第三節　牛、羊病

一、口蹄疫

口蹄疫（屬一類傳染病）俗名“口瘡”“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。是豬、牛、羊等主要家畜和其他家養、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成巨大經濟損失。鑒于此，世界動物衛生組織（OIE）將其列為A類傳染病之首，我國將其列為一類動物疫病。

（一）病毒特征

口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）口瘡病毒屬（ApHthovirus），是偶蹄類動物高度傳染性疾病（口蹄疫）的病原。其最大顆粒直徑為23nm，最小顆粒直徑為7～8nm，在病毒的中心為一條單鏈的正鏈RNA，由大約8000個堿基組成，是感染和遺傳的基礎；周圍包裹著的蛋白質決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學反應能力；病毒外殼為對稱的20面體。FMDV的免疫是依賴T細胞的B細胞應答，疫苗接種主要誘導中和抗體的產生。

目前已知口蹄疫病毒在全世界有七個主型，包括 A、O、C、南非1、南非2、南非3和亞洲1型，以及65個以上亞型。O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，我國流行的口蹄疫主要為O、A、C三型及ZB型（云南保山型）。據觀察，一個地區的牛群經過有效的口蹄疫疫苗注射之后，1～2月內又會流行，這往往懷疑是另一型或亞型病毒所致。其實是因為該病毒易發生變異。

該病毒對外界環境的抵抗力很強，在冰凍情況下，血液及糞便中的病毒可存活120～170d。陽光直射下60min即可殺死；加溫至85℃15min、煮沸3min即可死亡。對酸堿敏感，故1%～2%氫氧化鈉、30%熱草木灰、1%～2%甲醛等都是良好的消毒液。

（二）臨床癥狀

該病潛伏期1～7d，平均2～4d病牛精神沉郁，閉口，流涎，開口時有吸吮聲，體溫可升高到40～41℃。發病1～2d后，病牛齒齦、舌面、唇內面可見到蠶豆到核桃大的水皰，涎液增多并呈白色泡沫狀掛于嘴邊。采食及反芻停止。水皰約經一晝夜破裂，形成潰瘍，這時體溫會逐漸降至正常。在口腔發生水皰的同時或稍后，趾間及蹄冠的柔軟皮膚上也發生水皰，也會很快破潰，然后逐漸愈合。有時在乳頭皮膚上也可見到水皰。本病一般呈良性經過，經1周左右即可自愈；若蹄部有病變則可延至2～3周或更久；死亡率1%～2%，這種病型叫良性口蹄疫。有些病牛在水皰愈合過程中，病情突然惡化，全身衰弱、肌肉發抖、心跳加快、節律不齊，食欲廢絕、反芻停止，行走搖擺、站立不穩，往往因心臟麻痹而突然死亡，這種病型叫惡性口蹄疫，死亡率高達25%～50%。犢牛發病時往往看不到特征性水皰，主要表現為出血性胃腸炎和心肌炎，死亡率極高。

（三）病理變化

除口腔和蹄部病變外，還可見到食道和瘤胃黏膜有水皰和爛斑；胃腸有出血性炎癥；肺呈漿液性浸潤；心包內有大量混濁而黏稠的液體。惡性口蹄疫可在心肌切面上見到灰白色或淡黃色條紋與正常心肌相伴而行，如同虎皮狀斑紋，俗稱“虎斑心”。

（四）流行病學特征

牛尤其是犢牛對口蹄疫病毒最易感，駱駝、綿羊、山羊次之，豬也可感染發病。本病具有流行快、傳播廣、發病急、危害大等流行病學特點，疫區發病率可達50%～100%，犢牛死亡率較高，其他則較低。病畜和潛伏期動物是最危險的傳染源。病畜的水皰液、乳汁、尿液、口涎、淚液和糞便中均含有病毒。該病入侵途徑主要是消化道，也可經呼吸道傳染。本病傳播雖無明顯的季節性，但春秋兩季較多，尤其是春季。風和鳥類也是遠距離傳播的因素。

口蹄疫傳染途徑多、速度快。發病或處于潛伏期的動物是主要傳染源。病毒可通過空氣、灰塵，病畜的水皰、唾液、乳汁、糞便、尿液、精液等分泌物和排泄物，被污染的飼料、褥草以及接觸過病畜的人員的衣物傳播?？谔阋咄ㄟ^空氣傳播時，病毒能隨風散播到50～100km以外的地方。牛、羊、豬等高易感動物，感染發病率幾乎為100%。一般來說，成年動物患口蹄疫的死亡率在5%～20%之間，幼畜的死亡率50%～80%?？谔阋卟《狙孱愋投?，易變異。已發現的口蹄疫病毒有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1 7個血清型。各型的抗原不同，不能相互免疫。

（五）預防及治療

動物患口蹄疫會影響使役，減少產奶量，一般采用宰殺并銷毀尸體進行處理，給畜牧業造成嚴重損失。國際獸疫局將口蹄疫列為“A類動物傳染病名單”中的首位。世界上許多國家把口蹄疫列為最重要的動物檢疫對象，中國把它列為“進境動物檢疫一類傳染病”。口蹄疫很少感染人類，但人類接觸或攝入污染的畜產品后，口蹄疫病毒會通過受傷的皮膚和口腔黏膜侵入人體。人口蹄疫的特征是突然發熱，口、咽、掌等部位出現大而清亮的水皰，無有效的治療辦法，這些癥狀經2～3周后可自然恢復，不留疤痕。因此，對人體健康的危害不大。

有效防治豬口蹄疫的措施為做好日常預防工作。減少豬口蹄疫發生的關鍵在于預防，主要應采取以下措施：

（1）消毒　消毒是日常預防工作的重點，選擇口蹄疫敏感消毒劑，在多發季節要每天利用消毒劑進行1 次消毒，其他時間段一個星期消毒1～2 次。消毒范圍包括豬場大門、豬圈門口、豬蹄等，最好在豬圈門口設置消毒池，便于消毒。

（2）口蹄疫接種　相關部門要加強豬口蹄疫疫苗接種宣傳，并指導養殖戶選擇正確的接種疫苗。具體來說要做好以下三點：第一，對于疫區來說，可采取自制的康復血清對小豬接種，預防小豬因突發急性心肌炎死亡。第二，對于規?；B殖場來說，要采取疫苗注射、消毒、病豬及時隔離等措施，特別是在高發季節。一旦發生口蹄疫，則要立即隔離病豬，并撲殺病情嚴重、傳染性強的豬，并注射康復血清。第三，嚴格按照免疫程序執行。根據豬口蹄疫發病特點、病理、癥狀等制定合理的免疫程序并嚴格執行。一般來說種母豬1 年要免疫2～3 次，且配種前必須免疫1 次；對于初產母豬來說，配種期間要免疫2 次，且2 次免疫間相隔1 個月左右。對于小豬來說，在其出生55～65d 之間，要進行第1 次免疫，隨后25～30d 內進行第二次免疫。第四，選擇高效、正確的疫苗。可采用合成肽疫苗，且接種疫苗時要輔以黃芪多糖，既可以保護豬，減少不良反應，而且可以提高免疫效果。

治療對策：對癥治療，促進創口愈合。根據病豬不同臨床表現采取針對性的治療方法。對于臨床癥狀無特異性、納差的病豬來說，采取口蹄一針靈、黃芪多糖等治療，治療1天。且在飼料或水中適當添加維生素C，補充營養。對于乳房、豬蹄水皰明顯的病豬來說，采取黃芪多糖、阿莫西林及恩諾沙星聯合治療，1 次/d，治療3d。同時用碘甘油涂抹創口，高錳酸鉀治療口腔內潰瘍等。對于康復期的病豬來說，要連續給予阿莫西林治療7～10d。此外，口蹄疫發病期間，要用碘制劑、過氧乙酸等合理消毒，1 次/d。同時火堿沖洗空豬圈及病死豬圈，其他地方撒生石灰。年齡、體重不同，治療方案不同。超過25kg的豬只需消炎排毒，如采用阿莫西林。若疼痛難忍，則給予破痛寧治療，緩解豬疼痛，使之能站立進食。若病豬出現口腔內潰瘍癥狀，則要用高錳酸鉀沖洗口腔。乳房等部位可涂抹青霉素軟膏。不足1kg的豬可能存在急性心肌炎潛在威脅，為此要行康復血清緊急接種，降低死亡率。

若剛起水皰，水皰沒有破裂，只需用口蹄一針靈注射一次，水皰即可干癟消失。若口鼻、蹄子周圍的水皰已破潰、流血，甚至蹄殼已脫落，需用口蹄一針靈注射兩次，水皰破潰處可結痂。每瓶100kg體重配合核酸肽連續注射2d。

發生口蹄疫的重疫區：

（1）盡早注射，越早越好，病毒控制在潛發期，提高豬群免疫力。

（2）已感染豬群注射兩天，4～5d結痂脫落后完全恢復正常，可解除隔離。

（3）對感染后恢復的弱仔群體，每天加強消毒，5d后再注射一針，防止再次感染。

疫區凈化：若發生口蹄疫，則要全面、及時地對整個疫區進行消毒、封鎖、上報等工作，爭取把疫情損失降到最低。

（六）實驗室檢測

口蹄疫診斷技術

依據標準：GB/T 18935—2018。

1.定型酶聯免疫吸附試驗（定型ELISA）

（1）器材　酶標儀、與96孔標板配套使用的旋轉振蕩器、恒溫培養箱、洗板機或洗滌瓶、96孔平底聚苯乙烯酶標板、“U”形96孔稀釋板、微量可調移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、1000μl等不同規格）、與移液器匹配的吸頭、貯液槽、封板膜、吸水紙巾。

（2）試劑

1）捕獲抗體　各型兔抗FMDV146s抗血清，由提純的各型FMDV146s完整病毒粒子免疫兔子制備而成，用pH9.6的包被緩沖液將捕獲抗體稀釋至工作濃度。

2）檢測抗體　各型豚鼠抗FMDV146s抗原抗血清，用與制備捕獲抗體相同的FMDV146S免疫豚鼠制備而成；或者是辣根過氧化物酶（HRP）標記的各型抗FMDV型特異性單克隆抗體，用酶標抗體稀釋液稀釋至工作濃度。

3）對照抗原　FMDV滅活抗原。FMDV于單層BHK-21細胞上繁殖，病毒培養液經二乙烯亞胺滅活后離心除去細胞碎片，上清液作為對照抗原，使用時用樣品稀釋液稀釋至工作濃度。

4）包被緩沖液　碳酸鹽緩沖液，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。

5）樣品稀釋液　含0.05%（體積分數）吐溫-20的0.01mol/L PBS，pH7.2～7.4，配方見附錄B。

6）酶標抗體稀釋液　按5%（質量濃度）比例在樣品稀釋液中加入脫脂奶粉。

7）洗滌緩沖液　含0.01%（體積分數）吐溫-20的0.01mol/L PBS，配方見附錄A。

8）底物溶液　OPD底物溶液，配方見附錄A；TMD底物溶液，配方見附錄A。

9）終止液　1.25mol/L硫酸，配方見附錄A；2mol/L硫酸，配方見附錄A。

10）兔抗豚鼠IgG HRP標記物　用健康兔血清阻斷，用酶標抗體稀釋液釋至工作濃度。

（3）試驗程序

1）包被酶標板　將工作濃度的捕獲抗體分別包被 ELISA板第1至第12列（也可根據待檢樣品數量調整包被孔數），按O、A、Asia1型的順序包被酶標板，每個血清型包被1列，每孔加50μl，用封板膜封板，置于4℃過夜（或38℃±0.5℃，100～200r/min振蕩孵育2h）。

2）洗滌　每孔中加滿洗滌緩沖液，放置30s后棄去，重復洗滌6次后在吸水紙上拍干酶標板。

3）加對照抗原和待檢病原樣品　ELISA板第1列A、B兩孔加O型抗原，第2列A、B兩孔加A型抗原，第3列A、B兩孔加Asia1型抗原，依此類推，其余孔加被檢樣品，每份樣品每個血清型加2孔，每孔加50μl，每型設2孔陰性對照，陰性對照孔每孔加50μl樣品稀釋液。用封板膜封板，置于38℃±0.5℃旋轉振蕩器中振蕩60min。同2）洗滌。

4）加豚鼠抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP標記物或加各型抗 FMDV 型特異性單克隆抗體工作液。

將工作濃度的豚鼠抗 FMDV 各型抗血清逐個加入與包被兔抗 FMDV抗血清同型的各孔，即包被兔抗O型FMDV抗血清的孔加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔加豚鼠抗A型FMDV抗血清，依此類推，每孔加50μl，封板后同前振蕩孵育60min，同2）洗滌后加兔抗豚鼠IgG HRP標記物，每孔加50μl，封板后同前振蕩孵育45min，同2）洗滌?；蛘邔⒐ぷ鳚舛?HRP標記的各型抗FMDV型特異性單克隆抗體加入包被同型兔抗血清的各孔和陰性對照孔，每孔加50μl， 封板后同前振蕩孵育60min，同2）洗滌。

5）加底物溶液、終止液，判讀結果　加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP標記物時，洗滌板子后加入預熱至38℃±0.5℃的OPD底物溶液，每孔加50μl，封板，避光38℃±0.5℃振蕩孵育15min。每孔加50μl 1.25mol/L 終止液，混勻后在酶標儀492nm下判讀結果。加HRP標記的各型抗 FMDV型特異性單克隆抗體時，洗滌板子后加入預熱至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，每孔加50μl，封板，避光38℃±0.5℃振蕩孵育15min。每孔加50μl 2mol/L硫酸終止液，混勻后在酶標儀450nm下判讀結果。

（4）試驗成立條件

1）結果計算　相對OD值=被檢樣品各血清型平均OD值－同型陰性對照（N）平均OD值。

2）某型陰性對照（N）平均OD值大于0.20，試驗不成立。

3）陽性對照OD值應大于或等于0.6，陰性對照應小于或等于0.20，試驗成立。

（5）結果判定　在試驗成立的前提下，如果樣品各型的相對 OD值小于或等于0.20，則該樣品為陰性；如果樣品某型的相對OD值大于或等于0.3，則判定該樣品血清型陽性；如果樣品某型的相對OD值大于0.2但小于0.3，則判為可疑，需要重新測定，再次測定結果；若某型的相對OD值小于0.30，則該樣品為陰性；如果樣品某型的相對OD值大于或等于0.3，則判定該樣品該型口蹄疫抗原陽性。

2.多重反轉錄-聚合酶鏈式反應（多重 RT-PCR）

（1）器材

1）PCR擴增儀。

2）臺式低溫高速離心機。

3）穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽。

4）凝膠成像儀（或紫外透射儀）。

5）微量可調移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、1000μl等不同規格）。

6）無核酸酶水處理的離心管與吸頭。

7）PCR擴增管。

（2）引物

1）上游引物　下列3條引物為上游引物：

① 5’-GACTCG ACGTCTCCCGCCAACT-3’。

② 5’-ACGACGGGGGCTTTTGCTTTCAC-3’。

③ 5’-CGGGAA ACGCACGAGCAGTATC-3’。

2）下游引物　下列3條引物為下游引物：

① 5’-TGCGGACGGCCACCTACTACTTC-3’。

② 5’-AGCTCCACGAAAAAGTGTCGAG-3’。

③ 5’-CGTGATGTGGCGAGAATGAAGAA-3’。

（3）試劑

1）總 RNA提取試劑

① 變性液：6mol/L異硫氰酸胍或 Trizolreagent。

② 2mol/L乙酸鈉（pH4.0）。

③ 酚氯仿抽提液：苯酚-三氯甲烷-異戊醇（25∶24∶1）混合液。

④ 異丙醇（分析純）。

⑤ 無核酸酶水：可將焦碳酸二乙酯按0.1%（質量濃度）的量加入雙蒸餾水（ddH2O）中制備。

⑥ 75%乙醇：無水乙醇（分析純）與無核酸酶水按3∶1配制而成。

2）RT-PCR試劑

① 10×一步RNA PCR 緩沖液。

② 反轉錄酶（AMV），5U/μl。

③ 核糖核酸酶抑制劑（RNaseinhibitor），40U/μl。

④ AMV-Optimized Taq 酶，5U/μl。

⑤ dNTP預混液，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各10mmol/L。

⑥ MgCl2，25mmol/L。

3）電泳試劑

① 電泳緩沖液：50×TAE貯存液，臨用時加蒸餾水配成1×TAE 緩沖液。

② 瓊脂糖：國產或進口的低熔點瓊脂糖。

③ 電泳加樣緩沖液。

④ DNA Marker（標準分子量）：分子大小范圍100～1000bp，100bp梯度。

（4）樣品準備

1）本方法適用所有的 FMD病原樣品種類，包括水泡皮、水泡液、O-P液、扁桃體、淋巴結、骨髓、肌肉、病毒接種乳鼠與細胞培養物等。

2）陽性對照：已知病毒材料，如FMDV感染的乳鼠或細胞，與待檢樣品同時提取總RNA，再反轉錄和 PCR擴增，其擴增產物作為電泳對照樣品。

3）陰性對照：未感染的乳鼠或細胞，與待檢樣品同時提取總RNA，再反轉錄和 PCR擴增。

（5）試驗程序

1）核酸提取　酚氯仿法抽提核酸

① 取待檢樣品、陰性對照、陽性對照各300μl分別置于1.5ml離心管中，每管加入300μl 變性液，反復混勻，冰水浴5min。

② 每管分別加入60μl 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），混勻。

③ 每管加800μl苯酚-三氯甲烷-異戊醇（25∶24∶1）混合液，冰水浴5min。

④ 8000r/min離心10min。將上清液轉入另一潔凈離心管。

⑤ 加800μl異丙醇，混勻，室溫放置15min。

⑥ 4℃，12000r/min，離心10min，小心倒掉上清液。盡量倒干液體，留下 RNA 沉淀。

⑦ 加1000μl 75%乙醇，顛倒洗滌沉淀，4℃，10000r/min離心5min，小心倒干液體，室溫干燥5～10min。

⑧ 每管加10μl 無核酸酶水，用于溶解 RNA。總RNA 提取液可立即用于PCR 擴增，也可－70℃冰箱保存備用。

2）核酸提取等效方法　可采用等效RNA提取試劑和方法，如采用自動化核酸提取儀和配套核酸抽提試劑進行核酸提取。

3）核酸擴增

① PCR反應混合液配制：10×一步RNA PCR緩沖液50μl，MgCl2 100μl，dNTPs50μl，上下游引物對各30μl，無核酸酶水110μl，在超凈工作臺中混勻，分裝入 PCR 擴增管中，－20℃保存備用。

② 多重 RT-PCR 擴增：在已分裝有PCR 反應混合液的 PCR擴增管中分別加入已制備好的總RNA提取液5μl，蓋緊管蓋，放入擴增儀中按照設定程序擴增（50℃反轉錄30min，94℃預變性2min；然后94℃變性50s，58℃退火50s，72℃延伸60s，共進行35次循環；最后72℃延伸8min）。

4）擴增產物電泳檢測

① 1.5%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1.5g瓊脂糖，加入100ml 1×TAE 緩沖液中。加熱融化后加5μl（10mg/ml）溴化乙錠，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，加1×TAE 緩沖液淹沒膠面。

② 加樣：取6～8μl PCR擴增產物和2μl加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同時設標準DNA Marker、陰性對照、陽性對照。

③ 電泳：電壓80～100V 或電流40～50mA，電泳30～40min。

（6）試驗成立條件　電泳結束后，取出凝膠板置凝膠成像儀（或紫外透射儀）上觀察。陽性對照電泳結果應為三個條帶，分別為634bp、483bp和278bp，陰性對照應無擴增條帶。

（7）結果判定　符合（6）的條件，被檢樣品至少擴增出一條DNA條帶，且與陽性對照條帶分子量大小相符，則該樣品判定為FMDV核酸陽性。被檢樣品無擴增條帶，判為FMDV核酸陰性。

3.定型反轉錄-聚合酶鏈式反應（定型 RT-PCR）

（1）器材　同2、（1）。

（2）引物　下列為下游引物和分別檢測 FMDV7個血清型的上游引物。

① 下游引物（通用）：5’-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3’。

② 上游引物（O 型）：5’-GCTGCCYACYTCYTTCAA-3’。

③ 上游引物（A 型）：5’-GTCATTGACCTYATGCAVACYCAC-3’。

④ 上游引物（C型）：5’-GTTTCTGCACTTGACAACACA-3’。

⑤ 上游引物（Asia1型）：5’-GACACCACHCARRACCGCCG-3’。

⑥ 上游引物（SAT1型）：5’-AGGATTGCHAGYGAGACVCACAT-3’。

⑦ 上游引物（SAT2型）：5’-GGCGTYGARAAACARYTBTG-3’。

⑧上游引物（SAT3型）：5’-TTCGGDAGAYTGTTGTGTG-3’。

其中，Y、R、H、V、D為簡并堿基，Y對應C/T，R對應A/G，H對應A/T/C，V對應G/A/C，D對應A/T/G。

（3）試劑　同2、（3）。

（4）樣品準備　同2、（4）。

（5）試驗程序

1）核酸提取　同2、（5）、1）。

2）一步法RT-PCR擴增

① RT-PCR反應體系配制，采用25μl反應體系，擴增體系配制如下：

10×一步 RNAPCR緩沖液　　　　　　　       　2.5μl

MgCl2（25mmol/L）　　　　　　　　　　　　5μl

dNTP（各10mmol/L）　　　　　　　　　　　2.5μl

RNase酶抑制劑（40U/μl）　　　　　　　　　0.5μl

AMV（5U/μl） 　　　                                        　0.5μl

AMV-OptimizedTaq （5U/μl）　　　　　   　　0.5μl

下游通用引物（50pmol/μl）　　　　　　  　　0.5μl

上游特異性引物混合（各50pmol/μl） 　　　 　0.5μl

總RNA水溶液　　　                                      　　12.5μl

② 擴增程序。將 PCR擴增管蓋緊管蓋，放入擴增儀中按照設定程序擴增：50℃反轉錄30min，94℃預變性4min；然后94℃變性50s，58～60℃退火40s，72℃延伸40s，共進行30次循環；最后72℃延伸8min。

3）擴增產物電泳檢測　同2、（5）、3）。

（6）試驗成立條件　電泳結束后，取出凝膠板置于凝膠成像儀（或紫外透射儀）上觀察。陽性對照擴增產物電泳結果應分別為O型400bp，A型730bp，C型600bp，Asia1型300bp，SAT1型430bp，SAT2型260bp，SAT3型380bp，陰性對照應無擴增條帶。

（7）結果判定　符合（6）的條件。樣品擴增產物的DNA條帶與某型陽性對照條帶分子量大小一致，則該待檢樣品為某型FMDV。如被檢樣品無擴增條帶，則該樣品為 FMDV 核酸陰性。

4.液相阻斷酶聯免疫吸附試驗（LPB-ELISA）

（1）器材　同1、（1）。

（2）試劑　同1、（2）。

（3）對照血清

1）陽性對照血清：用與制備兔抗FMDV抗血清抗原同源的FMDV滅活疫苗免疫正常牛制備的高免血清，預先測定其抗體效價。同待檢血清一起作同樣稀釋。

2）陰性對照血清：陰性對照血清來自健康牛，各型口蹄疫 LB-ELISA 抗體效價均小于1∶4。

（4）試驗程序

1）ELISA板每孔用50μl pH9.6碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的兔抗血清包被，封板膜封板，置室溫過夜。

2）洗滌：每孔中加滿洗滌緩沖液，放置30s后棄去，重復洗滌6次后在吸水紙巾上拍干酶標板。

3）在U形96孔稀釋板內，按50μl/孔的量用樣品稀釋液將待檢血清從1∶4開始做2倍連續稀釋，每份待檢血清都做2個重復，然后向每孔內加入相應的50μl同型病毒抗原，封板混合后置4℃過夜或37℃孵育1h。加入病毒抗原后血清的實際稀釋度變為從1∶8開始的2倍連續稀釋度。

4）用洗滌緩沖液洗ELISA板6次，將各孔血清/抗原混合物從稀釋板轉移至兔抗血清包被的ELISA板中，每孔50μl，封板，37℃ 孵育1h。

5）洗ELISA板6次，將與試驗抗原同源的豚鼠抗血清用樣品稀釋液稀釋至預定的最佳工作濃度，每孔50μl，封板，37℃孵育1h。

6）洗ELISA板6次，每孔加50μl用酶標抗體稀釋液稀釋的兔抗豚鼠IgG辣根過氧化物酶結合物，封板，37℃孵育1h。

7）洗ELISA板6次，每孔加50μl TMB底物溶液。37℃溫育15min后每孔再加50μl 1.25mol/L硫酸終止反應，混勻后在酶標儀450nm下判讀結果。

8）對照設立：每次試驗，每塊板設8孔連續2倍稀釋的陽性血清對照，2孔連續2倍稀釋的陰性血清對照，設4孔抗原對照，抗原對照不加血清稀釋液。

（5）試驗成立條件　病毒抗原對照至少兩孔OD450nm值應在1.0～2.0范圍內；陽性血清對照抗體滴度應在（1∶512）～（1∶2048）之間；陰性血清對照抗體滴度應小于1∶4。

（6）結果判定

1）以病毒抗原對照OD450nm平均值的 1/2為臨界值，被檢血清稀釋孔OD450nm值大于臨界值為陰性孔，小于或等于臨界值為陽性孔。抗體滴度以50%終點滴度表示，即該稀釋度50%孔的抑制率大于抗原對照孔抑制率的50%。

2）被檢血清抗體滴度大于或等于1∶128判為陽性。被檢血清抗體滴度小于1∶64判為陰性。被檢血清抗體滴度大于或等于1∶64并小于1∶128判為可疑，可疑樣品經再次測定后，如果有一個滴度為1∶64或更高可判為陽性。

附錄A

（規范性附錄）

酶聯免疫吸附試驗用溶液的配制

A.1　包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液（0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6）

A液：Na2CO3 　　　　1.68g

蒸餾水 　　　             　400ml

B液：NaHCO3 　　　　2.86g

蒸餾水 　　　              　200ml

將400ml A液與150ml B液混合，調整pH至9.6，4℃放置1個月有效。

A.2　樣品稀釋液［含0.05%（體積分數）吐溫-20的0.01mol/L PBS，pH7.2～7.4］。

Na2HPO4·12H2O 　　 　0.30g

KH2PO4　　　　　　 　0.02g

NaCl　　　　　　      　0.80g

KCl　　　　　　    　　0.02g

吐溫-20　　　         　　0.05ml

加蒸餾水至100ml。

A.3　定型 ELISA、液相阻斷 ELISA、固相競爭ELISA 洗滌緩沖液（0.002mol/L PBS，pH7.4±0.2）

Na2HPO4·H2O　　  　　0.60g

KH2PO4 　　　　   　　0.04g

NaCl　　　　　     　　1.60g

KCl　　　　　　       　0.04g

加蒸餾水至1000ml。

A.4　底物溶液

A.4.1　OPD底物溶液

Na2HPO4·12H2O 　　　　            　1.84g

檸檬酸（C6H8O7，分析純） 　　　0.52g

鄰苯二胺（OPD）　　　　　　　0.05g

加去離子水100ml。

分裝成3ml/瓶，－20℃ 避光保存。使用前避光融化，每3 ml上述溶液加15μl 3% 雙氧水（H2O2）。

A.4.2　TMD底物溶液

A 液：TMB（3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine）　　　 200mg

無水乙醇　　　                                                                    　100ml

蒸餾水加至 1000ml。

B液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4，分析純） 　             　　　71.7g

檸檬酸（C6H8O7，分析純） 　　                                    　　9.33g

0.75%過氧化氫尿素　　　                                              　　6.4ml

加蒸餾水至1000ml，調整pH至5.0～5.4。

將底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，現配現用。

A.5　終止液

A.5.1　1.25mol/L硫酸

取68ml分析純濃硫酸緩慢加入932ml去離子水中，分裝室溫保存。

A.5.2　2mol/L硫酸

116ml分析純濃硫酸緩慢加入884ml去離子水中，分裝室溫保存。

A.5.3　0.3mol/L硫酸

16.6ml分析純濃硫酸緩慢加入983.4ml去離子水中，分裝室溫保存。