三、豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）所引起的豬的一種接觸性傳染病。臨診上以母豬的繁殖障礙及呼吸道癥狀和仔豬的死亡率增高為主要特征。母豬的繁殖障礙可表現為懷孕后期流產、死產和弱仔，產后仔豬的死淘率增加，斷奶仔豬死亡率高，母豬再次發情時間推遲。哺乳仔豬死亡率超過30%，斷奶仔豬的呼吸道癥狀明顯，主要表現為高熱、呼吸困難等肺炎的癥狀。OIE將本病列為B類動物疫病，我國把其列為二類動物疫病。

本病1987年在美國初次發現，并呈地方流行性。1990年起先后在美洲、歐洲、大洋洲與太平洋島嶼、亞洲等國家和地區蔓延。目前在世界上的主要生豬生產國均發現了本病。本病已給世界養豬業造成嚴重的經濟損失，包括流產、死產及哺乳期前后豬只死亡的損失、飼料利用率低下、藥物費用及勞動力費用增加等，引起了各國普遍重視。因為當時不清楚該病的原因，曾被稱為豬神秘?。⊿wine mystery disease，SMD）、豬藍耳?。˙lue-ear discase）、豬不孕和呼吸綜合征（SIRS）、豬流行性流產與呼吸道綜合征（PEARS）、藍色流產等，1991年召開的國際會議上，被正式命名為“豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）”，1996年OIE已將PRRS列入B類傳染病。我國郭寶清等于1996年首次在暴發流產的胎兒中分離到PRRSV。

（一）病毒特征

PRRSV為套式病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎毒屬（Arterivirus）。在美國被稱為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），而在歐洲則稱其為來利斯塔德病毒（Lelystad virus，LV）。該病毒為小型有囊膜的單鏈RNA病毒，呈20面體對稱，核衣殼直徑40～45nm，衣殼上有5mm的突起，病毒粒子的直徑為60～70nm，對乙醚、氯仿等敏感。PRRSV無血凝活性。

現已證實至少存在2種完全不同類型的病毒，即分布于歐洲的A亞群及分布于美洲的B亞群。歐洲分離株（歐洲株）與美洲分離株（美洲株）雖然在形態及理化特性方面相似，但用多克隆和單克隆抗體進行血清學檢查發現它們存在著較大的差異。典型的差異株是歐洲的 Lelystad毒株和美洲的 ATCC VR-2332株。通過核衣殼蛋白單克隆抗體（MAbs）不僅可以區分歐洲株與美洲株，而且可以區別它們的抗原位點。PRRSV核苷酸序列已確定，將歐洲株與美洲株的氨基酸序列進行比較時，發現歐洲分離株間的序列完全相同，而歐洲株與美洲株間則有顯著的差異。

除了已經被確認的LV和VR-2332毒株間的不同外，在北美分離的 PRRSV毒株間也有差異（即類VR-2332），其中包括在同一時間同一豬場分離到的毒株（Mengeling等，1997）。一般情況下這些差異是僅有很少或者不引起表現型改變的少數序列（堿基）的變化，然而，在北美分離株中確實表現出不同的血清型（Nelson，1998）和毒力（Halbur等，1995；Halbur等，1996b； Mengeling等，1996c）。

PRRSV可在豬肺泡巨噬細胞上增殖并產生細胞病變，也可在其他細胞如Marc-145等細胞上增殖。巨噬細胞內的病毒滴度最高可以達到106.5/ml TCID50。分離株 ATCC VR-2332可以在傳代細胞系CL-2621上增殖。這些培養細胞于感染后2～4d出現細胞病變，滴度可達107/ml TCID50。

病豬的呼吸道上皮及脾巨細胞內均有病毒抗原存在。從死胎、弱仔的血液、腹水、肺等處可以分離到病毒。

PRRSV對熱和pH敏感。37℃48h、56℃45min即喪失活性。37℃12h后病毒的感染效價降低到50%；4℃時，1周內病毒感染性喪失90%，但是在1個月內仍然能夠檢測到低滴度的感染性病毒。－70℃或－20℃下可以長期（數月到數年）穩定存活，感染豬的肺組織Hank’s液勻漿中的病毒在－70℃保存18個月毒力不變。在pH6.5～7.5環境中穩定，但在pH低于5或高于7的環境下很快被滅活。

（二）臨床癥狀

潛伏期通常為14d。由于年齡、性別和豬群機體的免疫狀態、病毒毒力強弱、豬場管理水平及氣候條件等因素的不同，感染豬的臨診表現也不同。

繁殖母豬：急性發病后的主要表現是發熱，精神沉郁，食欲減退或廢絕，嗜睡，咳嗽，不同程度的呼吸困難，間情期延長或不孕。歐洲豬群中病豬出現耳部藍紫色，同時在病豬的腹部及陰部也出現青紫色（圖1-44）。

有時出現呼吸系統的臨診表現。在急性期有1%～3%的母豬可能流產，流產一般發生在妊娠的第21～109d（Hopper等，1992；White，1992）。急性病例發作約1周后，疾病進入第二階段。這是病毒通過胎盤傳播的結果，其特征為妊娠母豬多數在妊娠后期繁殖障礙。它可發生于先前無臨診癥狀感染的母豬，也可出現于疾病的第一階段有臨診感染的母豬。第二階段開始時與第一階段重疊在一起，但第二階段比第一階段長，常為1～4個月。在第二階段，妊娠100～114d的母豬，有5%～80%可能發生繁殖障礙。大多數繁殖障礙為母豬早產，但也可產妊娠足月或超出妊娠期的仔豬，或者出現流產。所產窩中有不同數量的正常豬、弱小豬、新鮮死胎（分娩過程中死亡）、自溶死胎（分娩前死亡）和部分木乃伊胎兒或完全木乃伊胎兒。當1～4個月流行期進一步發展時，每窩仔豬的主要異常情況從死胎和大的部分木乃伊化的胎兒變為小的較完全木乃伊化的胎兒，到小弱胎兒，到正常大小和有活力的仔豬。在一些豬場，主要的異常豬為活產、早產體弱和體小豬，但少數為死胎。人工接種妊娠84～93d的母豬時，潛伏期為2～4d，繼之出現呼吸系統癥狀和皮膚顏色的改變，如耳尖變藍等，于感染后6～12d可以觀察到該母豬的流產現象。

哺乳豬：在母豬表現繁殖障礙的1～4個月間，出生時弱胎和正常胎兒的斷奶前病死率都高（可達60%）。幾乎所有的早產弱豬，在出生后的數小時內死亡。其余豬在出生后的第一周病死率最高，并且死亡可能延續到斷奶和斷奶后，在分娩舍內受到感染的仔豬，臨診上表現為精神沉郁、食欲不振、消瘦、外翻腿姿、發熱（持續1～3d）和呼吸困難（悶氣）及眼結膜水腫。有一些豬眼結膜水腫嚴重，導致典型的眼瞼和結膜水腫，這是一種近于有“診斷意義”的病變。

斷奶和育肥豬：持續性的厭食、沉郁、呼吸困難，皮膚充血，皮毛粗糙，發育遲緩，耳鼻端乃至肢端發紺。病程后期常由于多種病原的繼發性感染（敗血性沙門氏菌病、鏈球菌性腦膜炎、支原體肺炎、增生性腸炎、萎縮性鼻炎、大腸桿菌、疥螨等）而導致病情惡化。病死率較高。老齡豬和育肥豬受 PRRSV感染的影響小，僅出現短時間的食欲不振、輕度呼吸系統癥狀及耳朵皮膚發紺現象，但可因繼發感染而加重病情，導致病豬的發育遲緩或死亡。

公豬：公豬感染后出現食欲不振、沉郁、呼吸道癥狀，缺乏性欲，其精液的數量和質量下降，可以在精液中檢查到 PRRSV，并可以通過精液傳播病毒而成為重要的傳染源，但是公豬的病毒血癥對受胎的影響還不清楚。精液變化出現于病毒感染后2～10周，表現為運動能力降低和頂體缺乏。

（三）病理變化

PRRSV能引起豬多系統感染，導致所有的組織都可能被病毒感染，然而大體病變僅出現于呼吸系統和淋巴組織。通常感染豬子宮、胎盤、胎兒乃至新生仔豬。剖檢死胎、弱仔和發病仔豬常能觀察到肺炎病變。患病哺乳仔豬肺臟出現重度多灶性乃至彌漫性黃褐色或褐色的肝變，可能對本病診斷具有一定的意義。此外，尚可見到脾臟腫大，淋巴結腫脹（圖1-45），心臟腫大并變圓，胸腺萎縮，心包、腹腔積液（圖1-46），眼瞼及陰囊水腫等變化。

組織學變化是新生仔豬和哺乳豬縱隔內出現明顯的單核細胞浸潤及細胞的灶狀壞死、肺泡間質增生而呈現特征性間質性肺炎的表現。有時可以在肺泡腔內觀察到合胞體細胞和多核巨細胞。

（四）流行病學特征

易感動物：自然條件下，豬是唯一的易感動物，目前在許多國家的家豬及野豬均有報道。各種年齡豬對PRRSV均具有易感性，但以孕豬（特別是懷孕90日齡后）和初生仔豬最易感。野鴨在實驗條件下對PRRSV有易感性，在感染后5～24d可以從糞便排毒但自身不發病，可能為本病的儲存宿主。目前尚未發現其他動物對本病有易感性。

傳染源：感染豬和康復帶毒豬是主要的傳染源?？祻拓i在康復后的15周內可持續排毒，甚至超過5個月還能從其喉部分離到病毒，病毒可以通過鼻、眼分泌物，胎兒及子宮甚至公豬的精液排出，感染健康豬。

傳播途徑：空氣傳播是本病的主要傳播方式。本病主要通過呼吸道或通過公豬的精液在同豬群間進行水平傳播，也可以進行母子間的垂直傳播。此外，風媒傳播在本病流行中具有重要的意義，通過氣源性感染可以使本病在3km以內的豬場中傳播。通過鼻腔人工接種細胞培養物可以導致本病。鳥類、野生動物及運輸工具也可傳播本病。

流行因素與形式：新疫區常呈地方性流行，而老疫區則多為散發性。冬季易于流行傳播。病毒在豬群中傳播極快，在2～3個月內一個豬群的95%以上均變為血清學抗體陽性，并在其體內保持16個月以上。PRRSV感染受宿主及病毒雙方的影響。由于不同分離株的毒力和致病性不同，發病的嚴重程度也不同。許多因素對病情的嚴重程度都有影響，如豬群的抵抗力、環境、管理、豬群密度以及細菌、病毒的混合感染等。該病發生后經?？梢姷牟l或繼發病原包括豬呼吸道冠狀病毒、豬流感病毒、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌。

PRRSV血清學陰性豬可通過口腔、鼻腔、肌肉內、子宮內、腹腔內接種感染，口、鼻的感染可能是自然感染的途徑。多數豬只感染后呈隱性經過，但經口、鼻感染后病毒首先在扁桃體和肺中增殖，各日齡豬只在感染12～24h出現病毒血癥，一般持續3～4周。病毒隨血液擴散至全身，在淋巴結、脾臟、胸腺、骨髓及肺中增殖。在肺泡巨噬細胞內增殖的病毒能破壞巨噬細胞，使其數量減少、功能減退，從而導致免疫抑制。妊娠中期的胎兒對PRRSV易感，此時病毒對胎盤無作用，但妊娠后期感染時卻對胎盤有影響。接種 PRRSV的公豬，有的發病，有的無任何表現，但均可通過精液排毒。

康復豬通常不能再發生感染。應用IFA法可于感染后5～7d檢出抗體并可以持續數月，但病毒中和抗體的產生較晚，在感染后4～5周或更晚才能檢出。本病的被動免疫可持續4～8周，抗體持續時間取決于從初乳中獲得抗體的最初滴度。

（五）預防及治療

由于該病傳染性強、傳播快，發病后可在豬群中迅速擴散和蔓延，給養豬業造成的損失較大，因此應嚴格執行獸醫綜合性防疫措施加以控制。

（1）通過加強檢疫措施，防止國外其他毒株傳入國內，或防止養殖場內引入陽性帶毒豬只。由于抗體產生后病豬仍然能夠較長時間帶毒，因此通過檢疫發現的陽性豬只應根據本場的流行情況采取合理的處理措施，防止將該病毒帶入陰性豬場。在向陰性豬群中引入更新種豬時，應至少隔離3周，并經PRRS抗體檢測陰性后才能夠混群。

（2）加強飼養管理和環境衛生消毒，降低飼養密度，保持豬舍干燥、通風，創造適宜的養殖環境以減少各種應激因素，并堅持全進全出制飼養。

（3）受威脅的豬群及時進行疫苗免疫接種。國外有弱毒疫苗和滅活疫苗，目前國內已研制出滅活苗，也可根據本地流行的毒株制備滅活苗，豬群接種后能產生一定程度的免疫保護作用。一般認為弱毒苗效果較佳，但只適用于受污染的豬場。后備母豬在配種前進行2次免疫，首免在配種前2個月，間隔1個月進行二免。小豬在母源抗體消失前首免；母源抗體消失后進行再次免疫。公豬和妊娠母豬不能接種弱毒疫苗。

使用弱毒苗時應注意：疫苗毒在豬體內能持續數周至數月；接種疫苗的豬能散毒感染健康豬；疫苗毒能跨越胎盤導致先天感染；有的毒保護性抗體產生較慢；有的免疫往往不產生抗體；疫苗毒持續在公豬體內可通過精液散毒。因此，沒有被污染的豬場不能使用弱毒疫苗。

滅活苗很安全，可以單獨使用或與弱毒疫苗聯合使用。

（4）通過平時的豬群檢疫，發現陽性豬群應做好隔離和消毒工作，污染群中的豬只不得留作種用，應全部育肥屠宰。有條件的種豬場可通過清群及重新建群凈化該病。

（5）發病豬群可通過合理的藥物治療計劃控制細菌繼發感染，常用的藥物包括金霉素、四環素、恩諾沙星等廣譜抗生素；國外有人報道應用阿司匹林結合抗生素對該病有一定的治療效果。

（六）實驗室檢測

依據標準：GB/T 18090—2008。

1.范圍

本規程規定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的分離鑒定、間接熒光試驗、免疫過氧化物酶單層細胞試驗和酶聯免疫吸附試驗等技術要求。本規程適用于豬繁殖與呼吸綜合征的臨床診斷、產地檢疫、口岸進出口檢疫及流行病學調查等。

2. 病毒分離鑒定

（1）病毒分離

1）病料及處理

① 采取死產或流產胎兒的腦、心、肝、脾、肺。在低溫下剪碎、研磨或用勻漿機將組織塊搗碎，用滅菌PBS或細胞培養液配成10%～20%組織懸液，加入1000IU/ml的青霉素和1000μg/ml的鏈霉素（雙抗液），于5000～10000r/min在4℃下離心20min。取上清液，經0.45μm微孔濾膜過濾，分裝，－20℃保存備用。

② 無菌采取血清和胸腔液加入雙抗液后，經0.45μm微孔濾膜過濾，分裝，－20℃保存備用。

2）細胞制備

① 豬肺泡巨噬細胞（PAM）的制備：取4～8周齡SPF仔豬，宰殺、將血放凈后立即進行無菌手術，摘取完整肺臟、氣管和喉頭。在無菌條件下，用加入1000IU/ml青霉素和1000μg/ml鏈霉素的滅菌PBS（見附錄A）進行氣管灌注。輕揉肺臟，于滅菌容器收集肺灌注液。反復灌注5～7次，將所有的灌注液混合，以1000g離心10min。棄上清，沉淀細胞用滅菌PBS懸浮，再進行離心。反復洗5～7次，最后收集沉淀細胞，用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI1640或DMEM營養液懸浮，計數。將細胞調至（3～5）×1010個/ml，分裝于細胞培養瓶，于37℃、5% CO2培養箱培養。因每批PAM對病毒敏感性不同，用前需做預備試驗。

② Marc-145、CL-2621傳代細胞的維持和培養：Marc-145和CL-2621細胞用含5%～10%胎牛血清的MEM或DMEM液培養，長成單層后用0.25%胰酶液消化細胞，用上述營養液懸浮消化的細胞，以1∶3分瓶，于37℃、5%CO2培養箱培養。

3）病料接種

① PAM或Marc-145細胞培養好后，將上清液倒掉，用預熱至37℃的Hank’s液清洗1～2次。

② 接種1）、①或1）、②處理好的病料組織液，接種量約為生長液的1/10，以使細胞單層都能接觸病料為度。

③ 在37℃下吸附60min，倒掉病料組織液，用Hank’s液清洗1～2遍。

④ 加入含2%～4%胎牛血清的MEM或DMEM細胞培養維持液。繼續在37℃下培養。

4）結果觀察

① 在顯微鏡下每天觀察細胞病變（CPE）。

② 細胞在接種后培養6～8d，如果無細胞病變，將培養物凍融2～3次，進行盲傳。盲傳3～4代。如存在PRRS病毒，PAM細胞一般在接種后24～48h內即可產生CPE，表現為細胞膨脹、溶解和細胞脫落；接種PRRS病毒的Marc-145細胞一般在接種后48h后產生CPE，主要表現為細胞呈灶狀變圓、膨脹、脫落后形成空洞。

5）病毒培養物的收集　當細胞出現50%～80% CPE時，凍融1～2次，1000g離心10min，上清分裝，－20℃保存。

（2）病毒鑒定

1）操作方法

① 將細胞培養在24孔培養板上，長成單層。將上清液倒掉，用預熱至37℃的Hank’s液清洗1～2次。

② 接種病毒細胞培養物［見（1）、5）］或處理好的病料組織液［見（1）、1）、①或（1）、1）、②］，每孔約50μl。37℃下吸附60min，倒掉病料組織液，用Hank’s液清洗1～2遍，加入維持液［見（1）、3）、④）］，繼續在37℃下培養。

③ 出現早期CPE后，收集培養板，將孔中液體甩出，用丙酮或無水乙醇室溫固定15min。

④ 去掉固定劑，風干后，用PBS（見附錄A）沖洗兩次，每次3min。

⑤ 分別加入PRRSV標準陰性、陽性血清（由標準起草單位提供，按說明書使用），每孔100μl，37℃反應60min。

⑥ 取出，去掉血清液，用PBS沖洗4次，每次3min，甩干。

⑦ 加入熒光素標記兔抗豬IgG［見3、（1）、2）］，每孔50μl，37℃反應40min。

⑧ 取出，沖洗同⑥，置于熒光顯微鏡下觀察。

2）判定　當滴加陰性血清孔的細胞質中無特異性草綠色熒光時，滴加陽性血清或單克隆抗體孔的細胞質中有特異性草綠色熒光，則該孔被檢病料中含有PRRS病毒，否則無PRRS病毒存在。

3. 間接熒光抗體試驗（IFA）

（1）試驗材料

1）磷酸鹽緩沖液（PBS），配制方法見附錄A。

2）96孔抗原板（奇數列為正常細胞抗原孔，標為N孔。偶數列為PRRSV抗原孔，標為P孔），標準陰性血清、陽性血清、熒光素標記兔抗豬IgG，由農業農村部獸醫診斷中心提供，按說明書使用。

（2）操作方法

1）將96孔抗原板從冷藏箱中取出，室溫下放置10min。

2）將標準陰性血清、陽性血清、待檢血清分別用PBS（見附錄A）作1∶20稀釋。

3）將稀釋好的標準陰性血清、陽性血清、待檢血清分別加入96孔板相鄰的一個N孔、P孔中，每孔100μl。見表1-11。

4）37℃放置60min。

5）取出96孔板將孔中血清甩出。

6）每孔加入300μl PBS，室溫放置3min，甩出孔中PBS。重復3次，最后一次在吸水紙上拍干。

7）用PBS將熒光素標記兔抗豬IgG［見（1）、2）］作1∶250稀釋，加入各反應孔中，每孔50μl。

8）37℃放置40min。

9）取出96孔板將孔中液體甩出。

10）重復操作6）。

11）倒置于熒光顯微鏡下觀察。

（3）結果判定

1）標準陰性血清的N孔、P孔細胞質內均無特異性熒光，標準陽性血清的N孔細胞質內無特異性熒光，而P孔細胞質中有明亮草綠色熒光，該試驗成立，否則應重做。

2）被檢血清的N孔、P孔細胞質內均無特異性熒光，則判為陰性；被檢血清的N孔細胞質內無特異性熒光，而P孔細胞質中有明亮草綠色熒光，則判為陽性。

4. 免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA）

（1）試驗材料

1）96孔抗原板（奇數列為正常細胞抗原孔，標為N孔。偶數列為PRRSV抗原孔，標為P孔），標準陰性血清、陽性血清、辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG，由農業農村部獸醫診斷中心提供，按說明書使用。

2）稀釋液、洗滌液、底物溶液，配制方法見附錄B。

（2）操作方法

1）將96孔板從冷藏箱中取出，室溫下放置10min。

2）將標準陰性血清、陽性血清［見1）］、待檢血清用稀釋液（見附錄B）作1∶20稀釋。

3）將稀釋好的標準陰性血清、陽性血清、待檢血清分別加入96孔板相鄰的一個N孔、P孔中，每孔100μl。

4）37℃放置60min。

5）取出96孔板將孔中血清甩出。

6）每孔加入300μl洗滌液（見附錄B），室溫放置3min，甩出孔中液體。重復3次，最后一次在吸水紙上拍干。

7）用稀釋液將酶標記抗體［見（1）、1）］作1∶5000稀釋，加入各反應孔中，每孔50μl。

8）37℃放置40min。

9）取出96孔板將孔中液體甩出。

10）重復操作6）。

11）每孔加入50μl底物溶液（見附錄B），室溫下放置15min。

12）將孔中液體甩出，用洗滌液洗滌一次。

13）倒置于顯微鏡下觀察。

（3）結果判定

1）標準陰性血清的N孔、P孔均無特異性顯色，標準陽性血清的N孔無特異性顯色，而P孔細胞質呈深棕紅色，該試驗成立，否則應重做。

2）被檢血清的N孔、P孔均無特異性顯色，則判為陰性；被檢血清的N孔無特異性顯色，而P孔細胞質呈深棕紅色，則判為陽性。

5.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

（1）試驗材料

1）PRRS病毒抗原，正常Marc-145細胞對照抗原，辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG，標準陰、陽性血清，96孔酶標板，由農業農村部獸醫診斷中心提供，按說明書使用。

2）包被緩沖液、洗滌液、封閉液（稀釋液）、底物溶液、終止液，配制方法見附錄C。

（2）操作方法

1）將病毒抗原、正常Marc-145細胞抗原用包被液（見附錄C）作1∶800稀釋（濃度約為1.5μg/ml），酶標板的奇數孔包被稀釋好的病毒抗原（標記為P孔）、偶數孔包被細胞抗原（標記為N孔），每孔100μl，置4℃冰箱24h。

2）取出反應板將孔中液體甩出。

3）每孔加入300μl洗滌液（見附錄C），室溫放置3min，甩出孔中液體。重復3次，最后一次在吸水紙上拍干。

4）每孔加入封閉液（見附錄C）200μl，37℃放置1h。

5）重復2）和3）操作。

6）將被檢血清用稀釋液（見附錄C）作1∶40稀釋。

7）將標準陽性血清、標準陰性血清（不作稀釋）［見（1）、1）］分別加入兩個相鄰的P孔和N孔，每孔100μl。將稀釋的被檢血清分別加入1個相鄰的P孔和N孔，每孔100μl。

8）37℃放置1.5h。

9）取出反應板將孔中液體甩出，用吸水紙拍干。

10）每孔加入300μl洗滌液，室溫放置3min，甩出孔中液體。重復5次，最后一次在吸水紙上拍干。

11）每孔加入100μl酶標抗體。

12）重復8）、9）、10）操作。

13）每孔加入100μl底物溶液（見附錄C），室溫（25℃）靜置15min。

14）每孔加入100μl終止液（見附錄C）。

15）用酶聯檢測儀于450nm波長測定各孔吸光度（OD450）。

（3）結果判定

1）分別計算標準陽性血清兩個P孔的平均OD450值（記為P）和兩個N孔的平均OD450值（記為N），計算公式為：［OD450（1）+OD450（2）］/2。

2）計算各被檢血清的S/P值：

S/P=（樣品P孔OD450值－樣品N孔OD450值）/（P－N）

3）陽性血清P孔減去陰性血清P孔的OD450值≥0.150，且標準陰性血清S/P值小于0.4，試驗成立。如被檢血清S/P值大于（等于）0.4，該血清為PRRSV抗體陽性；如被檢血清S/P值小于0.4，該血清為PRRSV抗體陰性。

附錄A

0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

將下列試劑（分析純）加入約500ml的蒸餾水中溶解，然后用蒸餾水定容至1000ml。

氯化鈉　　　　　　　　　　　　　　 　8.0g

氯化鉀　　　　　　　　　　　　　 　　0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）　　　　2.89g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）　　　　　　　   0.2g

附錄B

溶液的配制

B.1　稀釋液的配制

取5ml滅活小牛血清、50μl吐溫-80加入100ml容量瓶中，用0.02mol/L、pH7.4磷酸鹽緩沖液（見附錄A）定容至100ml。

B.2　洗滌液的配制

取50μl吐溫-80，加入100ml 0.02mol/L、pH7.4磷酸鹽緩沖液（見附錄A）中。

B.3　底物溶液的配制

甲液：N，N-二甲基甲酰胺（DMF） 　　　　20ml

3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）　　                　　80mg

混勻。

乙液：冰醋酸　　                                         　　0.9ml

乙酸鈉　　                                                     　　2.9g

加蒸餾水至1000ml。

上述化學試劑均為分析純。

底物溶液：甲液　　                                     　　1.0ml

乙液　　　                                                         　19ml

30%過氧化氫　　　                                         　10μl

混勻。

附錄C

溶液的配制

C.1　包被緩沖液的配制

0.05mol/L、pH9.6碳酸鹽緩沖液：

將下列試劑（分析純）加入1000ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容至1000ml。

碳酸鈉（Na2CO3）　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氫鈉（NaHCO3）　　　　　　　　　　　2.93g

C.2　洗滌液的配制

取50μl吐溫-20加入100ml 0.02mol/L、pH7.4磷酸鹽緩沖液（見附錄A）中，混勻。

C.3　封閉液（稀釋液）的配制

取10ml滅活犢牛血清、50μl吐溫-20加入100ml容量瓶中，用0.02mol/L、pH7.4磷酸鹽緩沖液（見附錄A）定容至100ml。

C.4　底物溶液的配制

TMB儲存液：三甲基聯苯胺（TMB）　　　　   10mg

N，N-二甲基甲亞砜（DMSO）　　　　　　　1.0ml

混勻。

0.1mol/L檸檬酸緩沖液：檸檬酸鈉　　　　     　27.22g

去離子水　　　                                               　　200ml

混勻，用飽和檸檬酸水溶液調pH至5.6，加去離子水至2000ml。

上述化學試劑均為分析純。

底物溶液：TMB儲存液　　　　　　　　　　   100μl

0.1mol/L檸檬酸緩沖液　　　　　　                　100ml

1%過氧化氫　　　　　　　　　　             　　25μl

混勻。該溶液現配現用。

C.5　終止液的配制

2mol/L硫酸溶液：于500ml去離子水中，在不斷攪拌下緩慢加入76ml濃硫酸（98%），混勻，冷卻。