二、非洲豬瘟

非洲豬瘟（African Swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）感染家豬和各種野豬（如非洲野豬、歐洲野豬等）而引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，該病也是我國重點防范的一類動物病。其特征是發病過程短，最急性和急性感染死亡率高達100%，臨床表現為發熱（達40～42℃），心跳加快，呼吸困難，部分咳嗽，眼、鼻有漿液性或黏液性膿性分泌物，皮膚發紺，淋巴結、腎、胃腸黏膜明顯出血，非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟癥狀相似，只能依靠實驗室監測確診。

本病自1921年在肯尼亞首次被報道，一直存在于撒哈拉以南的非洲國家，1957年先后流行至西歐和拉美國家，多數被及時撲滅，但在葡萄牙、西班牙西南部和意大利的撒丁島仍有流行。

2007年以來，非洲豬瘟在全球多個國家發生、擴散、流行，特別是俄羅斯及其周邊地區。2017年3月，俄羅斯遠東地區伊爾庫茨克州發生非洲豬瘟疫情，疫情發生地距離我國較近，僅為1000km左右；另外，我國是養豬及豬肉消費大國，生豬出欄量、存欄量以及豬肉消費量均位于全球首位，每年種豬及豬肉制品進口總量巨大，與多個國家貿易頻繁；而且，我國與其他國家的旅客往來頻繁，旅客攜帶的商品數量多、種類雜。因此，非洲豬瘟傳入我國的風險日益加大。一旦傳入，其帶來的直接和間接損失將不可估量。對此，2017 年 4 月 12 日，我國農業農村部發布了關于進一步加強非洲豬瘟風險防范工作的緊急通知。

2020年2月6日，希臘農業發展和食品部宣布，該國東北部塞雷斯地區一家小型養豬場發生非洲豬瘟，這是希臘報告的首起非洲豬瘟疫情。

2018年8月3日，中國確診首例非洲豬瘟。2018年12月20日，非洲豬瘟當選為2018年度社會生活類十大流行語。韓國農林畜產食品部2019年9月17日發布消息說，京畿道坡州市一家養豬場16日下午報告5頭豬死亡，檢疫部門17日早晨6時30分確認死亡病豬感染非洲豬瘟。

（一）病毒特征

非洲豬瘟病毒是非洲豬瘟科非洲豬瘟病毒屬的重要成員，病毒有些特性類似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直徑為175～215nm，呈20面體對稱，有囊膜?；蚪M為雙股線狀DNA，大小170～190kb。在豬體內，非洲豬瘟病毒可在幾種類型的細胞質中，尤其是網狀內皮細胞和單核巨噬細胞中復制。該病毒可在鈍緣蜱中增殖，并使其成為主要的傳播媒介。

本病毒在被感染豬之血液、組織液、內臟，及其他排泄物中證實，低溫暗室內存在血液中之病毒可生存六年，室溫中可活數周，加熱被病毒感染的血液55℃ 30min或60℃ 10min，病毒將被破壞，許多脂溶劑和消毒劑可以將其破壞。

（二）臨床癥狀

自然感染的潛伏期差異很大，短的4～8d，長的15～19d；人工感染為2～5d。潛伏期的長短與接毒劑量和接毒途徑有關。根據病毒的毒力和感染途徑不同，ASF可表現為最急性型、急性型和亞急性型或慢性型等不同的類型。

最急性型：由非洲古典型毒株引起，突然體溫升高，未見任何癥狀和病變而死亡。

急性型：流行開始多為急性型，以食欲廢絕、高熱（部分病豬、幼齡豬多為間歇熱）、白細胞減少（下降至正常的40%～50%）、血小板及淋巴細胞明顯減少、內臟器官出血、皮膚出血或發紺（尤其是耳、鼻、尾、外陰和腹部等無毛或少毛處）和病死率高為特征。體溫升高至41～42℃，稽留4d，當體溫下降或死前1～2d病豬才出現臨診癥狀，表現精神沉郁、厭食，喜臥，呼吸、心跳加快，腹瀉、糞便帶血，行走時后軀無力，眼、鼻有漿液性或黏液性分泌物，鼻端、耳、腹部等處的皮膚發紺。懷孕母豬可發生流產。病程6～13d，長的達20多天，病死率95%左右，幸存者將終生帶毒。

亞急性型或慢性型：由歐洲新型毒株引起，或發生在已接種過弱毒疫苗的豬。癥狀較輕，病程較長，發病后15～45d死亡，病死率30%～70%。亞急性型表現為暫時性血小板和白細胞減少，并可見大量出血灶。慢性型表現以不規則波浪熱、呼吸道疾病、流產和低病死率為特征，只呈現慢性肺炎癥狀，咳嗽、氣喘、消瘦、生長停滯。有些慢性型還可見皮膚壞死、潰瘍、斑塊，耳、關節、尾、鼻、唇可見壞死性潰瘍脫落；關節呈無痛性腫脹。病程可持續數月，病死率低。

（三）病理變化

在耳、鼻、腋下、腹、會陰、尾、腳無毛部分呈界線明顯的紫色斑，耳朵紫斑部分常腫脹，中心深暗色分散性出血，邊緣褪色，尤其在腿及腹壁皮膚肉眼可見到。顯微鏡所見，于真皮內小血管，尤其在乳頭狀真皮呈嚴重的充血和肉眼可見的紫色斑，血管內發生纖維性血栓，血管周圍有許多嗜酸球，耳朵紫斑部分上皮之基層組織內，可見到血管血栓性小壞死現象。切開胸腹腔，心包、胸膜、腹膜上有許多澄清、黃或帶血色液體，尤其在腹部內臟或腸系膜上表部分，小血管受到影響更甚。于內臟漿液膜可見到棕色轉變成淺紅色之瘀斑，即所謂的麩斑（BranFlecks），尤其于小腸更多，直腸壁深處有暗色出血現象，腎臟有彌漫性出血情形，胸膜下水腫特別明顯，及心包出血。

（1）在淋巴結有豬瘟罕見的某種程度的出血現象，上表或切面似血腫之結節較淋巴結多。

（2）脾臟腫大，髓質腫脹區呈深紫黑色，切面突起，淋巴濾泡小而少，有7%豬脾臟發生小而暗紅色突起的三角形栓塞情形。

（3）循環系統　心包液特別多，少數病例中呈混濁且含有纖維蛋白，但多數心包下及次心內膜充血。

（4）呼吸系統　喉、會厭部有瘀斑充血及擴散性出血，比豬瘟更甚，瘀斑有的發生于氣管前三分之一處；鏡檢下，腸有充血而沒有出血病灶，肺泡則呈現出血現象，淋巴球呈破裂狀。

（5）肝　肉眼檢查顯正常，呈血暗色或斑點大多異常，近膽部分組織有充血及水腫現象，小葉間結締組織有淋巴細胞、漿細胞及間質細胞浸潤，同時淋巴球的核破裂為其特征。

（四）流行病學特征

ASFV可經過口和上呼吸道系統進入豬體，在鼻咽部或扁桃體發生感染，病毒迅速蔓延到下頜淋巴結，通過淋巴和血液遍布全身。強毒感染時細胞變化很快，在出現明顯的刺激反應前，細胞都已死亡。弱毒感染時，刺激反應很容易觀察到，細胞核變大，普遍發生有絲分裂。發病率通常在40%～85%之間，死亡率因感染的毒株不同而有所差異。高致病性毒株死亡率可高達90%～100%；中等致病性毒株在成年動物的死亡率在20%～40%之間，在幼年動物的死亡率在70%～80%之間；低致病性毒株死亡率在10%～30%之間。

易感動物：豬與野豬對本病毒都系自然易感性，各品種及各不同年齡之豬群同樣是易感性。

傳播媒介：非洲和西班牙半島有幾種軟蜱是ASFV的儲藏宿主和媒介。美洲等地分布廣泛的很多其他蜱種也可傳播ASFV。一般認為，ASFV傳入無病地區都與來自國際機場和港口的未經煮過的感染豬制品或殘羹喂豬有關，或由于接觸了感染家豬的污染物，胎兒、糞便、病豬組織，并喂了污染飼料而發生。

通常非洲豬瘟跨國境傳入的途徑主要有四類：一是生豬及其產品國際貿易和走私，二是國際旅客攜帶的豬肉及其產品，三是國際運輸工具上的餐廚剩余物，四是野豬遷徙。

中國已查明疫源的68起家豬疫情，傳播途徑主要有三種：一是生豬及其產品跨區域調運，約占全部疫情19%；二是餐廚剩余物喂豬，約占全部疫情34%；三是人員與車輛帶毒傳播，這是當前疫情擴散的最主要方式，約占全部疫情46%。

（五）預防及治療

目前針對本病無特效藥物，無疫苗預防，但高溫、消毒劑可以有效殺滅病毒，所以做好養殖場生物安全防護是防控非洲豬瘟的關鍵。

一是嚴格控制人員、車輛和易感動物進入養殖場；進出養殖場及其生產區的人員、車輛、物品要嚴格落實消毒等措施。

二是盡可能封閉飼養生豬，采取隔離防護措施，盡量避免與野豬、鈍緣軟蜱接觸。

三是嚴禁使用泔水或餐余垃圾飼喂生豬。

四是積極配合當地動物疫病預防控制機構開展疫病監測排查，特別是發生豬瘟疫苗免疫失敗、不明原因死亡等現象，應及時上報當地獸醫部門。

（六）實驗室檢測

依據標準：GB/T 18648—2002。

1.PCR試驗

（1）材料準備

1）樣品DNA制備方法見附錄A（標準的附錄）。

2）電泳緩沖液的配制方法見附錄B。

3）標準ASFV-BA71株DNA、引物1、引物2、1.25mmol/L dNTP和載樣緩沖液。

4）Taq DNA聚合酶、100堿基對（bp）Ladder（標準DNA Marker）、10倍濃度的聚合酶鏈式反應擴增緩沖液。

5）自動DNA熱循環儀。

（2）操作方法

1）將下列試劑按要求量加入0.75ml的離心管中：滅菌蒸餾水（24.5μl）；10倍濃縮的PCR擴增緩沖液（5μl）；1.25mmol/L dNTP貯存液（8μl）；引物1（1μl）；引物2（1μl）；樣品DNA溶液（10μl）（見附錄A）；Taq DNA聚合酶（0.5μl）。

2）設定兩個對照，陽性對照為標準的ASFV-BA17株10μl，DNA含量為10fg；陰性對照為不含DNA的滅菌蒸餾水10μl。

3）取50μl礦物油覆蓋在混合液上。

4）將加有樣品或對照混合物的Eppendorf管放入自動DNA熱循環儀中，按下列程序和條件進行擴增：94℃5min，50℃2min，72℃3min循環一次；94℃1min，50℃2min，72℃3min循環30次；94℃1min，50℃2min，72℃10min循環1次，最后置于4℃保存。

5）上述步驟完成后，從礦物油下取出每種反應混合物20μl，放入另一只干凈的Eppendorf管中并加2μl載樣緩沖液。

6）將所有樣品按編號加入對應的2%瓊脂糖凝膠（見附錄B）板的各孔中，其中一孔加標準陽性DNA樣品，在凝膠的孔中加入標準分子量DNA Marker。

7）將凝膠在150V恒定電壓下電泳2h。

8）結果判定：用紫外光源檢查凝膠。如為陽性樣品，則出現一條孤立的、與陽性對照PCR產物同步遷移的帶，分子量265bp。陰性對照和非ASF感染豬無265bp帶。

2.酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

（1）試劑　標準抗原

（2）0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（配制方法見附錄C），底物溶液（見附錄C）。

（3）操作方法

1）取ELISA微量滴定板，每孔加入0.1mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液稀釋至工作滴定的抗原溶液50μl，封板后4℃作用16h（過夜）。

2）用pH7.2的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗板3洗，每次2min。

3）用含0.05%吐溫-20的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，將待檢血清及陽性和陰性對照血清做30倍稀釋，將稀釋的血清加入用抗原包被的孔中，每孔中加50μl。

4）將滴定板放在微量振蕩器上，37℃作用30min，然后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗板3次。

5）每孔加入50μl用含0.05%吐溫-20的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液配制的免疫球蛋白G（IgG）-抗豬過氧化物酶結合物溶液。

6）將滴定板放入振蕩器，37℃作用1h，然后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗3次。

7）每孔加50μl底物溶液。

8）室溫下顯色15min。

9）每孔加50μl、1mol/L的硫酸終止反應。

10）判定結果：陽性血清可以用肉眼辨認，為清亮的黃色，用ELISA檢測儀檢測每一孔的光吸收值，檢測波長為492nm。任何一種血清，只要它的吸收值超過同一塊板中陰性對照血清平均吸收值的兩倍，就可判為陽性。

附錄A

（標準的附錄）

樣品DNA的制備

A.1　將組織放入有滅菌沙子的研缽中研磨成糊狀，加5～10ml含1%牛血清0.1mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液，對研碎的組織作10倍稀釋，制作成組織懸液。

A.2　全血樣品可用含1%牛血清0.1mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液作1∶1000倍稀釋，制成懸液。

A.3　如為污染物的樣品（如糞便等），用含0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液作10倍稀釋，制成懸液。

A.4　500r/min離心5min。

A.5　取500μl加入有螺旋帽的離心管中，煮沸10min。

A.6　用小型高速離心機以13000r/min離心5min。

A.7　取10μl上清液用作PCR試驗的樣品DNA。

附錄B

（標準的附錄）

電泳緩沖液的制備

B.1　瓊脂糖凝膠的TAE緩沖液（50倍）

三羥甲基氨基甲烷堿　　　　　　　　　               　　 242g

冰乙酸　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　　57.1ml

0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）　　　　　100ml

蒸餾水　　　　　　　　　　　　　　　　　　    　　700ml

待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000ml，置4℃冰箱備用，如配制2%的瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍成TAE緩沖液。

B.2　2%瓊脂糖凝膠板的制備

取1g瓊脂糖加入至50ml TAE緩沖液中，在微波爐中充分溶解后，加入最終濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠，用TAE定容至50ml，冷卻至60℃后，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足量電泳緩沖液。

附錄C

（標準的附錄）

酶聯免疫吸附試驗溶液的配制

C.1　0.1mol/L磷酸鹽緩沖液的配制

將下列試劑按次序加入2000ml體積的容器中。

氯化鈉　　　　　　　　　　80.06g

氯化鉀　　　　　　　　　　20.02g

磷酸氫二鈉　　　　　　　　11.50g

磷酸二氫鉀　　　　　　　　2.01g

雙蒸餾水　　　　　　　　　800ml

混勻，用pH試紙調pH至7.2，用雙蒸水定容至1000ml。

C.2　底物溶液

C.2.1　0.1mol/L pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液

下列試劑按次序加入1000ml體積的容器中，充分溶解即成。

磷酸氫二鈉　　　　　　　　　　71.6g

檸檬酸　　　　　　　　　　　　19.2g

蒸餾水　　　　　　　　　　　　1000ml

C.2.2　底物溶液

0.1mol/L pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液　　　　   　100ml

鄰苯二胺　　　　　　　　　　　　　　　　　　　40mg

30%過氧化氫　　　　　　　　　　　　　　　　　0.15ml

此液對光敏感，應避免強光直射。現配現用。