第二節(jié)　豬　病

一、豬瘟

豬瘟俗稱爛腸瘟，美國(guó)稱豬霍亂，英國(guó)稱為豬熱病，是由豬瘟病毒引起豬的急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。根據(jù)臨診癥狀可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、溫和型、繁殖障礙型、神經(jīng)型7種。最急性型特征是發(fā)病急、高熱稽留和全身性小點(diǎn)出血，脾梗死；急性型呈敗血性變化，實(shí)質(zhì)器官出血、壞死；亞急性型和慢性型不但有不同程度的敗血性變化，且還發(fā)生纖維素性、壞死性腸炎；繁殖障礙型、溫和型、神經(jīng)型引起母豬帶毒綜合征，導(dǎo)致孕豬流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔豬先天性頭部震顫和四肢顫抖等。本病是豬的一種重要傳染病，OIE將其列入A類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。

目前，本病在亞洲、非洲、中南美洲仍然不斷發(fā)生，在美國(guó)、加拿大、澳大利亞及歐洲若干國(guó)家已經(jīng)被消滅，但在歐洲某些國(guó)家近10年來仍有發(fā)病的報(bào)道。

（一）病毒特征

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；美國(guó)稱為 Hog cholera virus，HCV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），是世界范圍內(nèi)最重要的豬病病毒。基因組為單鏈正股RNA，病毒粒子呈球形，直徑為38～50mm，具有脂蛋白囊膜和20面體立體對(duì)稱的核衣殼。目前認(rèn)為豬瘟病毒僅有一個(gè)血清型，但病毒株的毒力有強(qiáng)、中、弱之分。豬瘟病毒與牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVD）的基因組序列有高度的同源性，抗原關(guān)系密切，既有血清學(xué)交叉反應(yīng)，又有交叉保護(hù)作用，豬能自然感染這種病毒。用BVDV抗血清與豬瘟病毒株作中和試驗(yàn)，可將豬瘟病毒分為H群（強(qiáng)毒株）和B群（弱毒株）。豬瘟野毒株的毒力變化很大，H群不能被BVDV抗血清中和，可引發(fā)急性發(fā)病和高病死率；B群能被BVDV抗血清中和，一般引起亞急性或慢性傳染。

豬瘟病毒分布于病豬全身體液和各種組織內(nèi)，以淋巴結(jié)、脾和血液中含量最高，每克含數(shù)百萬個(gè)豬最小感染量。病豬的尿、糞便等排泄物和分泌物都含有大量病毒，發(fā)熱期含病毒量最高。豬瘟病毒對(duì)環(huán)境的抵抗力不強(qiáng)，溫度越高越敏感，但存活的時(shí)間取決于含毒的介質(zhì)。正常條件下，76℃經(jīng)1h可使病毒失去感染力；在干燥條件下，病毒容易死亡，被污染的環(huán)境在干燥和陽光直射的條件下，經(jīng)1～4周可失去傳染性。豬瘟病毒在冷藏豬肉中可存活幾個(gè)月，在冰凍豬肉中存活時(shí)間可達(dá)數(shù)年之久，在濃度高達(dá)174%的鹽腌制豬腿肉中尚能存活102d，這些具有重要的流行病學(xué)意義。對(duì)乙醚、氯仿、β-丙烯內(nèi)酯和堿性消毒藥物敏感，如2%氫氧化鈉、生石灰等。1%的福爾馬林、碳酸鈉（4%無水或10%結(jié)晶碳酸鈉+0.1%去污劑）、離子和無離子去污劑等能將其滅活。

（二）臨床癥狀

本病的潛伏期一般5～7d，最短2d，長(zhǎng)的21d。根據(jù)病程長(zhǎng)短和臨診癥狀可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、繁殖障礙型、溫和型和神經(jīng)型。

最急性型：多見于流行初期，主要表現(xiàn)為突然發(fā)病，高熱稽留，體溫可達(dá)41℃以上，全身痙攣，四肢抽搐，皮膚和可視黏膜發(fā)紺、有出血點(diǎn)，倒臥地上很快死亡，病程1～5d。

急性型：體溫升高到41～42℃，稽留不退，精神沉郁，行動(dòng)緩慢、低頭垂尾、嗜睡、發(fā)抖，行走時(shí)拱背、不食。病豬早期有急性結(jié)膜炎，眼結(jié)膜潮紅，眼角有多量膿性分泌物，甚至使眼瞼粘連；口腔黏膜發(fā)紺、有出血點(diǎn)。公豬包皮內(nèi)積尿，用手可擠出渾濁惡臭尿液。病初出現(xiàn)便秘，排出球狀并帶有血絲或偽膜的糞球，隨病程的發(fā)展呈現(xiàn)腹瀉或腹瀉便秘交替出現(xiàn)。皮膚初期潮紅充血，隨后在耳、頸、腹部、四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)出血點(diǎn)和出血斑（圖1-41）。瀕死前，體溫降至常溫以下，病程一般1～2周。

亞急性型：癥狀與急性型相似，但較緩和，病程一般3～4周。不死亡者常轉(zhuǎn)為慢性型。

慢性型：主要表現(xiàn)消瘦，全身衰弱，體溫時(shí)高時(shí)低，便秘腹交替，被毛枯燥，行走無力，食欲不佳，貧血。有的病豬在耳端、尾尖及四肢皮膚上有紫斑或壞死，病程1個(gè)月以上。病豬很難恢復(fù)，不死者長(zhǎng)期發(fā)育不良，形成僵豬。

繁殖障礙型（母豬帶毒綜合征）：有的孕豬感染后可不發(fā)病但長(zhǎng)期帶毒，并能通過胎盤傳給胎兒。有的孕豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔豬先天性頭部、四肢顫抖，一般數(shù)天后死亡，存活的仔豬可出現(xiàn)長(zhǎng)期病毒血癥。

溫和型：癥狀較輕且不典型，有的耳部皮膚壞死，俗稱干耳朵；有的尾部壞死，俗稱干尾巴；有的四肢末端壞死，俗稱紫斑蹄。病豬發(fā)育停滯，后期四肢癱瘓，不能站立，部分病豬跗關(guān)節(jié)腫大。病程一般半個(gè)月以上，有的經(jīng)2～3個(gè)月后才能逐漸康復(fù)。

神經(jīng)型：多見于幼豬。病豬表現(xiàn)為全身痙攣或不能站立，或盲目奔跑，或倒地痙攣，常在短期內(nèi)死亡。

（三）病理變化

根據(jù)病程長(zhǎng)短和繼發(fā)感染情況，病理變化有所不同。

最急性型：多無明顯病理變化，一般僅見到黏膜、漿膜和內(nèi)臟有少數(shù)點(diǎn)狀出血，淋巴結(jié)輕度腫脹和出血。

急性型：主要表現(xiàn)為典型的敗血癥病變，全身皮膚、漿膜和內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官有不同程度的出血變化，以淋巴結(jié)、腎臟、膀胱、喉頭、會(huì)厭軟骨和大腸黏膜的出血最為常見。皮膚出血主要見于耳根、腹下和四肢內(nèi)側(cè)。心肌、肺臟、輸尿管等處有數(shù)量不等的出血點(diǎn)或出血斑。兩側(cè)扁桃體壞死。全身淋巴結(jié)腫大、多汁、充血和出血，呈暗紅色，切面呈彌漫性出血或周邊出血，中心部保持有灰白色區(qū)域，呈紅白相間的大理石狀花紋；脾不腫大，色澤基本正常，邊緣及尖端有大小不一、紫紅色、隆起的出血性或貧血性梗死灶，呈結(jié)節(jié)狀（圖1-42）。這是豬瘟最有診斷意義的病變。

腎臟色澤變淡，呈土黃色，皮質(zhì)部有針尖大到小米粒大數(shù)量不等的出血點(diǎn)，少者數(shù)個(gè)，多者密布，髓質(zhì)出血比較少見，仔豬先天感染表現(xiàn)“有溝腎”。胃漿膜、黏膜出血，小腸有卡他性炎癥，回腸、盲腸（特別是回盲瓣處）和結(jié)腸常有特征性的壞死、潰爛，形成紐扣狀潰瘍（圖1-43）。

膀胱出血明顯，膀胱黏膜上密布有針頭大小的出血點(diǎn)。

亞急性型：全身出血性癥狀較急性型輕，但壞死性腸炎和肺炎變化明顯。

慢性型：主要變化為壞死性腸炎，全身出血變化不明顯。特征性病變是在盲腸、回盲口及結(jié)腸黏膜上形成紐扣狀潰瘍，呈同心輪層狀纖維素性壞死，黑褐色突出于腸黏膜表面。肋骨病變也很常見，表現(xiàn)為突然鈣化，從肋骨、肋軟骨聯(lián)合到肋骨近端有半硬的骨結(jié)構(gòu)形成的明顯橫切線。繁殖障礙型、溫和型和神經(jīng)型的剖檢病變特征不明顯。

（四）流行病學(xué)特征

易感動(dòng)物：本病在自然條件下只感染豬。不同品種、年齡、性別的豬均可感染發(fā)病。

傳染源：病豬和隱性感染的帶毒豬為主要傳染源。豬感染豬瘟病毒后1～2d，未出現(xiàn)臨診癥狀前即可向外界排毒；病豬痊愈后仍可帶毒和排毒5～6周；病豬的排泄物、分泌物和屠宰時(shí)的血、肉、內(nèi)臟和廢料、廢水都含有大量病毒；被豬瘟病毒污染的飼料、飲水、用具物品、人員、環(huán)境等也是傳染源。隨意拋棄病死豬的肉尸、臟器或者病豬、隱性感染豬及其產(chǎn)品處理不當(dāng)均可傳播本病。帶毒母豬產(chǎn)出的仔豬可持續(xù)排毒，也可成為傳染源。豬場(chǎng)內(nèi)的蚯蚓和豬體內(nèi)的肺絲蟲是自然界的保毒者，應(yīng)引起重視。

傳播途徑：豬瘟主要通過直接或間接接觸方式傳播，一般經(jīng)消化道傳染，也可經(jīng)呼吸道、眼結(jié)膜感染或通過損傷的皮膚、閹割時(shí)的創(chuàng)口感染。非易感動(dòng)物和人可能是病毒的機(jī)械傳遞者。

妊娠母豬感染豬瘟后，病毒可經(jīng)胎盤垂直感染胎兒，產(chǎn)出弱仔、死胎、木乃伊胎等，分娩時(shí)排出大量病毒。如果這種先天感染的仔豬在出生時(shí)正常并存活幾個(gè)月，它們便成為病毒散布的持續(xù)感染來源，這種持續(xù)的先天性感染對(duì)豬瘟的流行病學(xué)研究具有極其重要的意義，試驗(yàn)證明，母豬在妊娠40日齡感染則發(fā)生死胎、木乃伊胎和流產(chǎn)；70日齡感染者所生的仔豬45%帶毒，出生后出現(xiàn)先天性震顫，多于1周左右死亡；90日齡感染者所生的仔豬可存活2～11個(gè)月，此種豬無明顯癥狀但終身帶毒、排毒，為豬瘟病毒的主要儲(chǔ)存宿主，有這些豬的存在即可形成豬瘟常發(fā)地區(qū)或豬場(chǎng)。

流行因素及形式：本病一年四季均可發(fā)生，一般以深秋、冬季、早春較為嚴(yán)重。急性暴發(fā)時(shí)，先是幾頭豬發(fā)病，突然死亡，繼而病豬數(shù)量不斷增加，多數(shù)呈急性經(jīng)過并死亡，3周后逐漸趨于低潮，病豬多呈亞急性型或慢性型，如無繼發(fā)感染，少數(shù)慢性病豬在1個(gè)月左右康復(fù)或死亡，流行終止。

近年來豬瘟流行發(fā)生了變化，出現(xiàn)非典型豬瘟、溫和型豬瘟，均以散發(fā)性流行。發(fā)病特點(diǎn)不突出，臨診癥狀較輕或不明顯，病死率低，無特征性病理變化，必須依賴實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診。

（五）預(yù)防及治療

本病堅(jiān)持“預(yù)防為主”，采取綜合性防控措施。

（1）免疫接種　這是當(dāng)前防控豬瘟的主要手段。一般情況下，用細(xì)胞苗免疫時(shí)，仔豬25日齡左右進(jìn)行第1次免疫接種，60日齡再進(jìn)行第2次免疫接種。豬瘟流行嚴(yán)重的豬場(chǎng)可采取超前免疫的辦法，即在仔豬剛出生后未吃初乳前，接種豬瘟疫苗1～2頭份，注苗1～2h后再自由哺乳，于70日齡進(jìn)行第2次免疫。實(shí)施超前免疫時(shí)，母豬分娩過程中必須有專人守護(hù)，隨生隨免，吃到初乳后再免疫接種將失去效果。超前免疫中個(gè)別仔豬會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)（全身出現(xiàn)青紫色，呼吸急速，嘔吐，站立不穩(wěn)，隨后倒地，呈昏迷狀態(tài)），可注射地塞米松酸鈉液或苯海拉明、腎上腺素等進(jìn)行搶救。

在上述免疫的基礎(chǔ)上，種豬每半年加強(qiáng)免疫一次，種母豬應(yīng)于配種前25d免疫一次，使之產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，避免妊娠期間感染豬瘟。

為確保免疫效果，可適當(dāng)加大免疫劑量或改豬瘟細(xì)胞苗為兔化豬瘟組織苗。根據(jù)多數(shù)學(xué)者實(shí)踐中應(yīng)用的情況，適當(dāng)提高免疫劑量可提高抗體水平。以下劑量供參考：種豬4～5頭份，仔豬2～3頭份，仔豬母源抗體在1∶32以上時(shí)（25日齡左右）4頭份較好。曾經(jīng)出現(xiàn)免疫失敗的豬場(chǎng)，尤其是有繁殖障礙型、溫和型和神經(jīng)型豬瘟存在的情況下，可選用豬瘟脾淋組織疫苗進(jìn)行免疫，效果較好。

（2）開展免疫監(jiān)測(cè)　有條件的豬場(chǎng)應(yīng)開展免疫監(jiān)測(cè)（可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或間接血凝試驗(yàn)），根據(jù)母源抗體水平或殘留抗體水平適時(shí)免疫。并于每次免疫接種后進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)，凡是接種后抗體水平不合格的豬，再免疫一次，仍不合格者屬免疫耐受豬，應(yīng)堅(jiān)決淘汰。

（3）及時(shí)淘汰隱性感染帶毒豬　應(yīng)用直接免疫熒光抗體試驗(yàn)檢測(cè)種豬群，只要檢查出陽性帶毒豬，堅(jiān)決撲殺，進(jìn)行無害化處理，消滅傳染源，降低垂直傳播的危險(xiǎn)，建立一個(gè)健康狀態(tài)良好的種豬群。

（4）加強(qiáng)檢疫，防止引入病豬　實(shí)行自繁自養(yǎng)，盡可能不從外地引進(jìn)新豬。必須由外地引進(jìn)豬時(shí)，應(yīng)到無病地區(qū)選購(gòu)，并做好免疫接種；回場(chǎng)后，應(yīng)隔離觀察2～3周，并應(yīng)用免疫熒光抗體試驗(yàn)或酶標(biāo)免疫組織抗原定位法檢疫。確認(rèn)健康無病方可混群飼養(yǎng)。

（5）建立“全進(jìn)全出”的管理制度，消除連續(xù)感染、交叉感染。

（6）做好豬場(chǎng)、豬舍的隔離、衛(wèi)生、消毒工作　禁止場(chǎng)外人員、車輛、物品等進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)，必須進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)的人員應(yīng)經(jīng)嚴(yán)格消毒，更換工作衣、鞋后方可進(jìn)入；進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)的車輛物品也必須進(jìn)行嚴(yán)格消毒；生產(chǎn)區(qū)工作人員應(yīng)堅(jiān)守工作崗位，嚴(yán)禁串崗；各豬舍用具要固定，不可混用；生產(chǎn)區(qū)、豬舍要經(jīng)常清掃、消毒，認(rèn)真做好驅(qū)蟲、滅鼠工作。

（7）加強(qiáng)市場(chǎng)、運(yùn)輸檢疫，控制傳染源流動(dòng)，防止傳播豬瘟。

（8）科學(xué)飼養(yǎng)管理，提高機(jī)體抵抗力。

（六）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

參照標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 16551—2008。

1.病原學(xué)診斷

（1）兔體交互免疫試驗(yàn)

1）樣品處理　將病豬的淋巴結(jié)、脾臟和腎臟磨碎后用無熱原性的生理鹽水做1∶10稀釋。

2）接種家兔　將上述處理的樣品肌內(nèi)注射三只健康家兔，每只5ml，另設(shè)三只不注射病料而僅注射生理鹽水的對(duì)照兔，24h后，每隔6h測(cè)體溫一次，連續(xù)測(cè)溫5d。

3）接種家兔　接種樣品5d后對(duì)所有家兔靜脈注射用無熱源性的生理鹽水稀釋成1ml含有100個(gè)兔體最小感染量的豬瘟兔化弱毒（淋巴、脾臟毒），每只1ml，同時(shí)增設(shè)兩只僅注射豬瘟兔化弱毒的對(duì)照兔。24h后，每隔6h測(cè)體溫一次，連續(xù)測(cè)96h，注射生理鹽水和僅注射豬瘟兔化弱毒的兩組對(duì)照兔分別2/3和2/2出現(xiàn)定型熱或輕型熱時(shí)，試驗(yàn)成立。

4）判定標(biāo)準(zhǔn)　豬瘟強(qiáng)毒不引起家兔體溫反應(yīng)，但能使其產(chǎn)生免疫力，從而降低豬瘟兔化弱毒苗的攻擊。因此，可以利用豬瘟兔化弱毒攻擊后是否出現(xiàn)體溫反應(yīng)作指標(biāo)，以判定第一次接種的病料中是否含有豬瘟病毒。試驗(yàn)組的試驗(yàn)結(jié)果判定見表1-10。

（2）免疫酶染色試驗(yàn)

1）樣品的采集　解剖檢查時(shí)采病豬扁桃體、脾、腎、淋巴結(jié)作壓印片或冰凍切片，同時(shí)設(shè)正常組織對(duì)照標(biāo)本。標(biāo)本自然干燥后，在2%戊二醛和甲醛等量混合液中固定10min，干燥后，置冰箱內(nèi)待檢。

2）操作程序

① 將標(biāo)本浸入0.01%過氧化氫或0.01%疊氮鈉的Tris-HCl緩沖液中，室溫下作用30min。

② 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水漂洗5次，每次3min，風(fēng)干。

③ 將標(biāo)本置于濕盒內(nèi)，滴加1∶10酶標(biāo)記抗體，覆蓋標(biāo)本面上，置37℃作用45min。

④ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水-1%吐溫緩沖液漂洗5次，每次2～3min。

⑤ 將標(biāo)本放入DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCl液內(nèi)，置37℃作用3min。

⑥ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水沖洗5次，每次2～3min，再用無水酒精、二甲苯脫水，封片檢查。

⑦ 用普通生物顯微鏡檢查判定結(jié)果，如細(xì)胞質(zhì)染成深褐色為陽性，黃色或無色為陰性，正常對(duì)照標(biāo)本應(yīng)為陰性。豬瘟兔化弱毒接種的豬組織細(xì)胞質(zhì)呈微褐色，與強(qiáng)毒株感染有明顯區(qū)別。

（3）病毒分離與鑒定試驗(yàn)

1）將2g扁桃體或脾臟或腎臟剪成小塊，加上滅菌砂在研缽中研成勻漿，用Hank’s液或MEM配成20%懸液，加青霉素（使最終濃度為500U/ml）和鏈霉素（使最終濃度為500μg/ml），室溫下放置1h，以3000r/min離心15min取上清液。

2）將PK15單層細(xì)胞用胰酶消化分散后，以8000r/min離心10min，用不含牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的5%胎牛血清的MEM配成每毫升含2×106個(gè)細(xì)胞的懸液。

3）九份細(xì)胞懸液加一份病料懸液接種于帶有細(xì)胞飛片的轉(zhuǎn)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板。另設(shè)不加病料的對(duì)照若干瓶（孔），于接種后1d、2d、3d，分別從兩個(gè)接種瓶（孔）和一個(gè)對(duì)照瓶（孔）中取出細(xì)胞片用Hank’s液或MEM洗滌兩次，每次5min，用冷無水丙酮固定10min。

4）按（2）或（4）、5）～（4）、7）進(jìn)行免疫酶染色或熒光抗體染色、鏡檢并判定結(jié)果。

（4）直接免疫熒光抗體試驗(yàn)

1）采樣　群體檢疫中，待檢可疑豬不少于3例，其中至少2例為早期患豬，活體取扁桃體或剖殺后摘取扁桃體。后期病豬剖殺后采扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟。個(gè)體檢疫時(shí)，可活體取扁桃體或剖殺可疑豬采扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟。所采組織樣品應(yīng)新鮮且為豬瘟疫苗免疫21d后。

2）送檢　采樣后應(yīng)盡快冷藏送檢，如當(dāng)日不能送出，應(yīng)凍結(jié)保存，避免組織腐敗、自溶，影響結(jié)果。

3）制片　將樣品組織塊切出1cm×1cm的小塊，不經(jīng)任何固定處理，直接凍貼于冰凍切片機(jī)的冰凍切片托上（組織塊太小時(shí)，如活體采取的扁桃體，可用冰凍切片機(jī)專用的包埋劑或化學(xué)漿糊包埋），進(jìn)行切片，切片厚度要求5～7μm。將切片展貼在0.8～1.0mm厚的潔凈載玻片上，也可將樣片組織直接作壓片或涂片，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照片。

4）固定　將切片、壓印片或涂片置無水丙酮中固定15min。取出立即放入0.01mol/L、pH7.2的磷酸緩沖鹽水中，輕輕漂洗3次。取出，自然干燥后，盡快進(jìn)行熒光抗體染色。

5）熒光抗體染色　將豬瘟熒光抗體滴加于樣品片表面，放置濕盒內(nèi)于37℃作用30min。取出后浸入磷酸緩沖鹽水中充分漂洗，再用帶有0.5mol/L，pH9.0～9.3碳酸鹽緩沖甘油的蓋玻片（0.17mm厚）封固樣品片表面。染色后應(yīng)盡快鏡檢，4℃保存不應(yīng)超過72h。必要時(shí)可低溫保存待檢，但也不應(yīng)超過1周。

6）鏡檢　將染色、封固后的樣品片置于激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。

7）判定標(biāo)準(zhǔn)　于熒光顯微鏡視野中，見扁桃體隱窩上皮細(xì)胞或腎曲小管上皮細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，或脾、淋巴結(jié)胞漿內(nèi)有黃綠色熒光判為豬瘟病毒感染陽性。正常對(duì)照片細(xì)胞內(nèi)應(yīng)無黃綠色熒光。

（5）豬瘟病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

1）材料與樣品準(zhǔn)備

① 材料準(zhǔn)備：本試驗(yàn)所用試劑需用無RNA酶污染的容器分裝；各種離心管和帶濾芯吸頭須無RNA酶污染；剪刀、鑷子和研磨器應(yīng)干烤滅菌。

② 樣品制備：按1∶5比例，取待檢組織和MEM液于研缽中充分研磨制成勻漿液，4℃，以1000g離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無RNA酶污染的離心管中備用；采全血脫纖抗凝備用；細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次備用；其他樣品酌情處理。制備的樣品在2～8℃保存應(yīng)不超過24h，長(zhǎng)期保存小瓶分裝后置－70℃以下，避免反復(fù)凍融。同時(shí)設(shè)立陰、陽性對(duì)照。

2）RNA提取

① 移取750μl Trizol至1.5ml Eppendorf管，加入200μl血液（培養(yǎng)液或組織處理上清），旋渦振蕩20s，室溫下作用5min，加入200μl三氯甲烷，旋渦振蕩15s，室溫下作用10min。

② 以12000r/min（11750g）、4℃離心15min。

③ 輕輕吸取上清轉(zhuǎn)至新的1.5ml Eppendorf管（注意不要吸到中間蛋白層），550～600μl，加入等量預(yù)冷的異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，－20℃條件下靜置至少10min。

④ 以12000r/min（11750g）、4℃離心15min。

⑤ 輕輕倒掉上清，順勢(shì)將管口殘液在吸水紙上蘸干（注意各管不要用吸水紙同一點(diǎn)），向管中輕加入1ml預(yù)冷的75%乙醇。輕輕顛倒數(shù)次，將乙醇倒掉，將管口殘液在水紙上蘸干（注意各管不要用吸水紙同一點(diǎn)），蓋上后，以5000r/min、4℃離心2min。

⑥ 用潔凈無酶吸頭將管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀（RNA少的情況下可能看不見沉淀）。在安全柜或超凈臺(tái)中將殘留的乙醇吹干，約5min，直至無乙醇味為止。時(shí)間不要太長(zhǎng)，以免RNA溶解困難。

⑦ 用下列比例配制溶液溶解RNA：

4μl 0.1mol/L MDTT

1μl RNA酶抑制劑（Rnase inhibitor）

15μl無酶水

共計(jì)20μl，按此比例一次性配好，混勻。按每個(gè)樣品20～50μl配制。

吸取20～50μl RNA溶解液溶液加至 Eppendorf管底，55～65℃水浴助溶10min。RNA溶液在－80℃保存。短期也可在－20℃保存。

3）cDNA合成

① 吸取5μl上述RNA溶液至PCR管中。

② 加入1μl 50 pmol/L的下游引物，68℃作用5min，冰水浴中降溫（或在PCR儀中采用程序：68℃反應(yīng)5min，置于4℃結(jié)束反應(yīng)）。

③ 加入下列試劑：

2μl 5×第一鏈緩沖液（first strand buffer）

0.5μl 0.1mol/L DTT

0.5 μl DNTP（10 mmol/L）

0.25μlRNA酶抑制劑（Rnase inhibitor）

0.5μl反轉(zhuǎn)錄酶（superscript）

PCR儀中50℃反應(yīng)60min，75℃溫育10min，置于4℃結(jié)束反應(yīng)。

4）PCR

① 吸取上述cDNA模板3μl，無酶水34.5μl。

② 加入下列試劑：

5μl 10×PCR緩沖液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl上游引物

1μl下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

將混合物吹打均勻后，至PCR儀中擴(kuò)增，條件如下：94℃預(yù)熱3min，94℃變性50s，58℃退火50s，72℃鏈延伸1min40s，30個(gè)循環(huán)；72℃溫育10min，置于4℃結(jié)束反應(yīng)。

5）nest-pcr

① 吸取上述PCR模板1.5μl，無酶水36μl。

② 加入下列試劑：

5μl 10×PCR緩沖液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl nest上游引物

1μl nest下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

將混合物吹打均勻后，至PCR儀中擴(kuò)增，條件如下：94℃預(yù)熱3min，94℃變性50s，54℃退火50s，72℃鏈延伸1min 40s，30個(gè)循環(huán)；72℃溫育10min，置于4℃結(jié)束反應(yīng)。

6）電泳　取6～10μl PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，緩沖液為0.5×TBE，100V、40min。

7）凝膠成像及結(jié)果判定　陽性樣品出現(xiàn)1.2k大小條帶、陰性樣品無條帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)成立。被檢樣品出現(xiàn)1.2k大小條帶為豬瘟陽性，否則為陰性。

2.血清學(xué)診斷

（1）熒光抗體病毒中和試驗(yàn)

1）細(xì)胞準(zhǔn)備

① 將濃度為每毫升含2×105個(gè)細(xì)胞的PK15細(xì)胞懸液接種于帶有蓋玻片的Leighton管、培養(yǎng)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板中。

② 于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，直至有70%～80%的細(xì)胞形成單層，Leighton管可用普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2）病毒中和試驗(yàn)

① 被檢血清于56℃滅活30min，在國(guó)際貿(mào)易中，最好作1∶5稀釋。在國(guó)內(nèi)作抗體水平普查時(shí)，被檢血清可作1∶25稀釋。

② 將稀釋的血清與含有200TCID50/0.1ml的病毒懸液等體積混合，置37℃作用1～2h。

3）中和后的病毒接種

① 將帶有蓋玻片的Leighton管、培養(yǎng)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板，用無血清培養(yǎng)液洗滌3次后，用血清-病毒中和后的混合物接種在帶有蓋玻片的Leighton管、培養(yǎng)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于37℃溫箱作用1h，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的陰、陽性血清中和對(duì)照，沒有血清中和的病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。

② 在Leighton管、培養(yǎng)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞維持液，并將細(xì)胞培養(yǎng)物繼續(xù)置于37℃溫箱培養(yǎng)2d以上。

4）熒光抗體染色

① 從Leighton管、培養(yǎng)瓶或微量細(xì)胞培養(yǎng)板中取出帶有細(xì)胞的蓋玻片，用pH7.2的磷酸緩沖鹽水洗滌細(xì)胞單層2次，每次5min，后用無水丙酮固定10min，再將工作濃度的豬瘟熒光抗體結(jié)合物滴加在帶有細(xì)胞的蓋玻片上，放置濕盒內(nèi)，于37℃染色30min，并用pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗3次。

② 用pH9.0～9.3的90%碳酸鹽-甘油緩沖液將蓋玻片封固在無油漬的顯微鏡載玻片上，并在熒光顯微鏡下作熒光檢查。

5）鏡檢　將染色、封固后的樣品片置于激發(fā)光為藍(lán)紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。

6）判定標(biāo)準(zhǔn)

① 在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清中和對(duì)照的細(xì)胞胞漿中無黃綠色熒光，標(biāo)準(zhǔn)的陰性血清中和對(duì)照與沒有血清中和的病毒對(duì)照的細(xì)胞胞漿中有黃綠色熒光時(shí)，試驗(yàn)成立，可判定被檢樣品的結(jié)果。

② 熒光顯微鏡下，被檢樣品的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見黃綠色熒光時(shí)，判為豬瘟抗體陽性；被檢樣品的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有明亮的黃綠色熒光時(shí)，判為豬瘟抗體陰性。

（2）豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1）材料準(zhǔn)備　豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原，酶標(biāo)結(jié)合物，標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清，酶聯(lián)板及其他必要的試驗(yàn)溶液。

2）操作方法

① 抗原包被：用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原分別作100倍稀釋，以每孔100μl分別加入做好標(biāo)記的酶聯(lián)板孔中，置于濕盒放4℃過夜。

② 洗滌：甩掉酶聯(lián)板孔內(nèi)的液體，加入洗滌液，室溫下浸泡3min，甩去洗滌液，再重新加入洗滌液，連續(xù)洗滌3次，最后1次甩掉洗滌液后，拍干酶聯(lián)板。

③ 加入被檢血清：用稀釋液將被檢血清作400倍稀釋，每孔加100μl。同時(shí)，將豬瘟標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清以100倍稀釋作對(duì)照，置濕盒于37℃作用1.5～2h，甩掉酶聯(lián)板中稀釋的血清，用洗滌液沖洗3次，洗滌方法同②。

④ 加入酶標(biāo)抗體結(jié)合物：用稀釋液將酶標(biāo)抗體結(jié)合物作100倍稀釋，每孔加入100μl，置濕盒于37℃孵育1.5～2.0h，甩掉酶標(biāo)抗體結(jié)合物，用洗滌液沖洗3次，洗滌方法同②。

⑤ 加底物：每孔加入新配制的底物溶液（每塊96孔酶聯(lián)板所需底物溶液按鄰苯二胺10mg加底物緩沖液10ml、30%過氧化氫37.50μl配制）100μl，室溫下觀察顯色反應(yīng)，一旦陰性對(duì)照孔略顯微黃色，立即終止反應(yīng)。

⑥ 終止反應(yīng)：每孔加入終止液50μl后，迅速用酶聯(lián)讀數(shù)儀以490nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的光吸收值（OD），并以陰性血清孔作為空白對(duì)照孔。

3）判定標(biāo)準(zhǔn)

① 在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上：

OD≥0.2，為豬瘟弱毒抗體陽性；

OD<0.2，為豬瘟弱毒抗體陰性。

② 在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上：

OD≥0.5，為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽性；

OD<0.5，為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰性。

4）判定結(jié)論

① 同一份被檢血清，當(dāng)在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上結(jié)果為陽性，而在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上結(jié)果為陰性時(shí)，表明被檢豬為豬瘟疫苗免疫豬。

② 同一份被檢血清當(dāng)在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上結(jié)果均為陰性，而在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上結(jié)果為陽性時(shí)，表明被檢豬為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽性豬疫苗免疫豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒豬。

③ 同一份被檢血清，當(dāng)在豬瘟弱毒和強(qiáng)毒酶聯(lián)板上結(jié)果均為陽性時(shí)，表明被檢豬為豬瘟強(qiáng)、弱毒抗體陽性豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒豬。

④ 同一份被檢血清，當(dāng)在豬瘟弱毒和強(qiáng)毒酶聯(lián)板上結(jié)果均為陰性時(shí)，表明被檢豬為豬瘟強(qiáng)、弱毒抗體陰性豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒的免疫豬或真正的豬瘟陰性豬。