第二節　豬　病

一、豬瘟

豬瘟俗稱爛腸瘟，美國稱豬霍亂，英國稱為豬熱病，是由豬瘟病毒引起豬的急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。根據臨診癥狀可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、溫和型、繁殖障礙型、神經型7種。最急性型特征是發病急、高熱稽留和全身性小點出血，脾梗死；急性型呈敗血性變化，實質器官出血、壞死；亞急性型和慢性型不但有不同程度的敗血性變化，且還發生纖維素性、壞死性腸炎；繁殖障礙型、溫和型、神經型引起母豬帶毒綜合征，導致孕豬流產、早產，產死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔豬先天性頭部震顫和四肢顫抖等。本病是豬的一種重要傳染病，OIE將其列入A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

目前，本病在亞洲、非洲、中南美洲仍然不斷發生，在美國、加拿大、澳大利亞及歐洲若干國家已經被消滅，但在歐洲某些國家近10年來仍有發病的報道。

（一）病毒特征

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；美國稱為 Hog cholera virus，HCV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），是世界范圍內最重要的豬病病毒?；蚪M為單鏈正股RNA，病毒粒子呈球形，直徑為38～50mm，具有脂蛋白囊膜和20面體立體對稱的核衣殼。目前認為豬瘟病毒僅有一個血清型，但病毒株的毒力有強、中、弱之分。豬瘟病毒與牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVD）的基因組序列有高度的同源性，抗原關系密切，既有血清學交叉反應，又有交叉保護作用，豬能自然感染這種病毒。用BVDV抗血清與豬瘟病毒株作中和試驗，可將豬瘟病毒分為H群（強毒株）和B群（弱毒株）。豬瘟野毒株的毒力變化很大，H群不能被BVDV抗血清中和，可引發急性發病和高病死率；B群能被BVDV抗血清中和，一般引起亞急性或慢性傳染。

豬瘟病毒分布于病豬全身體液和各種組織內，以淋巴結、脾和血液中含量最高，每克含數百萬個豬最小感染量。病豬的尿、糞便等排泄物和分泌物都含有大量病毒，發熱期含病毒量最高。豬瘟病毒對環境的抵抗力不強，溫度越高越敏感，但存活的時間取決于含毒的介質。正常條件下，76℃經1h可使病毒失去感染力；在干燥條件下，病毒容易死亡，被污染的環境在干燥和陽光直射的條件下，經1～4周可失去傳染性。豬瘟病毒在冷藏豬肉中可存活幾個月，在冰凍豬肉中存活時間可達數年之久，在濃度高達174%的鹽腌制豬腿肉中尚能存活102d，這些具有重要的流行病學意義。對乙醚、氯仿、β-丙烯內酯和堿性消毒藥物敏感，如2%氫氧化鈉、生石灰等。1%的福爾馬林、碳酸鈉（4%無水或10%結晶碳酸鈉+0.1%去污劑）、離子和無離子去污劑等能將其滅活。

（二）臨床癥狀

本病的潛伏期一般5～7d，最短2d，長的21d。根據病程長短和臨診癥狀可分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、繁殖障礙型、溫和型和神經型。

最急性型：多見于流行初期，主要表現為突然發病，高熱稽留，體溫可達41℃以上，全身痙攣，四肢抽搐，皮膚和可視黏膜發紺、有出血點，倒臥地上很快死亡，病程1～5d。

急性型：體溫升高到41～42℃，稽留不退，精神沉郁，行動緩慢、低頭垂尾、嗜睡、發抖，行走時拱背、不食。病豬早期有急性結膜炎，眼結膜潮紅，眼角有多量膿性分泌物，甚至使眼瞼粘連；口腔黏膜發紺、有出血點。公豬包皮內積尿，用手可擠出渾濁惡臭尿液。病初出現便秘，排出球狀并帶有血絲或偽膜的糞球，隨病程的發展呈現腹瀉或腹瀉便秘交替出現。皮膚初期潮紅充血，隨后在耳、頸、腹部、四肢內側出現出血點和出血斑（圖1-41）。瀕死前，體溫降至常溫以下，病程一般1～2周。

亞急性型：癥狀與急性型相似，但較緩和，病程一般3～4周。不死亡者常轉為慢性型。

慢性型：主要表現消瘦，全身衰弱，體溫時高時低，便秘腹交替，被毛枯燥，行走無力，食欲不佳，貧血。有的病豬在耳端、尾尖及四肢皮膚上有紫斑或壞死，病程1個月以上。病豬很難恢復，不死者長期發育不良，形成僵豬。

繁殖障礙型（母豬帶毒綜合征）：有的孕豬感染后可不發病但長期帶毒，并能通過胎盤傳給胎兒。有的孕豬出現流產、早產，產死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔豬先天性頭部、四肢顫抖，一般數天后死亡，存活的仔豬可出現長期病毒血癥。

溫和型：癥狀較輕且不典型，有的耳部皮膚壞死，俗稱干耳朵；有的尾部壞死，俗稱干尾巴；有的四肢末端壞死，俗稱紫斑蹄。病豬發育停滯，后期四肢癱瘓，不能站立，部分病豬跗關節腫大。病程一般半個月以上，有的經2～3個月后才能逐漸康復。

神經型：多見于幼豬。病豬表現為全身痙攣或不能站立，或盲目奔跑，或倒地痙攣，常在短期內死亡。

（三）病理變化

根據病程長短和繼發感染情況，病理變化有所不同。

最急性型：多無明顯病理變化，一般僅見到黏膜、漿膜和內臟有少數點狀出血，淋巴結輕度腫脹和出血。

急性型：主要表現為典型的敗血癥病變，全身皮膚、漿膜和內臟實質器官有不同程度的出血變化，以淋巴結、腎臟、膀胱、喉頭、會厭軟骨和大腸黏膜的出血最為常見。皮膚出血主要見于耳根、腹下和四肢內側。心肌、肺臟、輸尿管等處有數量不等的出血點或出血斑。兩側扁桃體壞死。全身淋巴結腫大、多汁、充血和出血，呈暗紅色，切面呈彌漫性出血或周邊出血，中心部保持有灰白色區域，呈紅白相間的大理石狀花紋；脾不腫大，色澤基本正常，邊緣及尖端有大小不一、紫紅色、隆起的出血性或貧血性梗死灶，呈結節狀（圖1-42）。這是豬瘟最有診斷意義的病變。

腎臟色澤變淡，呈土黃色，皮質部有針尖大到小米粒大數量不等的出血點，少者數個，多者密布，髓質出血比較少見，仔豬先天感染表現“有溝腎”。胃漿膜、黏膜出血，小腸有卡他性炎癥，回腸、盲腸（特別是回盲瓣處）和結腸常有特征性的壞死、潰爛，形成紐扣狀潰瘍（圖1-43）。

膀胱出血明顯，膀胱黏膜上密布有針頭大小的出血點。

亞急性型：全身出血性癥狀較急性型輕，但壞死性腸炎和肺炎變化明顯。

慢性型：主要變化為壞死性腸炎，全身出血變化不明顯。特征性病變是在盲腸、回盲口及結腸黏膜上形成紐扣狀潰瘍，呈同心輪層狀纖維素性壞死，黑褐色突出于腸黏膜表面。肋骨病變也很常見，表現為突然鈣化，從肋骨、肋軟骨聯合到肋骨近端有半硬的骨結構形成的明顯橫切線。繁殖障礙型、溫和型和神經型的剖檢病變特征不明顯。

（四）流行病學特征

易感動物：本病在自然條件下只感染豬。不同品種、年齡、性別的豬均可感染發病。

傳染源：病豬和隱性感染的帶毒豬為主要傳染源。豬感染豬瘟病毒后1～2d，未出現臨診癥狀前即可向外界排毒；病豬痊愈后仍可帶毒和排毒5～6周；病豬的排泄物、分泌物和屠宰時的血、肉、內臟和廢料、廢水都含有大量病毒；被豬瘟病毒污染的飼料、飲水、用具物品、人員、環境等也是傳染源。隨意拋棄病死豬的肉尸、臟器或者病豬、隱性感染豬及其產品處理不當均可傳播本病。帶毒母豬產出的仔豬可持續排毒，也可成為傳染源。豬場內的蚯蚓和豬體內的肺絲蟲是自然界的保毒者，應引起重視。

傳播途徑：豬瘟主要通過直接或間接接觸方式傳播，一般經消化道傳染，也可經呼吸道、眼結膜感染或通過損傷的皮膚、閹割時的創口感染。非易感動物和人可能是病毒的機械傳遞者。

妊娠母豬感染豬瘟后，病毒可經胎盤垂直感染胎兒，產出弱仔、死胎、木乃伊胎等，分娩時排出大量病毒。如果這種先天感染的仔豬在出生時正常并存活幾個月，它們便成為病毒散布的持續感染來源，這種持續的先天性感染對豬瘟的流行病學研究具有極其重要的意義，試驗證明，母豬在妊娠40日齡感染則發生死胎、木乃伊胎和流產；70日齡感染者所生的仔豬45%帶毒，出生后出現先天性震顫，多于1周左右死亡；90日齡感染者所生的仔豬可存活2～11個月，此種豬無明顯癥狀但終身帶毒、排毒，為豬瘟病毒的主要儲存宿主，有這些豬的存在即可形成豬瘟常發地區或豬場。

流行因素及形式：本病一年四季均可發生，一般以深秋、冬季、早春較為嚴重。急性暴發時，先是幾頭豬發病，突然死亡，繼而病豬數量不斷增加，多數呈急性經過并死亡，3周后逐漸趨于低潮，病豬多呈亞急性型或慢性型，如無繼發感染，少數慢性病豬在1個月左右康復或死亡，流行終止。

近年來豬瘟流行發生了變化，出現非典型豬瘟、溫和型豬瘟，均以散發性流行。發病特點不突出，臨診癥狀較輕或不明顯，病死率低，無特征性病理變化，必須依賴實驗室診斷才能確診。

（五）預防及治療

本病堅持“預防為主”，采取綜合性防控措施。

（1）免疫接種　這是當前防控豬瘟的主要手段。一般情況下，用細胞苗免疫時，仔豬25日齡左右進行第1次免疫接種，60日齡再進行第2次免疫接種。豬瘟流行嚴重的豬場可采取超前免疫的辦法，即在仔豬剛出生后未吃初乳前，接種豬瘟疫苗1～2頭份，注苗1～2h后再自由哺乳，于70日齡進行第2次免疫。實施超前免疫時，母豬分娩過程中必須有專人守護，隨生隨免，吃到初乳后再免疫接種將失去效果。超前免疫中個別仔豬會出現過敏反應（全身出現青紫色，呼吸急速，嘔吐，站立不穩，隨后倒地，呈昏迷狀態），可注射地塞米松酸鈉液或苯海拉明、腎上腺素等進行搶救。

在上述免疫的基礎上，種豬每半年加強免疫一次，種母豬應于配種前25d免疫一次，使之產生堅強的免疫力，避免妊娠期間感染豬瘟。

為確保免疫效果，可適當加大免疫劑量或改豬瘟細胞苗為兔化豬瘟組織苗。根據多數學者實踐中應用的情況，適當提高免疫劑量可提高抗體水平。以下劑量供參考：種豬4～5頭份，仔豬2～3頭份，仔豬母源抗體在1∶32以上時（25日齡左右）4頭份較好。曾經出現免疫失敗的豬場，尤其是有繁殖障礙型、溫和型和神經型豬瘟存在的情況下，可選用豬瘟脾淋組織疫苗進行免疫，效果較好。

（2）開展免疫監測　有條件的豬場應開展免疫監測（可用酶聯免疫吸附試驗或間接血凝試驗），根據母源抗體水平或殘留抗體水平適時免疫。并于每次免疫接種后進行免疫效果監測，凡是接種后抗體水平不合格的豬，再免疫一次，仍不合格者屬免疫耐受豬，應堅決淘汰。

（3）及時淘汰隱性感染帶毒豬　應用直接免疫熒光抗體試驗檢測種豬群，只要檢查出陽性帶毒豬，堅決撲殺，進行無害化處理，消滅傳染源，降低垂直傳播的危險，建立一個健康狀態良好的種豬群。

（4）加強檢疫，防止引入病豬　實行自繁自養，盡可能不從外地引進新豬。必須由外地引進豬時，應到無病地區選購，并做好免疫接種；回場后，應隔離觀察2～3周，并應用免疫熒光抗體試驗或酶標免疫組織抗原定位法檢疫。確認健康無病方可混群飼養。

（5）建立“全進全出”的管理制度，消除連續感染、交叉感染。

（6）做好豬場、豬舍的隔離、衛生、消毒工作　禁止場外人員、車輛、物品等進入生產區，必須進入生產區的人員應經嚴格消毒，更換工作衣、鞋后方可進入；進入生產區的車輛物品也必須進行嚴格消毒；生產區工作人員應堅守工作崗位，嚴禁串崗；各豬舍用具要固定，不可混用；生產區、豬舍要經常清掃、消毒，認真做好驅蟲、滅鼠工作。

（7）加強市場、運輸檢疫，控制傳染源流動，防止傳播豬瘟。

（8）科學飼養管理，提高機體抵抗力。

（六）實驗室檢測

參照標準：GB/T 16551—2008。

1.病原學診斷

（1）兔體交互免疫試驗

1）樣品處理　將病豬的淋巴結、脾臟和腎臟磨碎后用無熱原性的生理鹽水做1∶10稀釋。

2）接種家兔　將上述處理的樣品肌內注射三只健康家兔，每只5ml，另設三只不注射病料而僅注射生理鹽水的對照兔，24h后，每隔6h測體溫一次，連續測溫5d。

3）接種家兔　接種樣品5d后對所有家兔靜脈注射用無熱源性的生理鹽水稀釋成1ml含有100個兔體最小感染量的豬瘟兔化弱毒（淋巴、脾臟毒），每只1ml，同時增設兩只僅注射豬瘟兔化弱毒的對照兔。24h后，每隔6h測體溫一次，連續測96h，注射生理鹽水和僅注射豬瘟兔化弱毒的兩組對照兔分別2/3和2/2出現定型熱或輕型熱時，試驗成立。

4）判定標準　豬瘟強毒不引起家兔體溫反應，但能使其產生免疫力，從而降低豬瘟兔化弱毒苗的攻擊。因此，可以利用豬瘟兔化弱毒攻擊后是否出現體溫反應作指標，以判定第一次接種的病料中是否含有豬瘟病毒。試驗組的試驗結果判定見表1-10。

（2）免疫酶染色試驗

1）樣品的采集　解剖檢查時采病豬扁桃體、脾、腎、淋巴結作壓印片或冰凍切片，同時設正常組織對照標本。標本自然干燥后，在2%戊二醛和甲醛等量混合液中固定10min，干燥后，置冰箱內待檢。

2）操作程序

① 將標本浸入0.01%過氧化氫或0.01%疊氮鈉的Tris-HCl緩沖液中，室溫下作用30min。

② 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水漂洗5次，每次3min，風干。

③ 將標本置于濕盒內，滴加1∶10酶標記抗體，覆蓋標本面上，置37℃作用45min。

④ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水-1%吐溫緩沖液漂洗5次，每次2～3min。

⑤ 將標本放入DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCl液內，置37℃作用3min。

⑥ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸緩沖鹽水沖洗5次，每次2～3min，再用無水酒精、二甲苯脫水，封片檢查。

⑦ 用普通生物顯微鏡檢查判定結果，如細胞質染成深褐色為陽性，黃色或無色為陰性，正常對照標本應為陰性。豬瘟兔化弱毒接種的豬組織細胞質呈微褐色，與強毒株感染有明顯區別。

（3）病毒分離與鑒定試驗

1）將2g扁桃體或脾臟或腎臟剪成小塊，加上滅菌砂在研缽中研成勻漿，用Hank’s液或MEM配成20%懸液，加青霉素（使最終濃度為500U/ml）和鏈霉素（使最終濃度為500μg/ml），室溫下放置1h，以3000r/min離心15min取上清液。

2）將PK15單層細胞用胰酶消化分散后，以8000r/min離心10min，用不含牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的5%胎牛血清的MEM配成每毫升含2×106個細胞的懸液。

3）九份細胞懸液加一份病料懸液接種于帶有細胞飛片的轉瓶或微量細胞培養板。另設不加病料的對照若干瓶（孔），于接種后1d、2d、3d，分別從兩個接種瓶（孔）和一個對照瓶（孔）中取出細胞片用Hank’s液或MEM洗滌兩次，每次5min，用冷無水丙酮固定10min。

4）按（2）或（4）、5）～（4）、7）進行免疫酶染色或熒光抗體染色、鏡檢并判定結果。

（4）直接免疫熒光抗體試驗

1）采樣　群體檢疫中，待檢可疑豬不少于3例，其中至少2例為早期患豬，活體取扁桃體或剖殺后摘取扁桃體。后期病豬剖殺后采扁桃體、淋巴結、脾臟、腎臟。個體檢疫時，可活體取扁桃體或剖殺可疑豬采扁桃體、淋巴結、脾臟、腎臟。所采組織樣品應新鮮且為豬瘟疫苗免疫21d后。

2）送檢　采樣后應盡快冷藏送檢，如當日不能送出，應凍結保存，避免組織腐敗、自溶，影響結果。

3）制片　將樣品組織塊切出1cm×1cm的小塊，不經任何固定處理，直接凍貼于冰凍切片機的冰凍切片托上（組織塊太小時，如活體采取的扁桃體，可用冰凍切片機專用的包埋劑或化學漿糊包埋），進行切片，切片厚度要求5～7μm。將切片展貼在0.8～1.0mm厚的潔凈載玻片上，也可將樣片組織直接作壓片或涂片，同時設正常對照片。

4）固定　將切片、壓印片或涂片置無水丙酮中固定15min。取出立即放入0.01mol/L、pH7.2的磷酸緩沖鹽水中，輕輕漂洗3次。取出，自然干燥后，盡快進行熒光抗體染色。

5）熒光抗體染色　將豬瘟熒光抗體滴加于樣品片表面，放置濕盒內于37℃作用30min。取出后浸入磷酸緩沖鹽水中充分漂洗，再用帶有0.5mol/L，pH9.0～9.3碳酸鹽緩沖甘油的蓋玻片（0.17mm厚）封固樣品片表面。染色后應盡快鏡檢，4℃保存不應超過72h。必要時可低溫保存待檢，但也不應超過1周。

6）鏡檢　將染色、封固后的樣品片置于激發光為藍紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。

7）判定標準　于熒光顯微鏡視野中，見扁桃體隱窩上皮細胞或腎曲小管上皮細胞漿內呈現明亮的黃綠色熒光，或脾、淋巴結胞漿內有黃綠色熒光判為豬瘟病毒感染陽性。正常對照片細胞內應無黃綠色熒光。

（5）豬瘟病毒反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）

1）材料與樣品準備

① 材料準備：本試驗所用試劑需用無RNA酶污染的容器分裝；各種離心管和帶濾芯吸頭須無RNA酶污染；剪刀、鑷子和研磨器應干烤滅菌。

② 樣品制備：按1∶5比例，取待檢組織和MEM液于研缽中充分研磨制成勻漿液，4℃，以1000g離心15min，取上清液轉入無RNA酶污染的離心管中備用；采全血脫纖抗凝備用；細胞培養物凍融3次備用；其他樣品酌情處理。制備的樣品在2～8℃保存應不超過24h，長期保存小瓶分裝后置－70℃以下，避免反復凍融。同時設立陰、陽性對照。

2）RNA提取

① 移取750μl Trizol至1.5ml Eppendorf管，加入200μl血液（培養液或組織處理上清），旋渦振蕩20s，室溫下作用5min，加入200μl三氯甲烷，旋渦振蕩15s，室溫下作用10min。

② 以12000r/min（11750g）、4℃離心15min。

③ 輕輕吸取上清轉至新的1.5ml Eppendorf管（注意不要吸到中間蛋白層），550～600μl，加入等量預冷的異丙醇，顛倒數次混勻，－20℃條件下靜置至少10min。

④ 以12000r/min（11750g）、4℃離心15min。

⑤ 輕輕倒掉上清，順勢將管口殘液在吸水紙上蘸干（注意各管不要用吸水紙同一點），向管中輕加入1ml預冷的75%乙醇。輕輕顛倒數次，將乙醇倒掉，將管口殘液在水紙上蘸干（注意各管不要用吸水紙同一點），蓋上后，以5000r/min、4℃離心2min。

⑥ 用潔凈無酶吸頭將管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀（RNA少的情況下可能看不見沉淀）。在安全柜或超凈臺中將殘留的乙醇吹干，約5min，直至無乙醇味為止。時間不要太長，以免RNA溶解困難。

⑦ 用下列比例配制溶液溶解RNA：

4μl 0.1mol/L MDTT

1μl RNA酶抑制劑（Rnase inhibitor）

15μl無酶水

共計20μl，按此比例一次性配好，混勻。按每個樣品20～50μl配制。

吸取20～50μl RNA溶解液溶液加至 Eppendorf管底，55～65℃水浴助溶10min。RNA溶液在－80℃保存。短期也可在－20℃保存。

3）cDNA合成

① 吸取5μl上述RNA溶液至PCR管中。

② 加入1μl 50 pmol/L的下游引物，68℃作用5min，冰水浴中降溫（或在PCR儀中采用程序：68℃反應5min，置于4℃結束反應）。

③ 加入下列試劑：

2μl 5×第一鏈緩沖液（first strand buffer）

0.5μl 0.1mol/L DTT

0.5 μl DNTP（10 mmol/L）

0.25μlRNA酶抑制劑（Rnase inhibitor）

0.5μl反轉錄酶（superscript）

PCR儀中50℃反應60min，75℃溫育10min，置于4℃結束反應。

4）PCR

① 吸取上述cDNA模板3μl，無酶水34.5μl。

② 加入下列試劑：

5μl 10×PCR緩沖液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl上游引物

1μl下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

將混合物吹打均勻后，至PCR儀中擴增，條件如下：94℃預熱3min，94℃變性50s，58℃退火50s，72℃鏈延伸1min40s，30個循環；72℃溫育10min，置于4℃結束反應。

5）nest-pcr

① 吸取上述PCR模板1.5μl，無酶水36μl。

② 加入下列試劑：

5μl 10×PCR緩沖液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl nest上游引物

1μl nest下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

將混合物吹打均勻后，至PCR儀中擴增，條件如下：94℃預熱3min，94℃變性50s，54℃退火50s，72℃鏈延伸1min 40s，30個循環；72℃溫育10min，置于4℃結束反應。

6）電泳　取6～10μl PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，緩沖液為0.5×TBE，100V、40min。

7）凝膠成像及結果判定　陽性樣品出現1.2k大小條帶、陰性樣品無條帶出現時，試驗成立。被檢樣品出現1.2k大小條帶為豬瘟陽性，否則為陰性。

2.血清學診斷

（1）熒光抗體病毒中和試驗

1）細胞準備

① 將濃度為每毫升含2×105個細胞的PK15細胞懸液接種于帶有蓋玻片的Leighton管、培養瓶或微量細胞培養板中。

② 于37℃二氧化碳培養箱中培養1～2d，直至有70%～80%的細胞形成單層，Leighton管可用普通培養箱培養。

2）病毒中和試驗

① 被檢血清于56℃滅活30min，在國際貿易中，最好作1∶5稀釋。在國內作抗體水平普查時，被檢血清可作1∶25稀釋。

② 將稀釋的血清與含有200TCID50/0.1ml的病毒懸液等體積混合，置37℃作用1～2h。

3）中和后的病毒接種

① 將帶有蓋玻片的Leighton管、培養瓶或微量細胞培養板，用無血清培養液洗滌3次后，用血清-病毒中和后的混合物接種在帶有蓋玻片的Leighton管、培養瓶或微量細胞培養板上，置于37℃溫箱作用1h，同時設置標準的陰、陽性血清中和對照，沒有血清中和的病毒對照和正常細胞對照。

② 在Leighton管、培養瓶或微量細胞培養板中加入細胞維持液，并將細胞培養物繼續置于37℃溫箱培養2d以上。

4）熒光抗體染色

① 從Leighton管、培養瓶或微量細胞培養板中取出帶有細胞的蓋玻片，用pH7.2的磷酸緩沖鹽水洗滌細胞單層2次，每次5min，后用無水丙酮固定10min，再將工作濃度的豬瘟熒光抗體結合物滴加在帶有細胞的蓋玻片上，放置濕盒內，于37℃染色30min，并用pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗3次。

② 用pH9.0～9.3的90%碳酸鹽-甘油緩沖液將蓋玻片封固在無油漬的顯微鏡載玻片上，并在熒光顯微鏡下作熒光檢查。

5）鏡檢　將染色、封固后的樣品片置于激發光為藍紫光或紫外光的熒光顯微鏡下觀察。

6）判定標準

① 在熒光顯微鏡下，正常細胞對照和標準陽性血清中和對照的細胞胞漿中無黃綠色熒光，標準的陰性血清中和對照與沒有血清中和的病毒對照的細胞胞漿中有黃綠色熒光時，試驗成立，可判定被檢樣品的結果。

② 熒光顯微鏡下，被檢樣品的細胞質內未見黃綠色熒光時，判為豬瘟抗體陽性；被檢樣品的細胞質內有明亮的黃綠色熒光時，判為豬瘟抗體陰性。

（2）豬瘟單抗酶聯免疫吸附試驗

1）材料準備　豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原，酶標結合物，標準陰、陽性血清，酶聯板及其他必要的試驗溶液。

2）操作方法

① 抗原包被：用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯抗原分別作100倍稀釋，以每孔100μl分別加入做好標記的酶聯板孔中，置于濕盒放4℃過夜。

② 洗滌：甩掉酶聯板孔內的液體，加入洗滌液，室溫下浸泡3min，甩去洗滌液，再重新加入洗滌液，連續洗滌3次，最后1次甩掉洗滌液后，拍干酶聯板。

③ 加入被檢血清：用稀釋液將被檢血清作400倍稀釋，每孔加100μl。同時，將豬瘟標準陰、陽性血清以100倍稀釋作對照，置濕盒于37℃作用1.5～2h，甩掉酶聯板中稀釋的血清，用洗滌液沖洗3次，洗滌方法同②。

④ 加入酶標抗體結合物：用稀釋液將酶標抗體結合物作100倍稀釋，每孔加入100μl，置濕盒于37℃孵育1.5～2.0h，甩掉酶標抗體結合物，用洗滌液沖洗3次，洗滌方法同②。

⑤ 加底物：每孔加入新配制的底物溶液（每塊96孔酶聯板所需底物溶液按鄰苯二胺10mg加底物緩沖液10ml、30%過氧化氫37.50μl配制）100μl，室溫下觀察顯色反應，一旦陰性對照孔略顯微黃色，立即終止反應。

⑥ 終止反應：每孔加入終止液50μl后，迅速用酶聯讀數儀以490nm波長測定每孔的光吸收值（OD），并以陰性血清孔作為空白對照孔。

3）判定標準

① 在豬瘟弱毒酶聯板上：

OD≥0.2，為豬瘟弱毒抗體陽性；

OD<0.2，為豬瘟弱毒抗體陰性。

② 在豬瘟強毒酶聯板上：

OD≥0.5，為豬瘟強毒抗體陽性；

OD<0.5，為豬瘟強毒抗體陰性。

4）判定結論

① 同一份被檢血清，當在豬瘟弱毒酶聯板上結果為陽性，而在豬瘟強毒酶聯板上結果為陰性時，表明被檢豬為豬瘟疫苗免疫豬。

② 同一份被檢血清當在豬瘟弱毒酶聯板上結果均為陰性，而在豬瘟強毒酶聯板上結果為陽性時，表明被檢豬為豬瘟強毒抗體陽性豬疫苗免疫豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒豬。

③ 同一份被檢血清，當在豬瘟弱毒和強毒酶聯板上結果均為陽性時，表明被檢豬為豬瘟強、弱毒抗體陽性豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒豬。

④ 同一份被檢血清，當在豬瘟弱毒和強毒酶聯板上結果均為陰性時，表明被檢豬為豬瘟強、弱毒抗體陰性豬，該豬按（2）做豬瘟抗原檢查，以確定是否為帶毒的免疫豬或真正的豬瘟陰性豬。