均無CPE，而羊痘抗原對照孔細胞有特征性CPE時，試驗成立。待檢樣品中和試驗孔細胞無CPE，而待檢樣品未中和試驗孔的細胞有特征性CPE時，判定該待檢抗原為羊痘抗原。

5）PCR試驗

① 材料。待檢樣品、羊痘病毒對照、DNA提取試劑盒、2×K Taq Master Mix（商品化試劑）、1.5%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液（商品化試劑）、 DNA Marker1（商品化試劑）、上樣緩沖液（商品化試劑）、高壓滅菌的去離子水、PCR儀、臺式高速冷凍離心機、電泳儀、電泳槽、冰箱、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器、水浴鍋、渦旋儀等。

② 方法

a.樣品處理。取待檢組織（皮膚或其他組織），無菌剪碎，用組織勻漿器研磨；按1∶10的比例加入MEM培養(yǎng)液制備組織懸液，4℃過夜；1500r/min離心10min，取上清備用；凍融的抗凝血、精液或培養(yǎng)上清液等液體樣品取0.2ml備用。

b.DNA提取，在0.2ml血液樣品中加入2μl蛋白酶K溶液（20mg/ml）或0.8ml組織樣品中加入10μl蛋白酶K溶液。按DNA提取試劑盒說明書或以下方法提取DNA。將上述樣品56℃孵育2h或過夜，再100℃加熱10h。按樣品體積1∶1的比例加入等體積的苯酚、氯仿和異戊醇溶液（體積比為25∶24∶1）。振蕩均勻，室溫孵育10min。將樣品4℃、16000g離心15min。小心收集上層水相（約200μl），并轉(zhuǎn)移到2.0ml小管中，并加入等體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉（3mol/L，pH5.3），將樣品置于20℃靜置1h。將樣品4℃、16000g離心15min，去掉上清液。用70%冷乙醇（100μl）洗滌沉淀，并4℃、16000g離心1min，棄去上清液，并徹底干燥。用30μl無RNA水懸浮溶解沉淀，置于－20℃保存，備用。

c.引物合成。按下列引物序列合成引物。

正向引物：5’-TCC-GAG-CTC-TTT-CCT-GAT-TTT-TCT-TAC-TAT-3’。

反向引物：5’-TAT-GGT-ACC-TAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-3’。

d.PCR擴增體系。按下列方法配制50μl PCR擴增反應體系：

10×PCR緩沖液　　　  　5μl

50mmol/L MgCl2 　　    　1.5μl

10mmol/L DNTP　　　　1μl

上游引物　　　　　　 　1μl

下游引物　　　　　　 　1μl

DNA模板（約10ng）　　1μl

無核酸酶水　　　　　 　39μl

e.PCR擴增條件。按下列程序進行PCR擴增：先95℃變性2min，然后按95℃變性45s、50℃退火50s、72℃延伸60s的順序循環(huán)，共循環(huán)34次，最后在72℃溫度下延伸2min，于4℃保存，備用。

f.PCR產(chǎn)物電泳。每個樣品取10μl與上樣緩沖液充分配勻，再每管取5μl加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中，在位于凝膠中央的孔加入DNA分子量標準。加樣后，按照8～10V/cm電壓，電泳40～60min（每次電泳時，每隔10min觀察1次。當加樣緩沖液中溴酚藍電泳過半至凝膠下2/5處時，可停止電泳）。電泳后，置于紫外凝膠成像儀下觀察，用分子量標準判斷PCR擴增產(chǎn)物大小。

g.結(jié)果判定。羊痘病毒陽性對照出現(xiàn)192bp的擴增條帶，且陰性對照無此擴增帶時，判定檢測有效；否則判定檢測結(jié)果無效，不能進行判斷。被檢樣品出現(xiàn)192bp擴增帶為羊痘病毒陽性，否則為陰性。

（4）血清學試驗-中和試驗法

1）材料　MEM培養(yǎng)液（配制方法見附錄A）、綿羊羔睪丸細胞（制備方法見附錄B）、羊抗原及陽性血清、待檢羊血清。

2）方法

① 樣品處理。經(jīng)靜脈無菌采集待檢羊血，按常規(guī)方法分離血清，56℃滅活30min后備用。

② 抗原及陽性血清。陽性血清，恢復至室溫備用。標定羊抗原滴度，并將抗原液用Hank’s液進行系列稀釋至100TCID50/0.1ml。

③ 加樣。取96孔細胞培養(yǎng)板，待檢血清、陽性血清各加2孔，每孔0.1ml，向其中一孔加入等量羊抗原（100TCID50/0.1ml），向另一孔內(nèi)加入等量Hank’s液；羊痘抗原（100TCID50/0.1ml）加1孔，加入0.1ml，再向孔內(nèi)加入等量Hank’s液，作為抗原對照；Hank’s液加1孔，加入0.2ml，作為空白對照。

④ 感作。將96孔細胞培養(yǎng)板搖勻后置于37℃中和1h，其間每15min振搖1次。

⑤ 培養(yǎng)。取生長良好的綿羊羔睪丸細胞單層1瓶，按常規(guī)方法消化，調(diào)整細胞濃度至10個/ml，每孔接種細胞懸液0.1ml。接種后，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

⑥ 觀察。培養(yǎng)4～7d，每天觀察CPE情況。

3）結(jié)果判定　當正常細胞和血清毒性對照孔細胞無CPE，而接種抗原對照孔細胞有明顯CPE時，試驗成立。

待檢血清中和后，試驗孔細胞出現(xiàn)特征性CPE，判定該血清為羊痘病毒抗體陰性；待檢血清中和后，試驗孔細胞未出現(xiàn)CPE，判定該血清為羊痘病毒抗體陽性。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

營養(yǎng)液及溶液的配制

A.1　Hank’s液（10×濃縮液）

A.1.1　成分

A.1.1.1　成分甲

氯化鈉　　　　80.0g

氯化鉀　　　　4.0g

氯化鈣　　　　1.4g

硫酸鎂　　　　2.0g

A.1.1.2　成分乙

磷酸氫二鈉　　　　1.52g

磷酸二氫鉀　　　　0.6g

葡萄糖　　　　        10.0g

1.0%酚紅　　　   　16.0ml

A.1.2　配制方法

按順序?qū)⑸鲜龀煞址謩e溶于450ml注射用水中，即配成甲液和乙液，然后將乙液緩緩加入甲液，邊加邊攪拌。補足注射用水至1000ml，用濾紙過濾后，加入三氯甲烷2ml，置于2～8℃保存。

A.1.3　使用

使用時，用注射用水稀釋10倍，107.6kPa滅菌15min，置2～8℃保存?zhèn)溆茫褂们埃?/span>7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.2～7.4。

A.2　7.5%碳酸氫鈉溶液

A.2.1　成分

碳酸氫鈉　　　     　7.5g

注射用水　　　　　100 ml

A.2.2　配制方法

將上述成分溶解，0.2μm濾器濾過除菌，分裝于小瓶中，置－20℃保存。

A.3　1.0%酚紅溶液

A.3.1　成分

酚紅　　　                　10.0g

1mol/L氫氧化鈉溶液　不超過60 ml

注射用水補足至1000ml

A.3.2　配制方法

1mol/L氫氧化鈉溶液的制備：取澄清的氫氧化鈉飽和液56.0ml，加注射用水至1000ml即可。稱酚紅10.0g，加1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，攪拌溶解。靜置后，將已溶解的酚紅溶液倒入1000ml容器內(nèi)。未溶解的酚紅繼續(xù)加入1mol/L氫氧化鈉溶液20ml，攪拌使其溶解。如仍未完全溶解，可繼續(xù)加少量1mol/L氫氧化鈉溶液攪拌。如此反復，直至酚紅完全溶解，但所加1mol/L氫氧化鈉溶液總量不得超過60ml。補足注射用水至1000ml，分裝小瓶，107.6kPa滅菌15min后，置2～8℃保存。

A.4　0.25%胰蛋白溶液

A.4.1　成分

氯化鈉　　　                        　8.0g

氯化鉀　　　                        　0.2g

檸檬酸鈉　　                    　　1.12g

磷酸二氫鈉　　                    　0.056g

碳酸氫鈉　　                    　　1.0g

葡萄糖　　　　                    　1.0g

胰蛋白酶（1∶250）　　　　2.5g

注射用水加至1000ml

A.4.2　配制方法

待胰酶充分溶解后，0.2μm濾器濾過除菌，分裝于小瓶中，置于－20℃保存。使用時，用7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.4～7.6。

A.5　EDTA-胰蛋白酶分散液（10×濃縮液）

A.5.1　成分

氯化鈉　　　                    　　80.0g

氯化鉀　　　                    　　4.0g

葡萄糖　　　                    　　10.0g

碳酸氫鈉　　　                 　　5.8g

胰蛋白酶（1∶250）　　　　5.0g

乙二胺四乙酸二鈉　　     　　2.0g

按順序溶于900ml注射用水中，然后加入下列各液：

1.0%酚紅溶液　　　            　2.0ml

青霉素（10萬IU/ml）　　　　10.0ml

鏈霉素（10萬μg/ml）　　　   10.0ml

補足注射用水至1000ml

A.5.2　配制方法

將上述成分按順序溶解，0.2μm濾器濾過除菌，分裝小瓶，－20℃保存。臨用前，用注射用水稀釋10倍，作為分散工作液，適量分裝，置于－20℃凍存?zhèn)溆谩７稚⒓毎麜r，將工作液取出，置于37℃水浴融化，并用7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7.6～8.0。

A.6　抗生素溶液（1萬IU/ml）

A.6.1　　　                       　10×濃縮液

青霉素　　　                    　400萬IU

鏈霉素　　　　                    400萬μg

注射用水　　　                　40 ml

充分溶解后，0.2μm濾器濾過除菌，分裝小瓶，置于－20℃保存。

A.6.2　工作溶液

取上述10×濃縮液適量，用注射用水稀釋10倍，分裝后置于－20℃保存。

A.7　H.E染色液

A.7.1　Harris蘇木精染液

蘇木精無水乙醇　　 　  　1.0g

硫酸鋁鉀　　　　　       　10.0ml

蒸餾水　　　　　　　　　200.0ml

氧化汞　　　                   　0.5g

冰醋酸　　　                   　8.0ml

先用無水乙醇溶解蘇木精，用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，再將這兩種液體混合后煮沸（約1min）。離火后，向該混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒攪拌染色液直至變?yōu)樽霞t色，用冷水冷卻至室溫，然后，加入冰醋酸并混合均勻，過濾后使用。

A.7.2　伊紅染液

伊紅染液有水溶性和醇溶性2種，常用0.5%水溶性伊紅染液，配方如下：

伊紅Y　　　                     　0.5g

蒸餾水　　                   　　100ml

冰醋酸　　　                   　1滴

先用少許蒸餾水溶解伊紅Y，然后加入全部蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻。用冰醋酸將染液調(diào)至pH4.5左右，過濾后使用。

A.7.3　鹽酸-乙醇分化液

濃鹽酸　　　                   　1.0ml

75%乙醇　　               　　99.0ml

A.8　MEM培養(yǎng)液

A.8.1　成分

MEM干粉培養(yǎng)基按說明書要求

注射用水　　　             　1000ml

A.8.2　配制方法

稱取適量干粉培養(yǎng)基，加入注射用水500ml，磁力攪拌使之完全溶解，根據(jù)說明書要求補加碳酸氫鈉、谷氨酰胺和其他特殊物質(zhì)，加水定容到終體積，調(diào)節(jié)pH7.4～7.6，0.2μm濾膜過濾除菌，無菌分裝，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/span>

配制好的培養(yǎng)液用前加入胎牛血清，細胞培養(yǎng)液胎牛血清含量為5%～10%，細胞維持液胎牛血清含量為1%～2%。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

綿羊羔睪丸細胞的制備

B.1　原代細胞制備

取4月齡以內(nèi)健康雄性綿羊，以無菌手術(shù)摘取睪丸，剝棄白膜，剪成1～2mm小塊，用Hank’s液（見附錄A）清洗3～4次。按睪丸組織量的6～8倍加入0.25%胰酶溶液（見附錄A），置于37℃水浴消化。待睪丸組織呈膨松狀，棄去胰酶溶液，用玻璃珠振搖法分散細胞，并用MEM培養(yǎng)液稀釋成每毫升含100萬左右細胞數(shù)，分裝細胞瓶，37℃靜置培養(yǎng)，2～4d即可長成單層。

B.2　次代細胞制備

取生長良好的原代細胞棄去生長液，加入原培養(yǎng)液量1/10的EDTA-胰蛋白酶分散液（見附錄A），消化2～5min。待細胞層呈雪花狀時，棄去胰酶分散液。加少許MEM培養(yǎng)液吹散細胞，然后按1∶2的分種率，補足MEM培養(yǎng)液。混勻、分裝細胞瓶，置于37℃靜置培養(yǎng)。細胞傳代應不超過5代。