九、豬細小病毒病

豬細小病毒病是由豬細小病毒引起的豬的一種繁殖障礙性傳染病。其特征是受感染母豬，特別是初產母豬產死胎、畸形胎、木乃伊胎，偶有流產；公豬繁殖力低下，新生畜全身性疾病。

該病最早是在1967年發現于英國，目前世界各個國家幾乎均有流行報道，其所致的繁殖障礙是世界養豬業面臨的問題，一旦侵入豬群，發病率非常高。我國自20世紀80年代從各地相繼分離到豬細小病毒后，經血清學調查豬群中該病的陽性率達85%以上，給各地養豬業造成了相當大的損失。

（一）病毒特征

豬細小病毒（Porcine nanovirus，PPV）屬于細小病毒科（Parvoviridae）細小病毒亞科（Parovirus）。病毒粒子呈圓形或六角形，20面體立體對稱，核酸為單股DNA，無囊膜，直徑18～26nm，有32個殼粒，殼粒直徑為14～17nm，對氯仿、乙醚及熱（56℃30min）和酸（pH3，60min）均穩定。

培養病毒常用豬源性細胞，包括原代細胞（如豬腎、豬睪丸等）和傳代細胞（如PK-15、IBRS-2、ST細胞等），在細胞長至一半時或在制備細胞懸液時接種病毒（同步接種），病毒可在細胞中產生核內包涵體，于接種后2～5d，適應了細胞培養的病毒可使受感染細胞變圓、固縮和裂解等，即產生細胞病變（CPE），而初次分離時可能無細胞病變或病變不典型，需要連續幾代后才能觀察到，但無論是初次分離或進行適應性毒株傳代，都可用免疫熒光技術檢測胞漿中的病毒抗原。此外，應注意的問題是原代細胞和傳代細胞以及培養這些細胞所用的牛血清都有被該病毒污染的可能性，在進行細胞培養物接毒之前應對其進行檢測。

PPV毒力有強弱之分，但至今只有一個血清型，PPV具有血凝活性，能凝集人、猴、豚鼠、貓及小鼠等多種動物的紅細胞。但溫度、pH、紅細胞種類以及供血動物的遺傳特性和年齡等對血凝反應都有一定影響。一般認為pH接近中性，使用豚鼠紅細胞時可獲得較好的結果。

本病毒在淋巴結、扁桃體、胸腺、脾、肺、唾液腺等器官復制，外周血淋巴細胞（如T細胞、B細胞及N細胞）中也能很好地復制，并刺激這些細胞增殖，單核細胞及巨噬細胞吞噬病毒后被感染并被破壞。與其他細小病毒相比，豬細小病毒更易引致慢性排毒的持續性感染。

PPV對環境的抵抗力極強，能耐受56℃48h、70℃2h處理仍不被殺滅，在80℃經5min才能使其滅活。急性感染豬分泌物和排泄物的病毒可在污染圈舍中存活9個月之久。在pH9的甘油緩沖鹽水中或在－20℃以下保存1年以上毒力不會下降。該病毒耐酸范圍大，pH3～9時，經90min仍穩定；pH2時，90min才能將其滅活。短時間胰酶處理對病毒懸液感染性不僅沒有影響，反而能提高其感染效價。0.5%漂白粉液、2%氫氧化鈉液、0.3%次氯酸鈉5min可殺死病毒。

（二）臨床癥狀

仔豬和母豬感染本病后，通常都呈亞臨診癥狀，但在體內許多器官和組織中都能發現該病毒。PPV感染主要的（通常也是唯一的）臨診表現為母豬的繁殖障礙，但取決于發生病毒感染母豬的妊娠時期。如果感染發生在懷孕早期，可造成胚胎死亡，母豬可能再度發情，也可能既不發情也不產仔，也可能每胎只產出幾個仔豬或產的胎兒大部分都已木乃伊化；如果感染發生在懷孕中期或后期，胚胎死亡后胎水被母體重吸收，母豬腹圍逐漸縮小，最后可出現木乃伊胎、死胎或流產等（圖1-55）。妊娠30～50d感染主要產木乃伊胎，妊娠50～60d感染主要產死胎，至于木乃伊化程度，則與胎兒感染死亡日齡有關。如早期死亡，則產生小的、黑色的、枯僵樣木乃伊；如晚期死亡，則產生大的木乃伊胎；死亡愈晚，木乃伊化的程度愈低。懷孕70d后感染，母豬多能正常生產，但產出的仔豬帶毒，有的甚至終身帶毒而成為重要的傳染源。細小病毒感染引起繁殖障礙的其他表現還有母豬發情不正常、返情率明顯升高、新生仔豬死亡、產出弱仔、妊娠期和產仔間隔延長等現象。病毒感染對公豬的受精率或性欲沒有明顯的影響。此外，本病還可引起母豬發情不正常，久配不育。

（三）病理變化

懷孕母豬感染后，缺乏特異性的眼觀病變，僅見母豬輕度子宮內膜炎，胎盤部分鈣化，胎兒在子宮內有被溶解吸收的現象。受感染的胎兒可見不同程度的發育障礙和生長不良，胎兒充血、水腫、出血、胸腹腔有淡紅色或淡黃色滲出液、脫水（木乃伊胎）及壞死等病變。

組織學病變為母豬的妊娠黃體萎縮，子宮上皮組織和固有層有局灶性或彌散性單核細胞浸潤。死亡胎兒多種組織和器官有廣泛的細胞壞死、炎癥和核內包函體。其特征性組織病變是大腦灰質、白質和軟腦膜出現非化膿性腦膜腦炎的變化，內部有以外膜細胞、組織細胞和漿細胞形成的血管套。

（四）流行病學特征

易感動物：豬是唯一的易感動物。不同年齡、品種、性別的家豬和野豬均可感染。據報道，在牛、羊、貓、小鼠和大鼠的血清中也存在特異性抗體，來自病豬場的鼠類，其抗體陽性率高于陰性豬場的鼠類。

傳染源：感染的公豬、母豬和持續性感染的外表健康豬、感染或死亡的胎兒、木乃伊胎，或產出的仔豬都帶毒，是本病的主要傳染源。污染的豬舍是病毒的貯存場所。感染豬排毒可達數月，病毒可通過多種途徑排出體外。感染母豬由陰道分泌物、糞、尿及其他分泌物排毒，公豬通過精液長時間排毒。在子宮內感染的仔豬可能存活作為免疫耐受的帶毒者。

傳播途徑：主要通過直接接觸或接觸被污染的飼料、飲水、用具、環境等經消化道傳染，也可經配種傳播，妊娠母豬可通過胎盤傳給胎兒。豬在出生前后最常見的感染途徑分別是胎盤和口鼻，通過呼吸道感染也是非常重要的途徑。

流行因素和形式：本病呈地方流行性或散發，多發生于產仔旺季，以頭胎妊娠母豬發生流產和產死胎的較多。PPV在世界各地的豬群中廣泛存在，幾乎沒有母豬免于感染，PPV一旦傳入豬場則連續幾年不斷地出現母豬繁殖障礙。因此，大部分小母豬懷孕前已受到自然感染，而產生了主動免疫，甚至可能終生免疫。血清學陰性的懷孕母豬群一旦感染病毒，損失慘重。

（五）預防及治療

本病目前尚無有效的治療方法，應在免疫預防的基礎上，采取綜合性防控措施。

免疫預防：由于PPV血清型單一及其高免疫原性，因此，疫苗接種已成為控制PPV感染的一種行之有效的方法。目前常用的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗。初產母豬配種前2～3周肌內接種1頭份，種公豬于8月首次免疫注射，以后每年注射1次，每次肌內注射1頭份，但應注意免疫母豬哺乳的仔豬從初乳中可獲得高滴度的母源抗體，經過3～6個月才能降低到血凝抑制試驗檢測不出的程度，這種被動性抗體可以干擾豬群主動免疫力的產生，因此免疫接種1個月后最好進行血清學檢測，以評價免疫的效果。

綜合防控：嚴防傳入，堅持自繁自養的原則，如果必須引進種豬，應從未發生過本病的豬場引進。引進種豬后應隔離飼養半個月，經過兩次血清學檢查，HI效價在1∶256以下或為陰性時，才合群飼養。

加強種公豬檢疫，種公豬血清學檢查陰性，方可作為種用。

在本病流行地區，將母豬配種時間推遲到9月齡后，因為此時大多數母豬已建立起主動免疫，若早于9月齡時配種，需進行HI檢查，只有具有高滴度的抗體時才能進行配種。

疫情處理：群發病后應首先隔離發病動物，劃定疫區，制定撲滅措施。對其排泄物、分泌物和圈含、環境、用具等進行徹底消毒，撲殺發病母豬、仔豬，尸體無害化處理。發病豬群，其流產胎兒中的幸存者或木乃伊同窩的幸存者，不能留作種用。由于豬細小病毒對外界物理和化學因素的抵抗力較強，消毒時可選用福爾馬林、氨水和氧化劑類消毒劑等。

（六）實驗室檢測

豬細小病毒間接ELISA抗體檢測

依據標準：NY/T 2840—2015。

1.試劑

（1）豬細小病毒VP2重組蛋白（re-VP2）　克隆豬細小病毒結構蛋白VP2抗原優勢區基因，用pET-32a表達載體進行原核表達，親和層析法純化重組蛋白。獲得的重組蛋白濃度應≥1mg/ml，純度應95%，具體過程見附錄A。

（2）陽性血清對照　選取5月齡健康豬2頭，用豬細小病毒疫苗按規定劑量進行免疫，間隔3周免疫2次，第二次免疫1個月后開始采血分離血清，用血凝抑制試驗測定其抗體效價，當抗體的血凝抑制效價達到1∶1024時采血分離血清，將血凝抑制效價為1∶1024的陽性血清用樣品稀釋液（參見附錄B）進行1∶50稀釋，即為陽性血清對照。

（3）陰性血清對照　采集無母源抗體、未免疫豬細小病毒疫苗的健康豬血清，經血凝抑制試驗檢測，結果為豬細小病毒抗體陰性，用樣品稀釋液（參見附錄B）進行1∶50稀釋，即為陰性血清對照。

（4）包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、標抗體稀釋液、底物顯色液、終止液配制方法見附錄B。

（5）器材和設備　一次性注射器、恒溫培養箱、振蕩混勻儀、移液器（200μl、1000μl）、多道移液器（200μl）、酶標板、酶聯免疫檢測儀等。

2.血清樣品的處理

（1）血清樣品的采集和處理　靜脈采血，每頭豬不少于2ml。血液凝固后分離血清，4000r/min離心10min，用移液器吸出上層血清。

（2）血清樣品的儲存和運輸　血清樣品置－20℃以下冷凍保存。運輸時確保低溫運送，并及時送達，以防血清樣品腐敗。按照中華人民共和國農業部〔2003〕第302號公告的規定進行樣品的生物安全標識。

3.間接ELSA抗體檢測操作方法

（1）包被抗原　以純化的豬細小病毒VP2重組蛋白（re-VP2）作為包被用抗原，將重組蛋白re-VP2用包被液稀釋至3μg/ml，每孔加入100μl（每孔抗原包被量為300ng），37℃包被2h，用洗滌液洗板3次，每次5min。

（2）封閉　每孔加入200μl封閉液，37℃封閉2h，洗板同（1）。

（3）加待檢血清及陽性血清對照、陰性血清對照　將待檢血清用樣品稀釋液進行1∶50稀釋，每孔加入100μl，每板同時設置兩孔陽性血清對照、兩孔陰性血清對照。當待檢血清樣品較多時，可根據試驗進度，提前進行樣品稀釋，再一并加樣，以確保所有待檢樣品的反應時間準確、一致。37℃作用1h，洗板同（1）。

（4）加酶標抗體　將兔抗豬酶標抗體用酶標抗體稀釋液稀釋至工作濃度，每孔加入100μl，37℃作用1h，洗板同（1）。

（5）加底物顯色液　每孔加入100μl底物顯色液，37℃避光顯色作用10min。

（6）加終止液　每孔加入100μl終止液終止反應，10min內測定OD450值。

（7）結果判定　在酶聯免疫檢測儀上讀取OD450值，計算陽性血清對照OD450平均值ODP、陰性血清對照OD450平均值ODN。陽性血清對照OD450平均值ODP≥0.5，陰性血對照OD450平均值ODN≤0.2時，試驗成立。待檢血清樣品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判為陽性，反之判為陰性。

4.注意事項

（1）相關試劑需在2～8℃保存，使用前平衡至室溫。

（2）操作時，注意取樣或稀釋準確，并注意更換吸頭。

（3）底物溶液避光保存，避免與氧化劑接觸。

（4）終止液有腐蝕作用，使用時避免直接接觸。

（5）廢棄物處理參照中華人民共和國農業部〔2003〕第302號公告的規定進行。

附錄A

（規范性附錄）

豬細小病賽VP2蛋白的表達及純化

A.1　材料和試劑

豬細小病毒NADL-2株；大腸桿菌DH5a和BL21（DE3）感受態細胞、pMD18-T克隆載體ET-32a表達載體、核酸提取試劑盒、質粒提取試劑盒、限制性內切酶、蛋白純化試劑盒、培養基均為商品化試劑。

A.2　器材和設備

恒溫培養箱、高速離心機、PCR擴增儀、核酸電泳儀和水平電泳槽、凝膠成像系統（或紫外透射儀）、恒溫空氣浴搖床、移液器（10μl、200μl、1000μl）、分光光度計等。

A.3　引物序列

VP2——P1：5’-AACAGGATCCCACAGTGACATTATG-3’

VP2——P2：5’-AGAAAGCTTATGCTTTGGAGCTCTTC-3’

A.4　豬細小病毒結構蛋白VP2抗原優勢區基因序列

本標準表達的豬細小病毒結構蛋白VP2抗原優勢區基因序列如下：

CACAGTGACATTATGTTCTACACAATAGAAAATGCAGTACCAATTCATCTTCTA

AGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGGAATATATCACTTTGACACAAAACCACTA

AAATTAACTCACTCATGGCAAACAAACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAAAACTA

CTAACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAACACCCAGGAACACTACCAGCAGCT

AACACAAGAAAAGGTTATCACCAAACAATTAATAATAGCTACACAGAAGCAAC

AGCAATTAGGCCAGCTCAGGTAGGATATAATACACCATACATGAATTTTGAAT

ACTCCAATGGTGGACCATTTCTAACTCCTATAGTACCAACAGCAGACACACAAT

ATAATGATGATGAACCAAATGGTGCTATAAGATTTACAATGGATTACCAACAT

GGACACTTAACCACATCTTCACAAGAGCTAGAAAGATACACATTCAATCCACAAA

GTAAATGTGGAAGAGCTCCAAAGCAT

A.5　方法

A.5.1　VP2抗原優勢區基因的表達質粒構建

將PPV接種PK15細胞，在5%CO2的條件下37℃培養24～36h，當70%的細胞出現細胞病變時，收集培養物，反復凍融3次。用核酸提取試劑盒提取病毒DNA，然后用VP2-P1和VP2-P2引物擴增VP2基因，瓊脂糖凝膠電泳并純化回收相應的擴增片段，片段大小為510bp。純化產物連接pMD18-T克隆載體，轉化DH5a感受態細胞，篩選獲得的重組陽性質粒命名為pMD18-T-VP2。用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pMD8-T-VP2和pET-32，將VP2基因片段連接到pET-32表達載體，轉化DH5a感受態細胞，篩選獲得的重組陽性質粒命名為pET-32a-VP2。

A.5.2　VP2抗原優勢區基因的表達與純化

將pET-32a-VP2轉化BL21（DE3）感受態細胞，篩選獲得含重組質粒的陽性菌株。取重組BL21（DE）菌種5μl，接種至5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基（蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母提取物0.5%）。37℃振搖培養至OD600值為0.4～0.6時，加入終濃度為1mmol/L的異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導，繼續37℃振搖培養4h。按照蛋白純化試劑盒說明書純化目的蛋白（即VP2重組蛋白），目的蛋白大小約39.1kDa。

A.5.3　重組蛋白的純度及濃度測定

取5μl重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，用蛋白密度掃描分析純度，重組蛋白的純度應≥95%；用紫外分光光度計測定重組蛋白在280nm和260nm波長的OD值，計算蛋白濃度，重組蛋白的濃度應≥1mg/ml。將檢測合格的重組蛋白，分裝后－20℃保存。

附錄B

（資料性附錄）

溶液的配制

B.1　包被液（碳酸鹽級沖液，pH9.6）

NaHCO3（分析純）　　　　2.98g

Na2CO3（分析純）　　 　　1.5g

加雙蒸水至1000ml，混勻。

B.2　洗滌液（磷酸鹽緩沖液-吐溫，PBST，pH7.4）

NaCl（分析純）　　　　　　　　 　8.0g

KH2PO4（分析純）　　　　　　　　0.2g

Na2HPO·12H2O（分析純）　　 　 　2.9g

KCl（分析純）　　　　　　　       　0.2g

硫柳汞（分析純）　　　　         　　0.1g

吐溫-20（分析純）　　　　       　　0.5ml

加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。

B.3　封閉液（10%小牛血清/PBST溶液，pH7.4）

吸取小牛血清（優級）10ml，加PBST至1000ml，混勻。

B.4　樣品稀釋液（磷酸鹽緩沖液，pH7.4）

NaCl（分析純）　　　　　　　　　　 　8.0g

KH2PO4（分析純）　　　　　　　　　　0.2g

Na2HPO4·12H2O（分析純）　　　　 　　2.9g

KCl（分析純）　　　　　　　　　   　　0.2g

硫柳汞（分析純）　　　　　　　　 　　0.1g

加雙蒸水至1000ml，調至pH7.4。

B.5　酶標抗體稀釋液

同B.3封閉液。

B.6　底物顯色液（TMB-過氧化氫尿素溶液）

B.6.1　底物液A

TMB（分析純）200mg，無水乙醇（或DMSO）100ml，加雙蒸水至1000ml混勻。

B.6.2　底物緩沖液B

Na2HPO4（分析純）　　　        　6g

檸檬酸（分析純）　　　            　9.33g

0.75%過氧化氫尿素　　　     　　6.4ml

加雙蒸水至1000ml，調至pH5.0～5.4。

B.6.3　將底物液A和底物緩沖液B按1∶1混合，即成底物顯色液。

B.7　終止液

將22.2ml濃H2SO4（98%）緩慢滴加入150ml雙蒸水中，邊加邊攪拌，加雙蒸水至200ml。