五、豬輪狀病毒病

豬輪狀病毒病，是由豬輪狀病毒引起的豬急性腸道傳染病，主要癥狀為厭食、嘔吐、下痢，中豬和大豬為隱性感染，沒有癥狀。病原體除豬輪狀病毒外，從犢牛、羔羊、馬駒分離的輪狀病毒也可感染仔豬引起不同程度的癥狀。輪狀病毒對外界環境的抵抗力較強，在18～20℃的糞便和乳汁中，能存活7～9個月。

（一）病毒特征

豬輪狀病毒（rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的A、B、C、E群。成熟完整的病毒粒子呈圓形，沒有囊膜，具有雙層表殼，直徑為65～75nm的十二面體對稱。電鏡觀察，病毒的中央為一個電子致密的六角形棱心，直徑37～40nm，即芯髓；周圍有一電子透明層，殼粒由此向外呈輻射狀排列，構成中間層衣殼；外周為一層光滑薄膜構成的外層衣殼，厚約20nm，形成一個輪狀結構，RV由此而得名。在感染的糞樣和細胞培養物中均存在兩種形式的病毒粒子：具有雙層表殼的光滑型（S型）雙層顆粒，有感染性，直徑為75nm；沒有外表殼的粗糙型（R型）單殼顆粒，無感染性，直徑為65nm。

RV對理化因素作用具有較強的抵抗力，所以清洗和消毒豬舍時必須注意此特點。它耐乙醚、氯仿、去氧膽堿鈉、次氯酸鹽；反復凍融，聲波處理，以及37℃下1h仍不失活；pH3.5～10范圍內病毒保持感染力，對胰蛋白酶穩定，糞便中的RV在18～20℃室溫中經7個月仍有感染性；氯、臭氧、碘、酚等可滅活病毒。

（二）臨床癥狀

潛伏期一般為12～24h，常呈地方性流行。初精神沉郁，食欲不振，不愿走動，有些吃奶后發生嘔吐，繼而腹瀉，糞便呈黃色、灰色或黑色，為水樣或糊狀。癥狀的輕重決定于發病的日齡、免疫狀態和環境條件，缺乏母源抗體保護的出生后幾天的仔豬癥狀最重，環境溫度下降或繼發大腸桿菌病時，常使癥狀加重，病死率增高。通常10～21日齡仔豬的癥狀較輕，腹瀉數日即可康復，3～8周齡仔豬癥狀更輕，成年豬為隱性感染。

（三）病理變化

病理變化病變主要在消化道，胃壁弛緩，充滿凝乳塊和乳汁，腸管變薄，小腸壁薄呈半透明，內容物為液狀，呈灰黃色或灰黑色，小腸絨毛縮短，有時小腸出血，腸系淋巴結腫大。

（四）流行病學特點

輪狀病毒主要存在于病豬及帶毒豬的消化道，隨糞便排到外界環境后，污染飼料、飲水、墊草及土壤等，經消化道途徑使易感豬感染。排毒時間可持續數天，可嚴重污染環境，加之病毒對外界環境有頑強的抵抗力，使輪狀病毒在成豬、中豬之間反復循環感染，長期扎根豬場。另外，人和其他動物也可散播傳染。本病感染沒有明顯的季節性，高峰在晚秋及冬季，一些地區季節性不明顯而呈終年流行，散發，偶見暴發。一旦發生本病，隨后將每年連續發生，因為RV在體外具有較強的抵抗力，且陰性感染的成年動物不斷向外排毒。各種年齡的豬都可感染，在流行地區由于大多數成年豬都已感染而獲得免疫。因此，發病豬多是8周齡以下的仔豬，日齡越小的仔豬，發病率越高，發病率一般為50%～80%，病死率一般為10%以內。自然情況下，多發于2～56日齡的豬，成年豬感染不會發生嚴重的臨床癥狀。有實驗表明RV檢出率最高的仔豬周齡為2～8周齡，檢出率峰值為8周齡仔豬。仔豬體內排出RV峰值是3～4周齡。

（五）預防及治療

治療：無特效治療藥物。發現立即停止喂乳，以葡萄鹽水或復方葡萄糖溶液（葡萄糖43.20g，氯化鈉9.20g，甘氨酸6.60g，檸檬酸0.52g，檸檬酸鉀0.13g，無水磷酸鉀4.35g，溶于2L水中即成）給病豬自由飲用。同時，進行對癥治療，如投用收斂止瀉劑，使用抗菌藥物，以防止繼發細菌性感染。一般都可獲得良好的效果。

預防：主要依靠加強飼養管理，認真執行一般的獸醫防疫措施，增強豬的抵抗力。在流行地區，可用豬輪狀病毒油佐劑滅活苗或豬輪狀病毒弱毒雙價苗對母豬或仔豬進行預防注射。油佐劑苗于懷孕母豬臨產前30d，肌內注射2ml；仔豬于7日齡和21日齡各注射1次，注射部位在后海穴（尾根和肛門之間凹窩處）皮下，每次每頭注射0.5ml。弱毒苗于臨產前5周和2周分別肌內注射1次，每次每頭1ml。同時要使新生仔豬早吃初乳，接受母源抗體的保護，以減少發病和減弱病癥。

（六）實驗室檢測

豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法。

參照標準：GB/T 36871—2018。

1.試劑和儀器設備

除另有規定外，所有試劑均為分析純。提取RNA所用試劑應使用無RNA酶的容器分裝。

（1）儀器　生物安全柜、高速冷凍離心機、組織勻漿器或研缽、PCR儀、水平電泳槽、凝膠成像系統、紫外透射儀、2～8℃冰箱、－20℃冰箱、單道移液器（0.5～10μl、10～50μl、20～200μl、100～1000μl等規格）。

（2）試劑　氯仿（常溫保存）、PBS（見附錄A、常溫保存）、1×TAE（見附錄A、常溫保存）、Trizol（4～8℃保存）、異丙醇（4～8℃保存）、DNA分子量標準（4～8℃保存）、DEPC處理水（見附錄A、4～8℃保存）、陽性對照（PEDV、TGEV和PoRV分別經Vero細胞、PK-15細胞和MA-104細胞傳代，病毒含量分別為25TCID50/ml、50TCID50/ml、50TCID50/ml、－20℃保存）、陰性對照（Vero細胞、PK-15細胞和MA-104細胞懸液、－20℃保存）、RNA反轉錄試劑盒（－20℃保存）、多重RT-PCR方法中使用的各種引物對（見附錄B，引物干粉及稀釋引物保存于－20℃）。

（3）耗材　Eppendorf管（EP管）、PCR管、吸頭。

2.樣品的采集、處理及運輸

（1）樣品的采集和處理

1）生物安全及采樣要求

① 生物安全要求。樣品采集及處理過程中應戴一次性手套、口罩、防護服。

② 采樣要求。應采集出現腹瀉癥狀12～24h內豬的糞便、肛門拭子樣品或解剖豬的小腸；母豬可采集乳汁（初乳最佳）。采集母豬乳汁前要對乳房外表進行消毒；采集病變小腸時，先結扎擬采集腸道區域兩端后，再剪取該組織（防止腸內容物流出），將其全部放入樣品袋內。每個樣品要單獨采集和分裝，避免交叉污染，樣品避免接觸甲醛或高溫，以免降低檢出率。

2）糞便樣品　用潔凈的藥匙和其他物品，刮取適量的新鮮糞便放置于EP管或其他潔凈容器中。

3）肛門拭子樣品

① 采集方法。將滅菌的醫用棉簽插入肛門（以棉簽棉花部分全部插入肛門為準），同一方向轉動3次，確保充分獲取糞便。

② 樣品處理。將肛門拭子放在盛有0.8ml滅菌PBS的無菌EP管中，渦旋振蕩10min，反復凍融2次，4℃條件下14600g離心10min，取上清轉入新的EP管中，編號備用。

4）腸道樣品

① 采集方法。選擇充血、出血、腸壁變薄、含多量水樣糞便等病變明顯的小腸組織。提取模板前，用無菌剪刀剪取約0.5cm×0.5cm，作為待檢樣品。

② 樣品處理。加入0.8～1.0ml PBS混勻，組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，將組織懸液轉入無菌EP管中，反復凍融2次，4℃條件下14600g離心10min，取上清轉入新的EP管中，編號備用。

5）母豬乳汁

① 采集方法。用無菌EP管收集母豬產后乳汁2.0～3.0ml。

② 樣品處理。將乳汁轉入無菌EP管中，反復凍融2次，4℃條件下14600g離心10min，取上清轉入新的EP管中，編號備用。

（2）存放及運輸　采集樣品與冰塊或干冰一起放入保溫壺或保溫箱，密封，在保溫壺和保溫箱外噴灑來蘇爾或季銨鹽類消毒液，盡快送到實驗室檢測。采集或處理樣品在4～8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置于－80℃冰箱，避免反復凍融。

3.操作方法

（1）樣品RNA的制備（Trizol法或RNA提取試劑盒）

1）取1.5ml滅菌EP管，分別加入待檢樣品、陰性對照樣品、陽性對照樣品各200μl，加入1ml Trizol溶液，劇烈振蕩，靜置5min。

2）加入200μl氯仿，振蕩，冰上靜置7min。

3）4℃條件下14600g離心10min，取上清600μl，加入等體積異丙醇混勻后，冰上靜置10min。4℃條件下14600g離心7min，棄上清，加入800μl 75%的冷乙醇，9800g離心5min。

4）棄上清，自然干燥5min，加入20μl DEPC處理水溶解沉淀，即為RNA模板。

（2）反轉錄（cDNA的合成）　配制反轉錄反應體系，每管加入（1）、4）中制備的RNA模板16μl和4μl 5×RNA反轉錄反應混合液（含Buffer、dNTP、M-MLV、RNA酶抑制劑、通用反轉錄引物等），37℃水浴15min或置于PCR儀中37℃15min，反應結束后，經85℃15s滅活反轉錄酶，即為cDNA，直接用于PCR擴增或－20℃凍存備用。

（3）多重PCR擴增　PCR擴增體系配制見表1-12。引物工作濃度均為10μmol/L，各種試劑加完后充分混勻，瞬時離心，使反應液全部集中于孔底。

PCR擴增條件：94℃預變性5min后，94℃50s，55℃1min，72℃1min，35個循環，最后72℃延伸10min，擴增反應結束后取出產物置于4～8℃。

（4）擴增產物的電泳檢測

1）取適量的瓊脂糖配制濃度為1.5%的瓊脂糖溶液，充分溶化后按1∶10000加入溴化乙錠或新型核酸染料，倒入膠槽制備凝膠板。

2）在電泳槽中加入1×TAE，使液面沒過凝膠。取8μl擴增產物加入各凝膠孔；取5μl DNA分子量標準物（DL2000 Marker）加到另一凝膠孔中。

3）電泳，待染料移行到凝膠4/5距離，停止電泳。

4）將電泳好的凝膠放到紫外透射儀或凝膠成像系統上觀察，判定結果并做好記錄。

4.結果判定

（1）試驗成立條件　含PEDV、TGEV和PoRV陽性對照材料，PCR擴增產物電泳后，同時出現大小約663bp、528bp和333bp的特異性條帶，陰性對照材料無任何擴增產物，則試驗結果成立；缺少任何一條擴增產物或大小不符，則試驗不成立。

（2）結果判定

1）檢測結果分類　在試驗成立的前提下，被檢樣品中可出現PEDV、TGEV和PoRV等3種病原的三重感染、二重感染、單獨感染和不感染的結果。

2）陽性結果

① 出現大小約為663bp、528bp和333bp的3條特異性條帶，判為PEDV、TGEV和PoRV三重感染陽性。

② 二重感染。出現大小約為663bp和528bp的特異性條帶，判定為PEDV和TGEV二重感染陽性；出現大小約為663bp和333bp的特異性條帶，判定為PEDV和PoRV二重感染陽性；出現大小約為528bp和333bp的特異性條帶，判定為TGEV和PoRV二重感染陽性。

③ 單獨感染。僅出現大小約為663bp或528bp或333bp的特異性條帶，判定為PEDV或TGEV或PoRV單獨感染陽性。

④ 陰性結果。未出現大小約為663bp、528bp和333bp的特異性條帶，判定為PEDV、TGEV和PoRV陰性。

附錄A

（規范性附錄）

試驗試劑和溶液的配制

A.1　0.01mol/L（pH7.2）PBS

NaCl　　　　　　　  　8.0g

KH2PO4　　 　　　　　0.2g

Na2HPO4　　 　　 　 　2.9g

KCl　　                    　　0.2g

加蒸餾水至1000ml，調pH值至7.2～7.4， 121℃高壓滅菌30min。

A.2　1×TAE

Tris堿　　　　　　　　　　　　　　 　24.2g

冰乙酸　　　　　　　　　　　　　　　5.7ml

0.5mol/L EDTA（pH8.0）　　　　　　   10.0ml

加蒸餾水至100ml，使用時用蒸餾水作50倍稀釋。

A.3　DEPC處理水

用0.1%DEPC處理后的蒸餾水，經121℃高壓滅菌30min。

附錄B

（規范性附錄）

豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重RT-PCR引物序列（表1-13）。