四、豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種動(dòng)物病毒。在20世紀(jì)90年代，世界范圍內(nèi)人們?cè)诓∝i及一些無(wú)明顯臨床癥狀豬體內(nèi)檢測(cè)到了一種新型豬小環(huán)狀樣病毒（Allan和Ellis，2000）。

有人建議將原來(lái)的PCV命名為圓環(huán)病毒Ⅰ型（PCV-1），將新出現(xiàn)的與臨床疾病相關(guān)的PCV命名為圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV-2）。PCV-2感染后會(huì)出現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病、繁殖障礙綜合征等?，F(xiàn)“豬圓環(huán)病毒病”（PCVD）的含義是指群體病或是與PCV-2相關(guān)的疾病。PCVD中，PMWS對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害最為嚴(yán)重，在歐洲每年可造成養(yǎng)豬業(yè)約6億歐元的損失。

（一）病毒特征

豬圓環(huán)病毒是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒。PCV2為致病性的病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原。本病最早發(fā)現(xiàn)于加拿大（1991），很快在歐美及亞洲一些國(guó)家包括我國(guó)發(fā)生和流行，除PMWS外，PDNS（豬皮炎與腎病綜合征）、PNP（增生性壞死性肺炎）、PRDC（豬呼吸道疾病綜合征）、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2及其相關(guān)的豬病，死亡率10%～30%不等，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬免疫障礙的重要傳染病。

1974年，德國(guó)人Tischer發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒（PCV）為二十面體對(duì)稱、無(wú)囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒。病毒粒子直徑為17nm，是發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。

PCV對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，在pH 3的酸性環(huán)境中很長(zhǎng)時(shí)間不被滅活。該病毒對(duì)氯仿不敏感，在56℃或70℃處理一段時(shí)間不被滅活。在高溫環(huán)境也能存活一段時(shí)間。不凝集牛、羊、豬、雞等多種動(dòng)物和人的紅細(xì)胞。

在病豬鼻黏膜、支氣管、肺臟、扁桃體、腎臟、脾臟和小腸中有PCV粒子存在。胸腺、脾、腸系膜、支氣管等處的淋巴組織中均有該病毒，其中肺臟及淋巴結(jié)中檢出率較高。表明PCV嚴(yán)重侵害豬的免疫系統(tǒng)：病毒與巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、組織細(xì)胞和胸腺巨噬細(xì)胞相伴隨，導(dǎo)致患豬體況下降，形成免疫抑制。由于免疫抑制而導(dǎo)致免疫缺陷，其臨床表現(xiàn)為：對(duì)低致病性或減弱疫苗的微生物可以引發(fā)疾??；重復(fù)發(fā)病對(duì)治療無(wú)應(yīng)答性；對(duì)疫苗接種沒(méi)有充分免疫應(yīng)答；在一窩豬中有一頭以上發(fā)生無(wú)法解釋的出生期發(fā)病和死亡；豬群中同時(shí)有多種疾病綜合征發(fā)生。這些特征在PMWS的豬群中基本上都有不同程度的發(fā)生。

淋巴細(xì)胞缺失和淋巴組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，是PMWS病豬的獨(dú)特性病理?yè)p害和基本特征。而且此特征與血液循環(huán)中B及T細(xì)胞減少和淋巴器官中這類(lèi)細(xì)胞的減少呈高度相關(guān)；與周?chē)汉土馨徒M織中巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞譜系細(xì)胞的增加呈高度相關(guān)。另外已證實(shí)淋巴組織、相關(guān)免疫細(xì)胞和血液中的細(xì)胞存在大量的PCV2抗原。

（二）臨床癥狀

最常見(jiàn)的是豬只漸進(jìn)性消瘦或生長(zhǎng)遲緩，這也是診斷PMWS所必需的臨床依據(jù)，其他癥狀有厭食、精神沉郁、行動(dòng)遲緩、皮膚蒼白、被毛蓬亂，呼吸困難、咳嗽為特征的呼吸障礙（圖1-47）。較少發(fā)現(xiàn)的癥狀為腹瀉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂。發(fā)病率一般很低而病死率都很高。體表淺淋巴結(jié)腫大，腫脹的淋巴結(jié)有時(shí)可被觸摸到，特別是腹股溝淺淋巴結(jié)；貧血和可視黏膜黃疸。在1頭豬可能見(jiàn)不到上述所有臨床癥狀，但在發(fā)病豬群可見(jiàn)到所有的癥狀。胃潰瘍、嗜睡、中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙和突然死亡較為少見(jiàn)。絕大多數(shù)PCV2是亞臨床感染。一般臨床癥狀可能與繼發(fā)感染有關(guān)，或者完全是由繼發(fā)感染所引起的。在通風(fēng)不良、過(guò)分擁擠、空氣污濁、混養(yǎng)以及感染其他病原等因素時(shí)，病情明顯加重，一般病死率為10%～30%。

先天性顫抖的癥狀：顫抖由輕微到嚴(yán)重不等，一窩豬中感染的數(shù)目也變化較大。嚴(yán)重顫抖的病仔豬常在出生后1周內(nèi)因不能吮乳而饑餓致死。耐過(guò)1周的乳豬能存活，3周齡時(shí)康復(fù)。顫抖是兩側(cè)性的，乳豬躺臥或睡覺(jué)時(shí)顫抖停止。外部刺激如突然聲響或寒冷等能引發(fā)或增強(qiáng)顫抖。有些豬一直不能完全康復(fù)，整個(gè)生長(zhǎng)期和育肥期繼續(xù)顫抖。發(fā)病窩豬常為新引入的年輕種豬所生，這表明這些血清學(xué)陰性種豬在懷孕的關(guān)鍵期接觸了PCV。

常見(jiàn)的混合感染：PCV感染可引起豬的免疫抑制，從而使機(jī)體更易感染其他病原，這也是圓環(huán)病毒與豬的許多疾病混合感染有關(guān)的原因。最常見(jiàn)的混合感染有PRRSV病、PrV（偽狂犬病毒）病、PPV（細(xì)小病毒）病、肺炎支原體病、多殺性巴氏桿菌病、PEDV（流行性腹瀉病毒）病、SIV（豬流感病毒）病，有的呈二重感染或三重感染，其病豬的病死率也將大大提高，有的可達(dá)25%～40%。

（三）病理變化

剖檢病變：本病主要的病理變化為患豬消瘦，貧血，皮膚蒼白，黃疸（疑似PMWS的豬有20%出現(xiàn)）；淋巴結(jié)異常腫脹（圖1-48），內(nèi)臟和外周淋巴結(jié)腫大到正常體積的3～4倍，切面為均勻的白色；肺部有灰褐色炎癥和腫脹，呈彌漫性病變，密度增加，堅(jiān)硬似橡皮樣；肝臟發(fā)暗，呈淺黃到橘黃色外觀，萎縮，肝小葉間結(jié)締組織增生；腎臟水腫（有的可達(dá)正常的5倍），蒼白，被膜下有壞死灶；脾臟輕度腫大，質(zhì)地如肉；胰、小腸和結(jié)腸也常有腫大及壞死病變（圖1-49）。

組織學(xué)病變：病變廣泛分布于全身器官、組織，廣泛性的病理?yè)p傷。肺有輕度多灶性或高度彌漫性間質(zhì)性肺炎；肝臟有以肝細(xì)胞的單細(xì)胞壞死為特征的肝炎；腎臟有輕度至重度的多灶性間質(zhì)性腎炎；心臟有多灶性心肌炎。在淋巴結(jié)、脾、扁桃體和胸腺常出現(xiàn)多樣性肉芽腫炎癥。PMWS病豬主要的病理組織學(xué)變化是淋巴細(xì)胞缺失。

（四）流行病學(xué)特征

PMWS是最早被認(rèn)識(shí)和確認(rèn)的由PCV2感染所致的疾病。常見(jiàn)的PMWS主要發(fā)生在5～16周齡的豬，最常見(jiàn)于6～8周齡的豬，極少感染乳豬。一般于斷奶后2～3天或1周開(kāi)始發(fā)病，急性發(fā)病豬群中，病死率可達(dá)10%，耐過(guò)豬后期發(fā)育明顯受阻。但常常由于并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可達(dá)25%以上。血清學(xué)調(diào)查表明，PCV在世界范圍內(nèi)流行。在德國(guó)和加拿大，豬群中PCV抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)95%和55%，在英國(guó)和愛(ài)爾蘭，豬群中PCV抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)86%和92%，但不一定表現(xiàn)PMWS癥狀。在我國(guó)對(duì)部分省市豬群檢測(cè)，20日齡未斷奶仔豬陽(yáng)性率為0，1～2月斷奶仔豬陽(yáng)性率為16.5%，后備母豬陽(yáng)性率為42.3%，經(jīng)產(chǎn)母豬陽(yáng)性率為85.6%，肥育豬陽(yáng)性率為51%，總陽(yáng)性率為42.9%。臨床癥狀可能在幾個(gè)月內(nèi)持續(xù)存在，在6～12個(gè)月達(dá)到高峰，接著下降；一群與另一群之間的感染有很大差別，因?yàn)槿樨i體內(nèi)母源的PCV抗體在其出生后8～9周齡時(shí)消失，而小豬轉(zhuǎn)移到育肥圈時(shí)（11～13周齡）又接觸了PCV，PCV抗體又出現(xiàn)了。

豬對(duì)PCV2具有較強(qiáng)的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬。懷孕母豬感染PCV2后，可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播感染仔豬。人工感染PCV2血清陰性的公豬后精液中含有PCV2的DNA，說(shuō)明精液傳播可能是另一種傳播途徑。用PCV2人工感染試驗(yàn)豬后，其他未接種豬的同居感染率是100%，這說(shuō)明該病毒可水平傳播。豬在不同豬群間的移動(dòng)是該病毒的主要傳播途徑，也可通過(guò)被污染的衣服和設(shè)備進(jìn)行傳播。

工廠化養(yǎng)殖方式可能與本病有關(guān)，飼養(yǎng)管理不善、惡劣的斷奶環(huán)境、不同來(lái)源及年齡的豬混群、飼養(yǎng)密度過(guò)高及刺激仔豬免疫系統(tǒng)均為誘發(fā)本病的重要危險(xiǎn)因素，但豬場(chǎng)的大小并不重要。

PCV感染試驗(yàn)動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)只有豬產(chǎn)生特異性抗體，而兔、鼠、牛，甚至人均為血清學(xué)試驗(yàn)陰性。

PCV1對(duì)豬無(wú)致病性，但能產(chǎn)生血清抗體，并且在調(diào)查的豬群中普遍存在。

PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），并多發(fā)于5～16周齡的豬。

PCV能水平傳播，接觸病毒后1周， 血清中能檢出抗體，隨后滴度不斷升高。

（五）預(yù)防及治療

本病無(wú)有效的治療方法，加上患豬生產(chǎn)性能下降和高死亡率，使本病顯得尤為重要。而且因?yàn)镻CV2的持續(xù)感染，使本病在經(jīng)濟(jì)上具有更大的破壞性?？股氐膽?yīng)用和良好的管理有助于解決并發(fā)感染的問(wèn)題。

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：降低飼養(yǎng)密度，實(shí)行嚴(yán)格的全進(jìn)全出制和混群制度，減少環(huán)境應(yīng)激因素，控制并發(fā)感染，保證豬群具有穩(wěn)定的免疫狀態(tài)，加強(qiáng)豬場(chǎng)內(nèi)部和外部的生物安全措施，購(gòu)豬時(shí)保證豬來(lái)自清潔的豬場(chǎng)，是預(yù)防控制本病、降低經(jīng)濟(jì)損失的有效措施。專利消毒劑Virkon S在1∶250稀釋消毒時(shí)能有效殺滅圓環(huán)病毒，因此可將其應(yīng)用于每批豬之間的終端消毒。

做好豬主要傳染病的免疫工作：PCV2與其相關(guān)豬病的發(fā)生還需要另外的條件或共同因素才得以誘發(fā)。世界各國(guó)控制本病的經(jīng)驗(yàn)是對(duì)共同感染源作適當(dāng)?shù)闹鲃?dòng)免疫和被動(dòng)免疫，所以做好豬場(chǎng)豬瘟、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病、氣喘病和藍(lán)耳病等疫苗的免疫接種，確保胎兒和吮乳期仔豬的安全是關(guān)鍵。因此根據(jù)不同的可能病原和不同的疫苗對(duì)母豬實(shí)施合理的免疫程序至關(guān)重要。

人工被動(dòng)免疫：可采取血清療法。從豬場(chǎng)的育肥豬采血（健康的淘汰種豬血最好），分離血清，給斷乳期的仔豬腹腔注射。

自家疫苗的使用：豬場(chǎng)一旦發(fā)生本病，可把發(fā)病豬的內(nèi)臟加工成自家疫苗，據(jù)臨床實(shí)踐，效果不錯(cuò)。但現(xiàn)階段有兩種觀點(diǎn)。一是母豬和斷奶仔豬同時(shí)免疫，優(yōu)點(diǎn)是免疫效果快，基本在1～2月內(nèi)能控制本?。蝗秉c(diǎn)是如果滅活不徹底，將使本病長(zhǎng)期存在。二是只免疫斷奶仔豬，優(yōu)點(diǎn)是免疫安全性好，基本不會(huì)使本病長(zhǎng)期存在；缺點(diǎn)是免疫效果慢，需要半年左右的時(shí)間才能控制本病。

“感染”物質(zhì)的主動(dòng)免疫：“感染”物質(zhì)指本豬場(chǎng)感染豬的糞便、死產(chǎn)胎豬、木乃伊胎等，用來(lái)喂飼母豬，尤其是初產(chǎn)母豬在配種前喂給，能得到較好的效果。如有一定抗體的母豬在懷孕80天以后再作補(bǔ)充喂飼，則可產(chǎn)生較高免疫水平，并通過(guò)初乳傳遞給仔豬。這種方法不僅對(duì)防制本病、保護(hù)胎豬和吮乳豬的健康有效，而且對(duì)其他腸道病毒引起的繁殖障礙也有較好的效果。但使用本法要十分慎重，如果場(chǎng)內(nèi)有小豬會(huì)造成人工感染。

藥物預(yù)防：預(yù)防性投藥和治療，對(duì)控制細(xì)菌源性的混合感染或繼發(fā)感染，是非?？扇〉?。但是至今PCV2引起相關(guān)豬病的病原和機(jī)制尚未完全了解，因此還不能完全依賴特異性防制措施，只能同時(shí)開(kāi)展有效的綜合性措施，才能收到事半功倍的效果。

以下藥物預(yù)防方案可以試用。

仔豬用藥：哺乳仔豬在3、7、21日齡注射3次得米先（長(zhǎng)效土霉素，200mg/ml，每次0.5ml），或者在1、7日齡和斷奶時(shí)各注射速解靈（頭孢噻呋，500mg/ml）0.2ml；斷奶前1周至斷奶后1個(gè)月，用支原凈（50mg/kg）+金霉素或土霉素或強(qiáng)力霉素（150mg/kg）拌料飼喂，同時(shí)用阿莫西林（500mg/L）飲水。

母豬用藥：母豬在產(chǎn)前1周和產(chǎn)后1周，飼料中添加支原凈（100mg/kg）+金霉素或土霉素（300mg/kg）。

綜合防制計(jì)劃如下。

分娩期：仔豬全進(jìn)全出，兩批豬之間要清掃消毒；分娩前要清洗母豬和治療寄生蟲(chóng)；限制交叉哺乳，如果確實(shí)需要也應(yīng)限制在分娩后24h以內(nèi)。

斷乳期：豬圈小，原則上一窩一圈，豬圈分隔堅(jiān)固；堅(jiān)持嚴(yán)格的全進(jìn)全出，并有與鄰舍分割的獨(dú)立糞尿排出系統(tǒng)；降低飼養(yǎng)密度（>0.33m2/頭豬）；增加喂料器空間（>7cm/只仔豬）；改善空氣質(zhì)量（NH3<10×10－6，CO2<0.1%），相對(duì)濕度<85%。豬舍溫度控制和調(diào)整：3周齡仔豬為28℃，每隔1周調(diào)低2℃，直至常溫；批與批之間不混群。

生長(zhǎng)育肥期：豬圈小，壁式分隔；堅(jiān)持嚴(yán)格的全進(jìn)全出、空欄、清洗和消毒制度；從斷奶后豬圈移出的豬不混群；整個(gè)育肥圈豬不再混群；降低飼養(yǎng)密度（>0.75m2/頭豬）；改善空氣質(zhì)量和溫度。

其他：適宜的疫苗接種計(jì)劃；保育舍要有獨(dú)立的飲水加藥設(shè)施；嚴(yán)格的保健措施（斷尾、斷齒、注射時(shí)嚴(yán)格消毒）；將病豬及早移到治療室或撲殺。

防治措施如下。

實(shí)驗(yàn)獸醫(yī)生物安全措施：認(rèn)真地對(duì)待引種工作，引種不慎往往是暴發(fā)疫情的主要原因。引進(jìn)的后備母豬應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫，所購(gòu)買(mǎi)的種公豬、精液必須無(wú)圓環(huán)病毒Ⅱ型感染。

改進(jìn)飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激，合理配制日糧。注意通風(fēng)與保暖，保持豬舍干燥，改善豬舍的空氣質(zhì)量，降低氨氣濃度。去勢(shì)和注射須遵循良好的衛(wèi)生和消毒習(xí)慣。

在豬場(chǎng)內(nèi)禁養(yǎng)貓、犬，定期驅(qū)蚊蠅、投餌滅鼠。搞好種豬群的凈化，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。定期監(jiān)測(cè)，合理制訂免疫程序，避免過(guò)早或過(guò)多地對(duì)仔豬免疫，減少各種應(yīng)激因素對(duì)仔豬的影響。

在豬圓環(huán)病毒Ⅱ型易感期最好不注射應(yīng)激較大的疫苗，如仔豬副傷寒疫苗、口蹄疫疫苗、氣喘病疫苗等，某些可以靠藥物預(yù)防的細(xì)菌性傳染病，如豬丹毒、豬肺疫、豬鏈球菌病、仔豬副傷寒等，可以暫停疫苗注射。

（六）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

豬圓環(huán)病毒Ⅱ型阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 35910—2018。

1.儀器、材料與試劑

（1）試驗(yàn)儀器　酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、微量移液器。

（2）試驗(yàn)材料　96孔酶標(biāo)反應(yīng)板、注射器、微量離心管（1.5ml）、吸頭。

（3）主要試劑　PCV2重組核衣殼蛋白（Cap）抗原（見(jiàn)附錄A）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的PCV2單克隆抗體、PCV2陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清（見(jiàn)附錄A）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）（見(jiàn)附錄B）、商品化PCV2 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒。

2.PCV2抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法

（1）樣品采集、運(yùn)輸與保存處理

1）樣品的采集與運(yùn)送　采用消毒注射器經(jīng)豬頸靜脈采集血液2ml，凝固后24h內(nèi)在冷藏條件下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。若不能及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)分離血清，放入無(wú)菌微量離心管中置－20℃保存，并在凍結(jié)狀態(tài)下送往實(shí)驗(yàn)室。

2）血清分離與保存　取凝固血液，2000r/min離心5min，收集上清，放入無(wú)菌微量離心管中，立即用于抗體檢測(cè)，或置－20℃保存。要求血清清亮，無(wú)溶血。

（2）ELISA操作步驟

1）抗原包被板的制備

① 抗原包被板　用抗原包被液（見(jiàn)附錄B）將PCV2 Cap蛋白（見(jiàn)附錄A）稀釋成2.0μg/ml，加入96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔100μl，置37℃ 2h。

② 洗滌　傾去孔中液體，用PBST洗滌液（見(jiàn)附錄B）洗滌，每孔300μl，洗滌3次，每次3min，最后一次拍干。

③ 封閉　每孔加入200μl 1%BSA（牛血清白蛋白）封閉液（見(jiàn)附錄B），置37℃孵育3h。

④ 加保護(hù)劑　棄去孔中液體，洗滌3次，加入抗原保護(hù)劑（見(jiàn)附錄B），100μl/孔，置37℃下作用1h。

⑤ 密封　置37℃晾干，用錫箔紙真空包裝，密封。

2）血清樣品稀釋和加樣　取出抗原包被板并在記錄表上標(biāo)記待檢樣品（YP1-YPn）的位置。用血清稀釋液（見(jiàn)附錄B）在稀釋板內(nèi)將待檢血清1∶1稀釋，即每孔先加50μl樣品稀釋液，再加50μl待檢血清，混勻后，按記錄表中標(biāo)記的對(duì)應(yīng)于抗原包被板的位序，依次加入YP1、YP2、YP3……位置的各孔中，吸取每份血清時(shí)均應(yīng)更換吸頭。

待檢血清樣品數(shù)量較多時(shí)（≥10份），應(yīng)先使用血清稀釋板稀釋所有待檢血清，再將稀釋好的血清轉(zhuǎn)移到抗原包被板，以盡可能使反應(yīng)時(shí)間一致。

3）加對(duì)照血清　用血清稀釋液將陽(yáng)性對(duì)照血清（見(jiàn)附錄A）、陰性對(duì)照血清（見(jiàn)附錄A）分別做1∶1稀釋后，各取100μl陰性對(duì)照血清分別加入A1孔和A2孔，各取100μl陽(yáng)性對(duì)照血清分別加入B1孔和B2孔。吸取不同血清時(shí)需更換吸頭。

4）混合孵育　輕輕振蕩微量反應(yīng)板，用封條封閉，置37℃孵育2h。

5）洗滌　同1）。

6）加酶標(biāo)單抗和孵育　每孔加入100μl工作濃度的HRP標(biāo)記的PCV2單克隆抗體，37℃孵育30min。該試劑使用前恢復(fù)至室溫，使用后放回2～8℃。

7）洗滌　同1）中第②步。

8）顯色　每孔加入100μl TMB底物液顯示液（見(jiàn)附錄B），37℃避光孵育10～15min，至陰性對(duì)照顯藍(lán)色、陽(yáng)性對(duì)照基本不顯色時(shí)，每孔加入50μl終止液（見(jiàn)附錄B）。

9）讀數(shù)　在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm波長(zhǎng)處讀取各孔的OD值數(shù)，15min內(nèi)完成。

（3）結(jié)果判定

1）結(jié)果計(jì)算

陰性對(duì)照平均OD值（NCX）見(jiàn)式（1-6）：

NCX=（A1孔OD值+A2孔OD值）/2　　 （1-6）

陽(yáng)性對(duì)照平均OD值（PCX）見(jiàn)式（1-7）：

PCX=（B1孔OD值+B2孔OD值）/2　　 （1-7）

樣品阻斷率的計(jì)算方式見(jiàn)式（1-8）：

阻斷率（PI）=（NCX－樣品OD值）/NCX×100%　　 （1-8）

2）判定　NCX大于0.7、PCX小于0.4時(shí)，試驗(yàn)成立。當(dāng)PI≥38%判為陽(yáng)性，PI≤30%判為陰性，30%<PI<38%判為可疑，對(duì)可疑樣品應(yīng)重新檢測(cè)1次，PI<38%，判為陰性。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

抗原抗體的制備

A.1　重組Cap抗原制備

A.1.1　菌種

表達(dá)抗原蛋白的菌種為BL21-CapC，由含PCV2 Cap第51～234aa基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-CapC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得。

A.1.2　菌液培養(yǎng)

取BL21-CapC種子液按培養(yǎng)基體積1%量接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中200r/min，37℃搖床振蕩培養(yǎng)，1.5～2h，菌液濃度OD600nm值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度1.0mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)6h。

A.1.3　菌體裂解與包涵體蛋白提取

將A.1.2收集的細(xì)菌樣品4℃8000r/min離心5min，PBS緩沖液重懸，如此洗滌2次；棄上清，用適量PBS重懸細(xì)菌沉淀，并反復(fù)凍融3次；在功率200W的條件下超聲波裂解細(xì)菌，超聲裂解5s，停頓5s，直至菌液變得清澈，在冰盒上操作；將上述裂解物4℃8000r/min離心10min，沉淀用與上清等體積的PBS重懸。8000r/min離心15min，包涵體洗液Ⅱ（見(jiàn)附錄B）重懸沉淀，4℃2h，重復(fù)1次；8000r/min離心15min，用8mol/L尿素重懸沉淀，4℃放置12～24h；8000r/min離心15min，吸取上清（即純化后的蛋白）至微量離心管，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，分裝，－20℃保存。

A.1.4　重組抗原質(zhì)量檢驗(yàn)

A.1.4.1　抗原純度鑒定

取A.1.3收集的樣品，加入25μl的5×蛋白樣品上樣緩沖液，充分混勻后100℃煮沸5min，立即置冰上1～2min，上樣前瞬時(shí)離心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDS-PAGE分析，在41kDa處出現(xiàn)一條清晰條帶，抗原純度達(dá)90%以上。

A.1.4.2　蛋白抗原性鑒定

取上述收集的樣品20μl，按A.1.4.1方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。然后25V恒壓下，轉(zhuǎn)印45min，使目的條帶轉(zhuǎn)印至NC膜上。用PBST洗滌液配制的5%的脫脂乳封閉2h，PBST洗滌后，加適量稀釋的PCV2 Cap單克隆抗體，作用1h PBST洗滌，再加1∶20000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP作用1h，洗滌后加顯色液于暗室曝光，應(yīng)在4kDa處出現(xiàn)單一清晰條帶，且無(wú)其他雜帶。

A.1.4.3　抗原濃度的測(cè)定

用紫外分光光度計(jì)，分別測(cè)定包被抗原在280nm和260nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度（OD），按公式1.45×OD280nm－0.74×OD260nm計(jì)算抗原濃度，濃度不低于0.5mg/ml。

A.1.4.4　抗原免疫學(xué)活性鑒定

采用ELISA方法測(cè)定。用抗原包被液將純化的蛋白從1.0μg/ml稀釋至0.2μg/ml，包被ELISA酶標(biāo)板，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。選擇陽(yáng)性對(duì)照血清的S/P值高于陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的抗原最高稀釋倍數(shù)作為抗原包被濃度?？乖r(jià)應(yīng)大于0.25μg/ml。

A.1.5　分裝及保存

將檢測(cè)合格的抗原分裝到1.5ml微量離心管中，分裝量為1ml/管，置－70℃下保存，有效期為12個(gè)月。避免反復(fù)凍融和污染。

A.2　PCV2陽(yáng)性和隱形血清制備

A.2.1　陽(yáng)性對(duì)照血清

A.2.1.1　血清來(lái)源動(dòng)物

4～6周齡健康仔豬，隔離觀察7d。

A.2.1.2　免疫接種

取PCV2 SH株病毒液，頸部肌內(nèi)注射2ml/頭，間隔28d用相同劑量PCV2再次肌注接種，第二次接種后20～40d采血分離血清，用PCV2間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)PCV2抗體，抗體效價(jià)大于1∶64時(shí)，即可用于采血并分離血清。

A.2.1.3　血清制備

采取頸部動(dòng)脈采血方式，無(wú)菌采集血液，離心分離血清，用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌。用PCV2間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)PCV2抗體，應(yīng)為陽(yáng)性。用阻斷ELISA方法檢測(cè)PCV2 ELISA抗體，阻斷率均應(yīng)大于60%，OD450nm值應(yīng)低于0.4。

A.2.1.4　血清保存

置－70℃以下保存，避免反復(fù)凍融和污染，有效期24個(gè)月。

A.2.2　陰性對(duì)照血清

A.2.2.1　血清來(lái)源動(dòng)物

同A.2.1.1。

A.2.2.2　血清制備

采取頸部動(dòng)脈采血方式，無(wú)菌采集血液，離心分離血清，用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌。用PCV2間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)PCV2抗體，應(yīng)為陰性。用阻斷ELISA方法檢測(cè)PCV2 ELISA抗體，阻斷率均應(yīng)大于30%，OD450nm值應(yīng)大于0.7。

A.2.2.3　血清保存

同A.2.1.4。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

溶液的配制

B.1　抗原包被液（pH9.6，0.05mol/L）

稱取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加去離子水800ml，用1mol/L NaOH和1mol/L的HCl調(diào)pH值至9.6，加去離子水定容至1000ml。

B.2　封閉液

稱取BSA1g，溶解于100ml PBST洗滌液中，0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝后4℃保存。

B.3　保護(hù)劑

稱取BSA0.5g、蔗糖2g，加去離子水溶解并定容至100ml，0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝后2～8℃備用。

B.4　樣品稀釋液

取NaCl 8g、KH2PO4·2H2O 2g、Na2HPO4·2H2O 2.9g、KCl 0.2g和吐溫-20 0.5ml，溶于滅菌去離子水中，定容至1000ml，0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝，20ml/瓶。2～8℃下保存。

B.5　10倍濃縮洗滌液

取NaCl 8g、KH2PO4·2H2O 2g、Na2HPO4·12H2O 29g、KCl 2g和吐溫-20 5ml，加入滅菌去離子水充分溶解，定容至1000ml，0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝，80ml/瓶。2～8℃下保存。

PBST洗滌液配制：將10倍濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使其溶解，然后用去離子水作10倍稀釋，混勻，稀釋好的洗滌液在2～8℃下可存放7d。

B.6　顯色液

A液配制：取Na2HPO414.6g、檸檬酸9.33g、30%H2O2 2ml，加雙蒸水至1000ml，調(diào)pH至5.2。

B液配制：取四甲基聯(lián)苯胺20mg、無(wú)水乙醇10ml，加雙蒸水至1000ml。

使用前A液和B液等量混合，分裝于棕色瓶?jī)?nèi)，20ml/瓶。2～8℃下保存。

B.7　終止液

取去離子水177.8ml，緩慢加入H2SO4 22.2ml，分裝，10ml/瓶。2～8℃下保存。

B.8　包涵體洗液Ⅰ（pH8.0）

取Tris·HCl 6g、NaCl 5.8g、EDTA 2.92g、Triton-X-100 10ml，用去離子水加至1000ml。

B.9　包涵體洗液Ⅱ（pH8.0）

取Tris·HCl 6g、NaCl 5.8g、EDTA 2.92g、Triton-X-100 5ml，用去離子水加至1000ml。