二、小反芻獸疫

小反芻獸疫俗稱羊瘟，又名小反芻獸假性牛瘟、口炎肺腸炎復合癥，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染小反芻動物，以發熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。

1942年本病首次在象牙海岸發生，其后，非洲的塞內加爾、加納、多哥、貝寧等有本病報道，尼日利亞的綿羊和山羊中也發生了本病，并造成了重大損失。亞洲的一些國家也報道了本病，根據國際獸疫局（OIE）1993年《世界動物衛生》報道，孟加拉國的山羊有本病發生，印度安德拉邦和馬哈拉施特拉邦的部分地區綿羊中發生了類似牛瘟的疾病，最后確診為小反芻獸疫，此后，泰米爾納德邦也有受到感染報道。1993年，以色列第一次報道有小反芻獸疫發生，傳染來源不明，為防止本病傳播，以色列對其北部地區的綿羊和山羊接種了牛瘟疫苗。1992年，約旦的綿羊和山羊中發現了本病特異性抗體，1993年，有11個農場出現臨診病例，100多只綿羊和山羊死亡。1993年，沙特阿拉伯首次發現133個病例。

（一）病毒特征

小反芻獸疫病毒屬副黏病毒科麻疹病毒屬，與牛瘟病毒有相似的物理化學及免疫學特性。病毒呈多形性，通常為粗糙的球形。病毒顆粒較牛瘟病毒大，核衣殼為螺旋中空桿狀并有特征性的亞單位，有囊膜。病毒可在胎綿羊腎、胎羊及新生羊的睪丸細胞、Vero細胞上增殖，并產生細胞病變（CPE），形成合胞體。

PPRV同屬的還有海豚麻疹病毒、犬瘟熱病毒、鼠海豹麻疹病毒、牛瘟病毒和麻疹病毒，PPRV只有一個血清型。PPRV基因組為單股負鏈RNA，大小為15948nt， 基因組3’末端為基因組啟動子區，5’末端為反向基因組啟動子區，6個基因排列順序為3’-N-P-M-F-HL-5’，依次編碼的6個結構蛋白為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白 （H）和大蛋白（L），P基因還編碼兩個非結構蛋白C和V。

N蛋白通過自我組裝形成核衣殼粒子，與P蛋白和L蛋白協同作用調控病毒RNA轉錄和復制。N蛋白還是保守性較強的免疫源性蛋白，當病毒感染時可以引起強烈的抗體反應。此外，N蛋白上含有T細胞表位，在細胞免疫方面發揮著重要作用。

根據N或F基因片段核苷酸序列，均可進行系統進化分析，結果顯示PPRV分為4個基因系， Ⅰ系和Ⅱ系分布于西非，Ⅲ系病毒流行于東非、阿拉伯半島（阿曼和也門）及印度南部，Ⅳ系僅見于中東、阿拉伯和印度次大陸。比較兩種分別基于N和F基因部分序列的系統進化分析方法，N基因系統進化分析能更加有力地根據地理來源進行毒株的聚類， 分析結果體現了小反芻獸疫病毒在全球自西向東 （從西非到亞洲）的傳播，并在4個區域分別進行獨立的演變。而F基因系統進化分析更多地反映出病毒以時間為軸線的演變過程，從而為病毒在不同地理區域之間的傳播途徑提供線索。更具體的結果依賴于更多N或F基因全序列的報道。

（二）臨床癥狀

由于動物品種、年齡差異以及氣候和飼養管理條件不同而出現的敏感性不一樣，臨診癥狀表現有以下幾個類型。

最急性型：常見于山羊。在平均2d的潛伏期后，出現高燒（40～42℃），精神沉郁，感覺遲鈍，不食，毛豎立。同時出現流淚及漿液性、黏性鼻涕。口腔黏膜出現潰爛（圖1-56），或在出現之前即死亡。但常見齒充血，體溫下降，突然死亡。整個病程5～6d。

急性型：潛伏期為3～4d，癥狀和最急性型一樣，但病程較長。自然發病多見于山羊和綿羊，患病動物發病急劇，高熱41℃以上，稽留3～5d，初期精神沉郁，食欲減退，鼻鏡干燥，口、鼻腔流黏液膿性分泌物，并很快堵塞鼻孔，呼出惡臭氣體。口腔黏膜和齒齦充血，進一步發展為頰黏膜出現廣泛性損害，導致涎液大量分泌排出；從發病第5天起，黏膜出現潰瘍性病灶，感染部位包括下唇、下齒齦等處，嚴重病例可見壞死病灶波及齒齦、頰部及其乳頭、舌等處。舌被覆一層微白色漿性惡臭的浮膜，當向外牽引時，即露出鮮紅和很易出血的黏膜。后期常出現帶血的水樣腹瀉，病羊嚴重脫水、消瘦，并常有咳嗽、胸部啰音以及腹式呼吸的表現。死前體溫下降。幼年動物發病嚴重，發病率和病死率都很高。母畜常發生外陰-陰道炎，伴有黏液膿性分泌物，孕畜可發生流產。病程8～10d，有的因繼發感染而死亡，有的痊愈，也有的轉為慢性型。

亞急性或慢性型：病程延長至10～15d，常見于急性期之后。早期的癥狀和上述急性型的相同。口腔和鼻孔周圍以及下頜部發生結節和膿皰是本型晚期的特有癥狀，易與傳染性膿皰混同。

（三）病理變化

尸體病變與牛瘟相似。PPR最特殊的病變是結膜炎、壞死性口炎等肉眼病變，嚴重病例可蔓延到咽喉部。開始為白色點狀的小壞死灶，直徑數毫米。待數目增多即匯合成片，形成底面紅色的糜爛區，上覆以脫落的上皮碎片。在舌面、齒齦、上顎部位的潰瘍很快被覆一層由漿液性滲出和脫落碎屑以及多核白細胞混合構成的黃白色浮膜。若無細菌性并發感染，這些病變很快痊愈。

在咽喉和食道經常有條狀糜爛（每條長10余毫米，寬2～3mm）。鼻甲、喉、氣管等處有出血斑。肺尖葉或心葉末端可見肺炎灶或支氣管肺炎灶。瘤胃、網胃、瓣胃很少出現病變，皺胃則常出現糜爛病灶，其創面出血呈紅色。腸道有糜爛或出血變化，特別在結腸和直腸接合處常常能發現特征性的線狀出血或斑馬樣條紋。淋巴結腫大，脾有壞死性病變。慢性型口鼻周圍和下頜部出現結節，直徑5～20mm，表面粗糙黃灰色。這些病變在3周后逐漸痊愈。

（四）流行病學特征

易感動物：自然發病主要見于山羊、綿羊、羚羊、美國白尾鹿等小反芻動物，但山羊發病時比較嚴重，常呈最急性型，很快死亡。綿羊次之，一般呈亞急性經過而后痊愈，或不呈現病狀。牛、豬等呈隱性感染，通常為亞臨診經過。2～18個月的幼年動物比成年動物易感，而哺乳幼畜抵抗力相當強。

人工感染時，綿羊、山羊和牛的反應與自然感染時的反應相同，只是注射比接觸感染的潛伏期較短；豬被注射后可見抗體升高，而不見其他任何癥狀，豬和病山羊接觸也不出現血清學反應，而且易感山羊也不被注射病毒的豬所感染。因而應認為豬在此病的流行病學上不起任何作用。

傳染源：該病的傳染源主要為患病動物和隱性感染者，處于亞臨診狀態的羊尤為危險。病畜的分泌物和排泄物均含有大量病毒。

傳播途徑：本病通過直接接觸患病動物和隱性感染者的分泌物和排泄物而傳染，也可通過呼吸道飛沫傳播。尚無間接感染病例的報告。

流行因素及形式：本病的流行無明顯的季節性。在首次暴發時易感動物群的發病率可達100%，嚴重時致死率為100%；中度暴發時致死率達50%。但在老疫區，常為零星發生，只有在易感動物增加時才可發生流行。幼年動物發病嚴重，發病率和病死率都很高。

（五）預防及治療

對本病尚無有效的治療方法，發病初使用抗生素和磺胺類藥物可對癥治療和預防繼發感染。在本病的潔凈國家和地區發現病例，應嚴密封鎖，撲殺患羊，隔離消毒。對本病的防控主要靠疫苗免疫。

（1）牛瘟弱毒疫苗，因為本病毒與牛瘟病毒的抗原具有相關性，可用牛瘟病毒弱毒疫苗來免疫綿羊和山羊進行小反芻獸疫病的預防。牛瘟弱毒疫苗免疫后產生的抗牛瘟病毒抗體能夠抵抗小反芻獸疫病毒的攻擊，具有良好的免疫保護效果。

（2）小反芻獸疫病毒弱毒苗　毒常見的弱毒疫苗為Nigeria7511弱毒疫苗和Sungri/96弱毒疫苗。該疫苗無任何副作用，能交叉保護其各個群毒株的攻擊感染，但其熱穩定性差。

（3）小反芻獸疫病毒滅活疫苗　本疫苗系采用感染山羊的病理組織制備，一般采用甲醛或氯仿滅活。實踐證明甲醛滅活的疫苗效果不理想，而用氯仿滅活制備的疫苗效果較好。

（4）重組亞單位疫苗　麻疹病毒屬的表面糖蛋白具有良好的免疫原性。無論是使用H蛋白或N蛋白都作為亞單位疫苗，均能刺激機體產生體液和細胞介導的免疫應答，產生的抗體能中和小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒。

（5）嵌合體疫苗　嵌合體疫苗是用小反芻獸疫病毒的糖蛋白基因替代牛瘟病毒表面相應的糖蛋白基因。這種疫苗對小反芻獸疫病毒具有良好的免疫原性，但在免疫動物血清中不產生牛瘟病毒糖蛋白抗體。

（6）活載體疫苗　將小反芻獸疫病毒的F基因插入羊痘病毒的TK基因編碼區，構建了重組羊痘病毒疫苗。重組疫苗既可抵抗小反芻獸疫病毒強毒的攻擊，又能預防羊痘病毒的感染。

（六）實驗室檢測

小反芻獸疫診斷技術

依據標準：GB/T 27982—2011。

1.實驗室診斷

（1）樣品采集與運輸

1）樣品的采條

① 每個發病羊群最少選5只病羊采集樣品。

② 選擇處于發熱期（體溫40～41℃）、排出水樣眼分泌物、出現口腔潰瘍、無腹瀉癥狀的活畜采集樣品。采集結膜棉拭子2個、鼻黏膜棉拭子2個、頰部黏膜棉拭子1個，分別放在300μl滅菌的0.01 mol/L pH7.4鹽酸緩沖液（PBS）中。無菌采集血液10ml，用常規方法分離血清。

③ 選擇剛被撲殺或者死亡時間不超過24h的病畜采集組織樣品。無菌采集腸系膜和支氣管淋巴結各3～4個，脾、胸腺、腸黏膜和肺等組織各25～50g，分別置于50ml離心管中。

④ 肉制品取25～50g，置于50ml離心管中。

2）樣品的運輸與儲存

① 樣品采集后，置冰上冷藏送至實驗室檢測。

② 血清儲存應置于－20℃冰箱。

③ 棉拭子、病料組織和肉制品儲存應置于－70℃冰箱。

（2）器械與設備　5%二氧化碳培養箱，DNA熱循環儀，低溫高速離心機，電泳儀和電泳槽，凝膠成像系統或者紫外檢測儀，實時熒光定量PCR儀，96孔高吸附性酶標板，洗瓶或者洗板機，恒溫箱，酶標儀。

（3）病分離與基定

1）試驗材料　非洲綠猴（Vero）細胞，pH7.4磷酸鹽沖液（PBS）（見附錄A），細胞培養液（見附錄A），細胞培養瓶。

2）樣品處理　棉拭子充分捻動，擠干后棄去拭子，加入青霉素至終濃度200IU/ml，加入鏈霉素至終濃度200μg/ml，37℃作用1h，3000g離心10min，取上清液300μl作為接種材料。

用滅菌的剪刀、鑷子取大約0.5g組織樣品或肉制品，置于研缽中，剪碎，充分研磨，加入5ml 0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液（含青霉素200IU/ml，鏈霉素200μg/ml），制成1∶10懸液。37℃作用1h。3000g離心10min，取上清液5ml作為接種材料。

不能立即接種者，應將上清放－70℃保存。

3）樣品接種　取樣品上清液接種已長成單層的Vero細胞，37℃恒溫箱中吸附2h，加入細胞培養液，置5%二氧化碳培養箱37℃培養。

4）觀察結果　接種后5d內，細胞應出現細胞病變效應，表現為細胞融合、形成多核體。如接種5～6d后不出現細胞病變，應將細胞培養物盲傳三代。

5）病毒的鑒定　將出現細胞病變的細胞培養物，按“（4）RT-PCR方法”和“（5）熒光定量RT-PCR反應”做進一步鑒定。

6）結果判定　樣品出現細胞病變，而且RT-PCR方法或實時熒光RT-PCR方法鑒定結果陽性，則判為小反芻獸疫病毒分離陽性，表述為檢出小反芻獸疫病毒。否則，表述為未檢出小反芻獸疫病毒。

（4）RT-PCR方法

1）試劑與材料　除另有規定外，試劑為分析或生化試劑。實驗用水符合GB/T 6682的要求。

TRIzol試劑，三氯甲烷，異丙醇，無水乙醇，DEPC處理過的水（見附錄B），反轉錄酶/Taq DNA聚合酶混合液，2×一步法RT-PCR反應緩沖液，1.5%的瓊脂糖凝膠（見附錄B），0.5×TBE緩沖液（見附錄B），溴化乙錠。

可以采用引物NP3/NP4用于小反芻獸疫病核酸的檢測，引物的靶基因、位置、序列和擴增產物的大小見表1-16。

2）樣品處理　將棉拭子充分捻動，擠干后棄去拭子，取100L樣品液至一新的離心管中，加入1ml TRIZOL試劑，振蕩混勻，進行RNA提取。

取大約100mg組織樣品，剪碎后，加入1ml TRIzol試劑充分勻漿后轉移至1.5ml離心管中，進行RNA提取。

3）RNA提取　經IRIzol處理的樣品液12000r/min，4℃離心10min，取上清，靜置5min。加200L三氯甲烷，振蕩混勻15s，靜置2～3min，12000r/min，4℃離心15min，取400μl上層水相到新的離心管中，加400μl的異丙醇，混勻，靜置10min，12000r/min，4℃離心10min，去上清。加入75%乙醇1ml，混勻，12000r/min，4℃離心5min，去上清。再加入75%乙醇1ml，混勻，12000r/min，4℃離心5min，去上清，干燥RNA沉淀后加入100μl DEPC處理過的水溶解，立即進行RT-PCR反應。或－70℃保存。

4）RT-PCR反應　反應體系為25μl，依次加入以下成分：12.5μl 2×一步法RT-PCR反應緩沖液，1μl正向引物NP3（10μmol/L），1μl反向引物NP4（10μmol/L），1μl反轉錄/Tag DNA合混合液，4.5μl DEPC處理過的水，5μl RNA模板。

每次進行RT-PCR反應時均設標準陽性、陰性及空白對照。標準陽性用陽性對照RNA作為模板，標準陰性用Vero細胞RNA作為模板，空白對照用DEPC處理過的水作為模板。

RT-PCR反應條件為：50℃反轉錄30min；94℃，2min進行Taq酶的激活；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，共35次循環；72℃延伸7min。

5）PCR產物的電泳　取PCR產物5L在1.5%瓊糖膠中進行電泳，膠成像系統中觀察結果。

6）質控標準　小反芻獸疫病毒RT-PCR標準陽性對照有大小為351bp的特異性陽性擴增條帶，標準陰性對照和空白對照無任何擴增條帶，說明質控合格。

7）結果判定　樣品有大小為351bp的特異性陽性擴增條帶判為RT-PCR結果陽性，表述為檢出小反芻獸疫病毒。

樣品無特異性的陽性擴增條帶判為RT-PCR結果陰性，表述為未檢出小反芻獸病毒。

（5）熒光定量RT-PCR反應

1）試驗材料　TRIzol試劑，三氯甲烷，異丙醇，無水乙醇，DEPC處理過的水（見附錄B）、2×一步法熒光RT-PCR反應緩沖液，Taq DNA聚合酶，反轉錄酶，參比熒光ROXⅡ。

引物和探針：引物和探針針對小反芻獸疫病毒N基因保守序列區段設計，引物和探針的位置和序列見表1-17。

2）RNA提取　同（4）、3）。

3）熒光定量RT-PCR反應　反應體系為25μl，依次加入以下成分：12.5μl 2×1 step buffer，1μl正向引物PPRN8a（10μmol/L），1μl反向引物PPRN9b（10μmol/L），0.5pl探針PRN10p（10μmol/L），0.5μl TaqDNA聚合酶，0.5μl反轉錄酶，0.5μl參比熒光ROX，3.5μl DEPC處理過的水，5μl RNA模板。每次進行熒光定量RT-PCR時均設標準陽性、陰性及空白對照。標準陽性用陽性對照RNA作為模板，標準陰性用Vero細胞RNA作為模板，空白對照用DEPC處理過的水作為模板。

熒光定量RT-PCR反應條件為：42℃反轉錄30min；95℃，10min進行Taq酶的激活；95℃、15s，60℃、1min，共50次循環；每個循環在60℃、1min時收集熒光信號。

4）質控標準　讀取每個樣品的Ct值。

標準陽性對照樣品有特異性擴增曲線而且Ct值≤30，標準陰性對照和空白對照無特異性擴增曲線，說明質控合格。

5）結果判定　樣品有特異性擴增曲線而且Ct值≤40判為實時熒光RT-PCR擴增陽性，表述為檢出小反芻獸疫病毒核酸。

樣品Ct值>40或者無特異性擴增曲線判為實時熒光RT-PCR擴增陰性，表述為未檢出小反芻獸疫病毒核酸。

（6）競爭 ELISA方法

1）試驗材料　包被用抗原PPRV疫苗株重組N蛋白。對照血清：強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清。單克隆抗體：小反芻獸疫病毒N蛋白的單克隆抗體。結合物：辣根過氧化物標記的山羊抗小鼠血清。封閉緩沖液、洗滌緩沖液、底物溶液及終止液，配制方法見附錄C。

2）抗原包被　PPRV重組N蛋白用包被緩沖液1∶3500倍稀釋后，每孔50μl包被96孔酶標板，37℃置濕盒吸附1h，用洗滌緩沖液洗板4次。

3）血清加樣步驟　每孔加入45μl封閉緩沖液。每份待檢血清做2孔，每孔加入5μl待檢血清。設強陽性血清對照孔（C++）4個，每孔加入5μl強陽性血清，設弱陽性血清對照孔（C+）4個，每孔加入5μl弱陽性血清，設陰性血清對照孔（C－）2個，每孔加入5μl陰性血清，設單抗對照孔（Cm）4個，每孔加入5μl封閉緩沖液，設酶結合物對照孔（Cc）2個，每孔加入55μl封閉緩沖液。

4）單克隆抗體的加入　除結合物對照孔外，每孔加入50μl工作濃度的單抗，37℃置濕盒作用1h，用洗滌緩沖液洗板4次。

5）酶結合物的加入　每孔加入50μl工作濃度的酶結合物，37℃置濕盒作用1h，洗滌緩沖液洗板4次。

6）顯色與終止　每孔加入50μl底物溶液，37℃避光反應10min，每孔加入50μl終止液。

7）讀值　酶標儀預熱15min，讀取每孔492nm波長的吸光度值（OD值）。

8）計算抑制率　按照式（1-9）計算每孔（包括對照孔）的抑制率，并計算每份樣品的平均抑制率。

PI=100－（ODr÷ODc）×100　　 （1-9）

式中　PI——抑制率；

　　　ODr——試驗孔或對照孔OD值；

　　　ODc——單抗對照孔OD平均值。

9）質控標準　結果在質控標準（見表1-18）范圍內，則試驗成立。

10）結果判定　平均抑制率（PI）>80，判為強陽性；50<平均抑制率（PI）≤80，判為弱陽性，表述為小反芻獸疫血清學陽性。平均抑制率（PI）≤50，判為陰性，表述為小反芻獸疫抗體血清學陰性。

2.綜合判定

凡具有1、（3）、6），1、（4）、7），1、（5）、5），1、（6）、10）中任何一項陽性者，均判為小反芻獸疫陽性。

附錄A

（規范性附錄）

病毒分離鑒定溶液的配制

A.1　pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）

NaCl　　　　　　　　　  8.00g

KCl　　　　　　　　　　0.20g

Na2HPO4·2H2O　　　　　1.44g

KH2P0.24g

用HCl調節溶液的pH值至7.4，加去離于水至1000ml，在1.034×105Pa高壓下蒸汽滅菌20min。保存于室溫。PBS一經使用，于4℃保存不超過3周。

A.2　高糖型DMEM培養液

高糖型DMEM　　　　　13.37g

碳酸氫鈉　　　　　　　3.7g

超純水　　　　　    　　1000ml

充分溶解后，0.22μm微孔濾圓過慮除菌。4℃保存。

A.3　細胞培養液

高糖型DMEM培養液　　　　950ml

胎牛血清　　　                    　50ml

加入青霉素至終濃度200IU/ml、鏈霉素至終濃度200μg/ml、兩性霉素B至終濃度2.5μg/ml，充分混勻。4℃保存。

附錄B

（規范性附錄）

反轉錄-聚合酶鏈反應溶液的配制

B.1　DEPC處理過的水

DEPC　　　　　　　1ml

去離子水　　　            1000ml

充分混勻，將瓶蓋擰松后置于37℃放置過夜，高壓滅菌。

B.2　5×TBE緩沖液

Tris堿　　　　　　　  　54g

硼酸　　　　　　　　　27.5g

0.5mol/L EDTA　　  　　20ml

加去離子水調整體積至1000ml。

B.3　0.5×TBE緩沖液

取100ml 5×TBE緩沖液，加去離子水調整體積至1000ml。

B.4　1.5%的瓊脂糖凝膠

瓊脂糖　　　                            　0.75g

0.5×TBE緩沖液 　　　　　　　50ml

溴化乙錠溶液（10mg/ml）　　 2.5μl

稱取0.75g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml 0.5×TBE緩沖液，加熱溶解，冷卻至50～60℃時加入2.5L溴化乙錠溶液，倒入膠槽內自然凝固。

附錄C

（規范性附錄）

競爭聯免疫吸附試驗溶液的配制

C.1　包被緩沖液——0.05mol/L pH9.6碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液

Na2CO3　　　  　0.318g

NaHCO3　　　 　0.588g

去離子水　　　　200ml

用0.22μm膜過濾除菌，室溫保存備用。

C.2　洗滌緩沖液——pH7.4 PBST（0.05%吐溫-20）

吐溫-20　　　       　0.5ml

pH7.4 PBS　　　　1000ml

C.3　封閉緩沖液（含3%BSA的pH7.4 PBS）

BSA　　　            　30g

pH7.4 PBS　　　　1000ml

封閉液要臨用前配制。

C.4　底物溶液

C.4.1　A液

Na2HPO4　　　           　3.682g

檸檬酸　　　　               1.021g

過氧化氫尿素　　　　　0.06g

去離子水　　　　   　　100ml

臨用前配制，避光4～8℃保存。

C.4.2　B液

檸檬酸　　                                      　　1.05g

EDTA　　　　　　　　　　　　　　14.6mg

TMB（3，3’-二氨基聯苯胺）　　　　25.0mg

去離子水用0.45μm濾膜過濾，臨用前配制，避光4℃保存。

C.4.3　用法

使用時，將A液、B液按1∶1的比例混合。

C.5　終止液

濃硫酸　　　　　　　　　16.5ml

去離子水　　　　　　　　87.5ml

將濃硫酸緩緩加入蒸餾水中，混勻。