八、豬偽狂犬病

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PrV）引起的豬的急性傳染病。該病在豬呈暴發性流行，可引起妊娠母豬流產、死胎，公豬不育，新生仔豬大量死亡，育肥豬呼吸困難、生長停滯等，是危害全球養豬業的重大傳染病之一。

（一）病毒特征

偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、豬皰疹病毒屬，病毒粒子為圓形，直徑150～180nm，核衣殼直徑為105～110nm。病毒粒子的最外層是病毒囊膜，它是由宿主細胞衍生而來的脂質雙層結構。囊膜表面有長約8～10nm呈放射狀排列的纖突。

偽狂犬病毒是皰疹病毒科中抵抗力較強的一種。在37℃下的半衰期為7h，8℃可存活46d，而在25℃干草、樹枝、食物上可存活10～30d，但短期保存病毒時，4℃較－15℃和－20℃凍結保存更好。病毒在pH4～9之間保持穩定。5%石炭酸經2min滅活，但0.5%石炭酸處理32d后仍具有感染性。0.5%～1%氫氧化鈉迅速使其滅活。對乙醚、氯仿等脂溶劑以及福爾馬林和紫外線照射敏感。

偽狂犬病毒只有一個血清型，但不同毒株在毒力和生物學特征等方面存在差異。偽狂犬病毒具有泛嗜性，能在多種組織培養細胞內增殖，其中以兔腎和豬腎細胞（包括原I代細胞和傳代細胞系）最為敏感，并引起明顯的細胞病變，細胞腫脹變圓，開始呈散在的灶狀，隨后逐漸擴展，直至全部細胞圓縮脫落，同時有大量多核巨細胞形成。細胞病變出現快，當病毒接種量大時，在18～24h后即能看到典型的細胞病變。

實驗動物也可用于病毒的分離。兔、1日齡小鼠對偽狂犬病毒的敏感性無顯著差異，但成年鼠與新生鼠相比有較強的抵抗力。雖然雞胚對偽狂犬病毒不很敏感，但雞胚絨毛尿囊膜接種是最早用于病毒增殖和傳代的方法。

偽狂犬病毒基因組是線狀雙鏈DNA分子，大小約150kb，（G+C）平均含量高達74%，具有典型的皰疹病毒基因組結構特征，由獨特長區段、獨特短區段及位于US兩側的末端重復序列（TR）和內部重復序列（IR）組成。

（二）臨床癥狀

偽狂犬病毒的臨診表現主要取決于感染病毒的毒力和感染量，以及感染豬的年齡。其中，感染豬的年齡是最主要的。與其他動物的皰疹病毒一樣，幼齡豬感染偽狂犬病毒后病情最重。

新生仔豬感染偽狂犬病毒會引起大量死亡，臨診上新生仔豬第1天表現正常，從第2天開始發病，3～5d內是死亡高峰期，有的整窩死光。同時，發病仔豬表現出明顯的神經癥狀、昏睡、鳴叫、嘔吐、腹瀉，一旦發病，1～2d內死亡。剖檢主要是腎臟布滿針尖樣出血點，有時見到肺水腫，腦膜表面充血、出血。15日齡以內的仔豬感染本病者，病情極嚴重，發病死亡率可達100%。仔豬突然發病，體溫上升達41℃以上，精神極度委頓，發抖，運動不協調，痙攣，嘔吐，腹瀉，極少康復。斷奶仔豬感染偽狂犬病毒，發病率在20%～40%，死亡率在10%～20%，主要表現為神經癥狀、腹瀉、嘔吐等。成年豬一般為隱性感染，若有癥狀也很輕微，易于恢復，主要表現為發熱、精神沉郁，有些病豬嘔吐、咳嗽，一般于4～8d內完全恢復。懷孕母豬可發生流產、產木乃伊胎或死胎，其中以死胎為主。無論是頭胎母豬還是經產母豬都發病，而且沒有嚴格的季節性，但以寒冷季節即冬末春初多發。

20日齡以上的仔豬到斷奶后小豬癥狀輕微，體溫升高到41℃以上，呼吸短促，被毛凌亂，不食或食欲減少，耳尖發紫，發病率和死亡率都低于15日齡以內的仔豬。

4月齡左右的豬，發病后只有輕微癥狀，有數日的輕熱、呼吸困難、流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲不振，有的呈“犬坐”姿勢（圖1-52），有時嘔吐和腹瀉。

母豬有時出現厭食、便秘、震顫、驚厥、視覺消失或結膜炎，有的分娩延遲或提前，有的產下死胎、木乃伊胎或流產，產下的仔豬初生體小、衰弱，弱胎2～3d后死亡，流產發生率約為50%。

診斷中應注意本病不易與豬瘟、藍耳病、細小病毒病、乙腦等病區別，確診必須進行實驗室檢驗。

偽狂犬病的另一發病特點是表現為種豬不育。近幾年發現有的豬場春季暴發偽狂犬病，出現死胎或斷奶仔豬患偽狂犬病后，緊接著下半年母豬配不上種，返情率高達90%，有反復配種數次都配不上的。此外，公豬感染偽狂犬病毒后，表現出睪丸腫脹、萎縮，喪失種用能力。

（三）病理變化

狂犬病毒感染一般無特征性病變。眼觀主要見腎臟有針尖狀出血點，其他肉眼病變不明顯。可見不同程度的卡他性胃炎和腸炎，中樞神經系統癥狀明顯時，腦膜明顯充血，腦脊髓液量過多（圖1-53），肝、脾等實質臟器常可見灰白色壞死病灶，肺充血、水腫和有壞死點。子宮內感染后可發展為溶解壞死性胎盤炎。

組織學病變主要是中樞神經系統的彌散性非化膿性腦膜腦炎及神經節炎，有明顯的血管套及彌散性局部膠質細胞壞死。在腦神經細胞內、鼻咽黏膜、脾及淋巴結的淋巴細胞內可見核內嗜酸性包涵體和出血性炎癥。有時可見肝臟小葉周邊出現凝固性壞死。肺泡隔核小葉質增寬，淋巴細胞、單核細胞浸潤（圖1-54）。

（四）流行病學特征

偽狂犬病毒在全世界廣泛分布。偽狂犬病自然發生于豬、牛、綿羊、犬和貓，另外，多種野生動物、肉食動物也易感。水貂、雪貂因飼喂含偽狂犬病毒的豬下腳料也可引起偽狂犬病的暴發。實驗動物中家兔最為敏感，小鼠、大鼠、豚鼠等也能感染。關于人感染偽狂犬病毒的報道很少，并且都不是以病毒分離為報道依據。如土耳其及我國臺灣曾報道有血清學反應陽性者。歐洲也曾報告數例因皮膚傷口接觸病料組織而感染，主要表現為局部有發癢，未曾報告有死亡病例。最新的報道見于1992年，在波蘭因直接接觸偽狂犬病毒而感染的工人，首先是手部先出現短暫的瘙癢，后擴展至背部和肩部。

豬是偽狂犬病毒的貯存宿主，病豬、帶毒豬以及帶毒鼠類為本病重要傳染源。不少學者認為，其他動物感染本病與接觸豬、鼠有關。

在豬場，偽狂犬病毒主要通過已感染豬排毒而傳給健康豬，另外，被偽狂犬病毒污染的工作人員和器具在傳播中起著重要的作用。而空氣傳播則是偽狂犬病毒擴散的最主要途徑，但到底能傳播多遠還不清楚。人們還發現在鄰近有偽狂犬病發生的豬場周圍放牧的牛群也能發病，在這種情況下，空氣傳播是唯一可能的途徑。在豬群中，病毒主要通過鼻分泌物傳播，另外，通過乳汁和精液傳播也是可能的傳播方式。

除豬以外的其他動物感染偽狂犬病毒后，其結果都是死亡。豬發生偽狂犬病后，其臨診癥狀因日齡而異，成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊胎和種豬不育等。15日齡以內的仔豬發病死亡率可達100%，斷奶仔豬發病率可達40%，死亡率20%左右；對成年肥豬可引起生長停滯、增重緩慢等。

偽狂犬病的發生具有一定的季節性，多發生在寒冷的季節，但其他季節也有發生。

（五）預防及治療

本病無特效治療藥物，對感染發病豬可注射豬偽狂犬病高免血清，它對斷奶仔豬有明顯效果，同時應用黃芪多糖中藥制劑配合治療。對未發病受威脅豬進行緊急免疫接種。本病主要以預防為主，對新引進的豬要進行嚴格的檢疫，引進后要隔離觀察、抽血檢驗，對檢出陽性豬要注射疫苗，不可做種用。種豬要定期進行滅活苗免疫，育肥豬或斷奶豬也應在2～4月齡時用活苗或滅活苗免疫，如果只免疫種豬，育肥豬感染病毒后可向外排毒，直接威脅種豬群。另外感染豬增重遲緩，飼料報酬降低，推遲出欄，間接損失也是巨大的。

豬場要進行定期嚴格的消毒，最好使用2%的氫氧化鈉（燒堿）溶液或酚類消毒劑。

在豬場內要進行嚴格的滅鼠，消滅鼠類帶毒傳播疾病的危險。

豬偽狂犬病和豬細小病毒病、豬藍耳病、豬乙型腦炎為導致豬繁殖障礙的四大疾病。

防疫措施有偽狂犬基因缺失苗滴鼻給出生小豬。

也可用基因缺失滅活苗進行注射，具體方法如下：后備種豬基礎免疫后，于配種前一個月肌內注射1頭份。

妊娠母豬——產前4周肌內注射1頭份。

生產公豬——每6個月肌內注射1頭份。

若采取全群“一刀切”的免疫方法，每年至少3～4次（每3～4個月1次）。妊娠母豬在產前4周加強免疫1次。

仔豬——5～6周齡時（此時母源抗體較低）肌內注射1頭份（若1日齡滴鼻時劑量減半）。感染壓力大的豬場應于11～12周齡加強免疫1次。

（六）實驗室檢測

豬偽狂犬病毒熒光PCR檢測

依據標準：GB/T 35911—2018。

1.儀器設備

熒光PCR檢測儀、高速臺式離心機、組織研磨器或研缽、普通冰箱2～8℃、普通冰柜－20℃以下、超低溫冰箱－70℃以下、微量移液器、高壓滅菌器。

2.耗材

1.5ml離心管、0.2ml PCR薄壁管或八連管

3.試劑

（1）除非另有說明，在檢測中使用的試劑均為分析純。

（2）DNAzol，商品化DNA抽提試劑，于2～8℃保存。

（3）無水乙醇，－20℃預冷。

（4）75%乙醇，由無水乙醇和雙蒸水配制，－20℃預冷。

（5）8mmol/L NaOH溶液，配制見附錄A。

（6）PBS緩沖液，配制見附錄A。

（7）Taq酶及10倍Taq酶反應緩沖液：Taq酶濃度為5U/μl，Taq酶反應緩沖液Mg+濃度為15mmol/L。

（8）dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，－20℃保存，避免反復凍融。

（9）引物和TaqMan探針，其序列見附錄B。

（10）偽狂犬病毒陽性對照樣品和陰性對照樣品：陽性品對照使用滅活疫苗或組織培養滅活毒，陰性品對照采用健康豬的組織。

（11）內參照質粒：帶有人β-株蛋白基因的質粒。

4.樣品采集和處理

（1）采樣工具

1）手術刀、剪刀、鑷子，經160℃干熱滅菌2h。

2）一次性無菌采樣拭子。

3）組織研磨器或者研缽，經160℃干熱滅菌2h。

4）真空采血管。

（2）樣品采集

1）血液樣品采集：用無菌注射器采集血液，注入含1/10 4% EDTA溶液的無菌容器中，充分混勻，編號備用。

2）精液樣品采集：按照GB/T 25172的方法采集和保存精液。

3）鼻拭子采集：用棉拭子取受檢動物鼻腔分泌物，置于2ml PBS緩沖液中備用。

4）組織樣品采集：取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、三叉神經節、扁桃體、肺臟、淋巴結等組織，置于無菌離心管內，編號備用。

5）細胞培養物：細胞培養物反復凍融3次，第3次解凍后，將細胞培養物置于1.5ml無DNA酶的滅菌離心管內，編號備用。

（3）樣品保存和運輸　上述采集的樣品可立即用于檢測。不能立即檢測的樣品，在2～8℃下保存應不超過24h，（－20±5）℃下應不超過3個月，－70℃以下可長期保存。樣品運送采用低溫保存進行運輸，并在規定溫度下的保存期內送達。

（4）樣品處理

1）血液和精液樣品無需進行前處理，直接用于核酸提取。

2）鼻拭子樣品：充分渦旋振蕩含有鼻拭子的管1～3min，棄去拭子后2000r/min離心5min，取上清后用于后續的核酸提取。

3）組織樣品：取1g解凍的組織，剪碎，加入2ml PBS緩沖液進行研磨，制備組織勻漿，8000r/min離心5min，取上清用于后續的核酸提取。

4）細胞培養物：4000r/min、4℃離心10min，取上清用于后續的核酸提取。

5.熒光PCR操作程序

（1）DNA抽提

1）在核酸提取區操作，DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化試劑盒提取。

2）取n個滅菌的1.5ml離心管，其中n為待檢樣品數+陽性對照+陰性對照，對每個離心管進行編號。

3）每管先加入800μl DNAzol，再分別加入被檢樣品、陽性對照、陰性對照各200μl，顛倒10次混勻，4℃或室溫10000r/min離心10min。

4）取900μl上清，置新的1.5ml滅菌離心管中，加入500μl無水乙醇，混勻，室溫放置3min，4℃或室溫10000r/min離心5min。

5）棄上清，沿管壁緩緩加入0.8～1ml 5%乙醇，顛倒3～6次混勻，4℃10000/min離心5min，反復洗滌次后，將離心管倒扣于吸水紙上自然晾干或用移液器移去殘液。

6）用30μl 8mmol/L NaOH溶液溶解沉淀，DNA在2～8℃冰箱可保存2個月，－20℃冰柜可穩定保存兩年。

（2）熒光PCR檢測

1）反應體系的配制　在試劑配制區進行。設實時熒光PCR反應管數為n，n為待檢樣品數+陽性管數+陰性管數，每個反應的體系見附錄C，為了避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應進行配制。配制反應液在冰盒中進行。

2）反應液的分裝　將1）中配制的熒光PCR反應液充分混勻按每管39.8μl分裝于0.2ml透明PCR管內，將PCR管置于96孔板上，按順序加樣并做好標識，轉移至核酸提取區。

3）加樣　在核酸提取區進行。在每個PCR反應管內加入0.2μl內參照質粒，并分別加入（1）中制備的10μl DNA溶液，蓋上蓋子、500～1000 r/min離心30s轉移至檢測區。

4）上機檢測

① 熒光通道設置。將（2）、3）中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內，設置熒光探針：5’選擇FAM、HEX和ROX三個熒光通道，3’均選擇無（Nonc）熒光。

② 循環條件設置與檢測

第一階段，預變性50℃/2min；

第二階段，預變性95℃/2min；

第三階段，變性95℃/15s退火、延伸、熒光采集60℃/30s，40個循環；

第四階段，冷卻，25℃/10s。

檢測結束后，保存結果，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。

6.結果判定

（1）閾值設定　閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增的最高點為準。

（2）質量控制

1）PRV陰性對照：FAM通道無報告Ct值或無典型的S形擴增曲線，HEX通道無報告Ct值或無典型的S形擴增曲線，ROX通道Ct值≤36，且擴增曲線為典型的S形。

2）PRV陽性對照：FAM通道Ct值≤30，HEX通道Ct值≤30，ROX通道Ct值≤36，且3個通道的擴增曲線均為典型的S形。

3）以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

（3）結果描述及判定

1）被檢樣本檢測結果中FAM通道Ct值≤38、HEX通道Ct值≤38，且擴增曲線均為典型的S形曲線，報告為PRV核酸陽性；38<Ct值≤40，判定為可疑，可疑樣品須重復檢測。如重復后仍然38<Ct值≤40，且擴增曲線均為典型的S形曲線，報告為PRV核酸陽性。

2）被檢樣本檢測結果中FAM通道Ct值≤40，且擴增曲線為典型的S形擴增曲線，HEX通道無Ct值或者無典型的S形擴增曲線，報告為PRVgE缺失株核酸陽性。

3）被檢樣本檢測結果中FAM通道和HEX通道均無Ct值或無典型的S形擴增曲線，同時ROX通道Ct值≤36且擴增曲線為典型的S形曲線，則該樣本超過本方法檢測靈敏度范圍，報告為PRV核酸陰性。

4）被檢樣本檢測結果中FAM通道和HEX通道均無Ct值或無典型的S形擴增曲線，同時ROX通道Ct值>36，則該樣本的檢測結果無效，應查找并排除原因，并對此樣本進行重復實驗。

附錄A

（規范性附錄）

溶液配制

A.1　8mmol/L NaOH溶液

稱量0.32g NaOH，溶解到1000ml去離子水中，混勻、分裝，常溫保存。

A.2　磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L PBS，pH7.4）

用800ml蒸餾水溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。用HCl調節溶液的pH至7.4，加水至1L。分裝后經121℃、15min高壓滅菌后備用。

附錄B

（規范性附錄）

引物和探針

引物、探針的名稱和序列見表1-14。

附錄C

（規范性附錄）

熒光PCR反應體系

熒光PCR反應體系見表1-15。