第四節(jié)　組織學常用研究技術方法

隨著生命科學整體研究水平的提高，許多新技術、新方法被廣泛應用到組織學研究領域，為拓展和提高組織學研究內(nèi)容及水平提供了精湛的技術支持。這里僅就組織學研究常用技術方法簡介如下。

一、普通光學顯微鏡技術

普通光學顯微鏡(light microscope，LM)簡稱光鏡，是組織學與胚胎學最常用的技術，可最大限度地將觀察物體放大1000～1500倍，分辨率極限達0.2μm。觀察前須將研究的細胞、組織或器官經(jīng)一系列的人工特殊處理及標本制作，后者可分為切片法和非切片法兩種。

1.切片法　石蠟切片術(paraffin sectioning)是經(jīng)典的最常用的技術，其標本制作過程包括取材、固定、脫水、包埋、切片、脫蠟、染色和封片等幾個主要步驟。

(1)取材　從機體取下所需新鮮組織器官的過程稱取材，厚度不超過0.5cm為宜。

(2)固定　為防止取材后的組織器官蛋白質(zhì)分解、自溶，并保持細胞生活時的形態(tài)結構，需經(jīng)固定劑固定。常用的固定劑有甲醛、乙醇、丙酮等。

(3)脫水　將固定后的組織器官經(jīng)各級不同濃度乙醇逐漸脫除水分的過程稱脫水。

(4)包埋　為便于將組織器官切制成薄片，常用石蠟、火棉膠、樹脂等包埋劑對其進行包埋。

(5)切片　采用組織切片機切制厚度為5～10μm的組織薄片，并裱貼在載玻片上稱為組織切片標本。

(6)脫蠟　組織切片標本經(jīng)二甲苯脫去其中的石蠟成分，便于染色。

(7)染色　染色的目的是讓組織細胞的不同成分結構形成色差(反差)，便于光鏡下觀察。組織切片染色是基于化學結合或物理吸附的原理。常用的酸性染色劑有伊紅、堅牢綠、橙黃G等，堿性染色劑有蘇木精、亞甲藍、堿性品紅等。伊紅為酸性染料，可使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著粉紅色，稱嗜酸性(acidophilia)；蘇木精為堿性染料，可使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色，稱嗜堿性(basophilia)；而對酸性染色劑和堿性染色劑均能產(chǎn)生較弱親和力的現(xiàn)象稱中性(neutrophilia)。組織學與胚胎學最常用的染色方法是蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色劑組合的染色方法，簡稱HE染色(H&E staining)或普通染色。通常組織切片經(jīng)HE染色后，細胞核被蘇木精著色呈紫藍色，細胞質(zhì)被伊紅著色呈粉紅色，是最常用的染色方法。

(8)封片　染色后的組織切片滴加樹膠用蓋玻片封固稱封片，利于保存和觀察。

某些特殊染色時，一些重金屬鹽可附著在組織細胞結構表面，在銀染色方法中直接使硝酸銀還原而顯色呈棕黑色的現(xiàn)象稱親銀性(argentaffin)；若需添加還原劑才能顯色的現(xiàn)象稱嗜銀性(argyrophilia)。組織細胞中的糖胺多糖類物質(zhì)用甲苯胺藍(toluidine blue)等堿性染色劑染色后呈紫紅色的現(xiàn)象稱異染性(metachromasin)。

若組織器官取材后直接快速冷凍，然后在恒冷箱切片機中切片的方法稱冰凍切片法。該法能有效保存組織器官內(nèi)脂類成分和酶活性，常用于細胞組織化學研究。

2.非切片法　非切片法是指不經(jīng)包埋、切片等步驟制作標本的方法。如將血液、分離細胞、脫落細胞等直接涂在載玻片上，稱涂片法；將腸系膜、皮下組織撕成薄片后直接鋪貼在載玻片上，稱鋪片法；將牙、骨等較堅硬的組織器官經(jīng)機械性打磨制成薄片后貼附在載玻片上，稱磨片法。上述各方法制成的標本再經(jīng)固定、脫水、染色、封片后，便可在光鏡下觀察。

二、特殊光學顯微鏡技術

1.熒光顯微鏡技術　熒光顯微鏡(fluorescence microscope)以紫外線為光源，能激發(fā)染料發(fā)出熒光，是一種用來觀察被熒光素染色，或標記的細胞及標本中自發(fā)熒光物質(zhì)的特殊顯微鏡。熒光顯微鏡技術包括自發(fā)性熒光、熒光染色法和熒光免疫細胞化學染色法三大類。利用熒光素標記的抗體直接或間接與組織細胞內(nèi)相應抗原結合的原理，可檢測相關抗原的定性、定位或定量。其主要特點是特異性強、敏感性高和簡便高效。

2.倒置顯微鏡技術　倒置顯微鏡(inverted microscope)是把光源和聚光器安裝在顯微鏡載物臺的上方，而物鏡安裝在載物臺下方的特殊顯微鏡。其特點是增大了載物臺與物鏡間的距離和空間，便于觀察體積較大的標本物體，如放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或保溫裝置等，便于直接觀察體外培養(yǎng)的細胞及對活細胞進行各種實驗的連續(xù)觀察和圖像拍攝。倒置顯微鏡和顯微操作器結合還可進行顯微注射等精度極高的研究工作。

3.相差顯微鏡技術　相差顯微鏡(phase contrast microscope)是通過改變光的相位，使相位差變?yōu)檎穹睿柙鰪娀驕p弱光的明暗度觀察生活狀態(tài)下活細胞微細結構的特殊顯微鏡。而倒置相差顯微鏡用于觀察活細胞分裂、增殖及運動等變化。

4.暗視野顯微鏡技術　暗視野顯微鏡(dark field microscope)是以膠體粒子干涉和散射效應為基礎研制的特殊光鏡，其基本原理是通過暗視野照明法，觀察被檢物體表面散射的光層，以確定被檢物體是否存在及其運動狀況，但不能分辨物體的微細結構。其主要適用于觀察液體介質(zhì)內(nèi)未染色的細菌、酵母、霉菌及血液內(nèi)白細胞等的運動狀態(tài)。

5.偏光顯微鏡技術　偏光顯微鏡(polarization microscope)具有產(chǎn)生偏光和檢查偏光的裝置，主要適用于晶體物質(zhì)和纖維結構的研究，如紡錘體、肌纖維、膠原纖維等。

6.激光共聚焦掃描顯微鏡技術　激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)是20世紀80年代初研制成功的一種具有高光敏度、高分辨率的新型顯微鏡，主要原理是以激光為光源，共聚焦成像掃描系統(tǒng)將光束經(jīng)聚焦后落在樣品不同深度的微小部位，并作移動掃描，通過電子信號彩色顯像，圖像被探測器吸收后除傳至彩色顯示器熒屏外，還可同時傳至圖像分析系統(tǒng)進行二維或三維分析處理。CLSM可精確地對細胞內(nèi)Ca2+、pH值等進行動態(tài)分析測定；對細胞的受體移動、膜電位變化、酶活性、信號轉(zhuǎn)導和物質(zhì)轉(zhuǎn)運等進行觀察測定；還可利用激光對細胞及染色體進行切割和分選等多項研究功能。

三、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡(electron microscope，EM，簡稱電鏡)與光鏡的成像原理不同，電鏡是以電子束(電子槍)代替光源，電磁透鏡代替聚光鏡、物鏡和目鏡，用熒光屏成像。由于電子束在不同電壓下產(chǎn)生不同的短波長，所以電鏡的分辨率極限達0.1～0.2nm，可將觀察物體放大近百萬倍。電鏡的種類和用途很多，常用技術如下。

1.透射電鏡技術　透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)工作原理是由電子槍發(fā)射的電子束穿透觀察樣品后，經(jīng)電磁場的聚合放大并在熒屏上顯像(圖1-1)。該技術的核心是樣品制備，主要過程包括：將1mm3大小的組織塊經(jīng)戊二醛和鋨酸進行雙重固定、樹脂包埋后，制成厚度為50～100nm的超薄切片，并裱貼在銅網(wǎng)上，用鉛和鈾等重金屬鹽進行電子染色后，即可在電鏡下觀察。通常將電鏡下所見結構稱超微結構。凡被重金屬鹽電子染色結合的部位圖像較暗，稱電子密度高(electron dense)，反之圖像較明亮則稱電子密度低(electron lucent)。上述被檢結構與重金屬鹽結合后，圖像呈電子密度高的染色稱正染色，當重金屬鹽不與被檢結構結合而與被檢結構周圍區(qū)域發(fā)生結合時，稱負染色。

2.掃描電鏡技術　掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM) 工作原理是由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)聚焦形成一束光斑稱電子探針，打在被觀察樣品表面后，可擊出樣品表面外層電子即二次電子。二次電子信號被探測器收集，并經(jīng)光電倍增放大送至熒屏顯像。其主要用于觀察樣品表面形態(tài)，富有強烈的立體感，其分辨率為6～10nm。該技術的樣品制備不必經(jīng)超薄切片，只是要求樣品表面充分暴露且干燥不變形，故樣品須經(jīng)固定、脫水、干燥后在其表面噴鍍一層金屬膜，以提高其導電性和圖像反差。該技術常用于觀察某些特殊結構或細胞群體的表面形態(tài)，如纖毛、微絨毛、T細胞等。

3.冷凍蝕刻復型技術　冷凍蝕刻復型技術(freeze etch replica)需將觀察的組織樣品用液氮超低溫(-196℃)冷凍，并在真空條件下使樣品斷裂，升溫至-100℃時斷裂面含游離水較多之處的冰晶出現(xiàn)升華，斷裂面即可呈現(xiàn)凹凸不平的浮雕效果，稱蝕刻。蝕刻后的樣品在其斷裂面上先后噴鍍一層鉑和碳，稱復型。復型后的樣品用次氯酸等腐蝕劑將組織溶解，剩下的僅是一層金屬復型膜，置于透射電鏡下觀察，所顯示的凹凸面與樣品實物恰恰相反。該技術尤其適用于生物膜內(nèi)部結構的研究。

4.冷凍割斷技術　冷凍割斷技術(freeze cracking)是將已固定、包埋的觀察樣品在低溫(-196℃)下割斷。樣品的斷面噴鍍金屬膜，在掃描電鏡下觀察斷面的三維結構。該技術尤其適用于組織內(nèi)部微細結構相互關系的研究，如肝臟竇周隙及毗鄰關系等。

5.掃描電鏡鑄型技術　掃描電鏡鑄型技術(scanning electron microscope casting)特別適用于觀察空腔性結構的微細立體結構。

6.X-衍射顯微分析技術　X-衍射顯微分析技術(X-ray diffraction microanalysis)是當前研究生物大分子元素空間結構最有效的技術方法之一。

7.超高壓電鏡技術　超高壓電鏡技術(ultravoltage electron microscope，UEM)是指電子束的加速電壓超出500kV以上的電鏡(普通電鏡在200kV以下)。目前世界上已知的電鏡加速電壓最高可達3000kV。UEM適于觀察較厚的樣品，如培養(yǎng)的細胞無須超薄切片即可直接觀察細胞內(nèi)微絲、微管等結構。

8.掃描探針電鏡技術　掃描探針電鏡技術(scanning probe microscope，SPM)是新一代研究測量物體表面性狀的生物技術，主要有掃描隧道電鏡技術(STM)、原子力電鏡技術(AFM)、磁力電鏡技術(MFM)等。SPM技術在DNA、蛋白質(zhì)及生物膜等研究領域的應用尤為突出。

四、組織化學和細胞化學技術

組織化學(histochemistry)和細胞化學(cytochemistry)技術是基于物理和化學反應的原理，使組織細胞內(nèi)某化學成分形成有色沉淀物，便于在光鏡或電鏡下對其進行定性、定位和定量研究。常用的研究內(nèi)容如下。

1.糖類　顯示多糖和蛋白多糖常用過碘酸-希夫反應(periodic acid-Schiff reaction，PAS反應)。其原理是過碘酸氧化反應可使糖分子的乙二醇基氧化形成乙二醛基，后者與Schiff試劑中無色堿性品紅結合，即可在原糖分子存在的部位形成紫紅色反應產(chǎn)物并形成沉淀，間接顯示細胞內(nèi)糖物質(zhì)的狀態(tài)。

2.脂類　為防止有機溶劑對脂肪和類脂的溶解，用冰凍切片為宜。可采用蘇丹黑、油紅O、尼羅藍等易溶于脂類的染料進行染色。也可采用鋨酸(OsO4)固定兼染色，脂肪酸或膽堿均可使鋨酸還原為OsO2，使脂類呈黑色。

3.酶　已知細胞內(nèi)有氧化還原酶系、水解酶系等各種酶類，現(xiàn)已有100多種酶的顯示法。其基本原理均是利用酶對其相應底物水解、氧化產(chǎn)生的反應物與捕獲劑發(fā)生反應時，可形成顯微鏡下可視的有色反應最終產(chǎn)物。常以最終產(chǎn)物顯色的深淺表示該酶活性的強弱。

4.核酸　常用孚爾根反應(Feulgen reaction)顯示DNA，其原理是DNA分子中的脫氧核糖與嘌呤之間的連接鍵經(jīng)稀鹽酸處理后被打開，在形成醛基后再與Schiff試劑中的堿性品紅作用，使DNA呈紫紅色。也可用甲基綠-派若寧反應，DNA呈藍綠色，RNA呈紅色。

五、免疫組織化學和免疫細胞化學技術

免疫組織化學(immunohistochemistry)和免疫細胞化學(immunocytochemistry)均基于抗原-抗體特異性結合的免疫學原理，將已知細胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)作為抗原注入機體內(nèi)，使機體產(chǎn)生與之相應的抗體，并分離提取，提取后的抗體用熒光染料或鐵蛋白予以標記。最終用標記的抗體來尋找觀察樣品中能與其發(fā)生特異性結合的抗原。光、電鏡下樣品中凡有標記物的部位即可表明相應抗原的存在。

通常標記抗體與抗原發(fā)生直接結合稱直接法(圖1-2A)，又稱一步法，該方法簡單方便，特異性強，但敏感性較低；若將分離提取的抗體(Ⅰ抗)再作為抗原去免疫另一機體，并制備原抗體(Ⅰ抗)的抗體，后者稱Ⅱ抗，用標記物如熒光素或酶等再標記Ⅱ抗，最后用Ⅰ抗和標記Ⅱ抗先后處理觀察樣品，即形成抗原-Ⅰ抗-標記Ⅱ抗的復合物，此方法稱間接法(圖1-2B)，又稱二步法。間接法中的一個抗原分子可通過一個Ⅰ抗與多個標記Ⅱ抗結合，因而具有較高的敏感性。其不足是易出現(xiàn)非特異性反應。

目前，間接法較常用的是PAP(過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物)法，因抗原經(jīng)抗體逐級放大并與酶分子結合，使其敏感性更強(圖1-3)。而ABC(抗生素-生物素-過氧化物酶復合物)法比PAP法敏感性提高20～30倍(圖1-4)。如使抗體與熒光素結合，則稱熒光標記抗體法(圖1-5)。

六、原位雜交技術

原位雜交技術(in situ hybridization)又稱核酸分子雜交組織化學技術，用來檢測樣品中特定的基因片段、轉(zhuǎn)錄水平的基因活性及表達(mRNA)。其原理是依據(jù)DNA雙鏈的核苷酸互補特點，將帶有標記物的已知堿基序列的核酸片段(探針)，與組織細胞內(nèi)待測的核酸進行特定的雜交，并通過標記物的顯示，在光鏡、電鏡下檢測被雜交核酸的存在與否或定位、定量(圖1-6)。目前該技術使用的核酸探針標記物通常有放射性類和非放射性類兩種。放射性類常用的核素為35S、32P和3H等，經(jīng)放射自顯影技術處理后即可用光鏡、電鏡觀察。非放射性類的標記物為地高辛、生物素、熒光素、鐵蛋白等，可經(jīng)免疫組織化學技術處理后觀察。

七、細胞化學計量技術

細胞化學計量技術(quantitation in cytochemistry)是一種應用數(shù)字來反映組織細胞內(nèi)某類化學物質(zhì)或反應產(chǎn)物的量化方法。常用的技術方法如下。

1.顯微分光光度測量技術　顯微分光光度測量技術(microspectrophotometry)是采用顯微分光光度計基于細胞內(nèi)某物質(zhì)的消光度與其厚度和該物質(zhì)的濃度成正比例的原理，通過光電自控系統(tǒng)將所測的消光度轉(zhuǎn)換為電信號而獲得光密度(OD)值，對樣品進行定量分析。

2.流式細胞技術　流式細胞技術(flow cytometry，F(xiàn)CM)可對單個細胞的生理、生化和生物物理特性進行快速高效分析測定。常用于細胞動力學、免疫學和腫瘤學中的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、染色體、抗原、抗體、細胞亞群和雜交細胞的分選研究。

3.顯微圖像分析系統(tǒng)　顯微圖像分析系統(tǒng)(microscope image analysis system)主要由顯微鏡、計算機、圖像采集裝置和數(shù)據(jù)處理分析軟件四大構件組成，可快速準確地進行組織切片或電鏡照片中微細結構和成分的數(shù)量、體積、面積、周長、直徑等相對和絕對值的測定并打印，同時可進行二維或三維的轉(zhuǎn)換，其中三維立體結構的測定研究也稱體視學。同樣也可經(jīng)外置的圖像采集裝置對較大的被檢測物如整體動物(小鼠)、器官及X光片等實物進行圖像采集并進行測定分析。

八、放射自顯影技術

放射自顯影技術(autoradiography，ARG)是基于放射性同位素(radioisotope，RI)核裂變時放出的核射線可使感光材料中的溴化銀顆粒感光還原成銀粒的原理，將標記的示蹤劑注入機體或摻入培養(yǎng)基中，經(jīng)細胞攝取后，取被檢組織或細胞制成切片或涂片標本，并與感光材料緊貼，經(jīng)適當時間的曝光、顯影和定影后，可呈現(xiàn)出與標本中示蹤劑分布部位、數(shù)量、強度(濃度)完全一致的影像，可得知示蹤劑的精確分布和含量。

九、體外培養(yǎng)技術

體外培養(yǎng)技術(in vitro culture)是組織培養(yǎng)(tissue culture)和細胞培養(yǎng)(cell culture)的總稱(圖1-7)。該技術取活體組織細胞后，置體外適宜的條件下，在使其繼續(xù)生長、繁殖的同時進行實驗觀察研究，故體外培養(yǎng)技術又稱體外實驗。首次分離后培養(yǎng)的細胞稱原代培養(yǎng)(primary culture)；細胞增殖后再傳代繼續(xù)培養(yǎng)的細胞稱繼代培養(yǎng)(subculture)；經(jīng)長期反復傳代培養(yǎng)而成的細胞稱細胞系(cell line)；采用細胞克隆而建成的某種純細胞群體稱細胞株(cell strain)。

十、細胞融合技術

細胞融合技術(cell fusion)是指用人工方法在體外使兩個或兩個以上細胞成為一個雙核或多核細胞的過程。細胞融合可在基因型相同或不同的細胞中進行。前者形成的融合細胞稱同核體，后者形成的融合細胞稱異核體。采用細胞融合技術，使離體培養(yǎng)的兩個不同個體的細胞發(fā)生融合，形成一個新型的雜交細胞(hybrid cell)是當前生物醫(yī)學中建立新品系細胞的重要手段，也是制備單克隆細胞系的關鍵技術。

十一、組織工程技術

組織工程(tissue engineering)是一門新興學科，是應用生命科學和工程學的原理與技術，在掌握機體正常及病理兩種狀態(tài)下的結構與功能關系基礎上，采用以生物材料為替代物，更新、修復機體損傷或衰老的組織器官。組織工程的核心是建立細胞與生物材料的三維空間復合體，即具有生命力的活體組織，用以對病損組織進行形態(tài)、結構和功能的重建，并達到永久性替代。

組織工程技術的實施須有四個前提條件：①種子細胞：即分裂、增生旺盛的細胞，如人胚干細胞；②細胞間質(zhì)：可以是生物性材料，如牛膠原，或是無毒、可被機體吸收的人工合成的高分子材料，如聚乙醇酸；③構建復合物：在體外讓種子細胞在細胞間質(zhì)上進行三維培養(yǎng)，并形成所需形狀的復合物；④將復合物移植到機體所需的部位。

視　窗

撩開“精子庫”的面紗

籠罩著神秘面紗的精子庫又稱精子銀行。早在1778年，有學者研究發(fā)現(xiàn)，將精子置于冰雪中降溫后再復溫，部分精子仍具有運動能力。在過去的幾十年中研究發(fā)現(xiàn)，低溫可影響細胞的生化進程，利于細胞保存。精子是人體中最耐冷凍的細胞之一，將其置于液氮（-196℃)中保存，細胞進程則處于停滯狀態(tài)，10～20年復蘇后精子仍能保持活力。實踐證明冷凍復蘇后的精子通過人工授精，能夠使人正常受孕，這一研究成果為精子庫的建立奠定了基礎。而最早的人類精子庫是為參戰(zhàn)士兵而建的。

曾獲得諾貝爾獎的美國遺傳學家H.J.Muller，幾十年前提出了一個大膽且頗有爭議的建議——建立“天才”精子庫，專門貯存卓越人士的精子。只有少數(shù)諾貝爾獎獲得者支持并捐獻了自己的精子，貯存于美國加利福尼亞的某精子庫中，人們稱其為“諾貝爾精子庫”。Muller的愿望是美好的，他想把具有卓越才能和優(yōu)良素質(zhì)的人的生殖細胞貯存起來，供人們選擇，以提高人類的基因質(zhì)量，使優(yōu)良性狀延續(xù)，孕育出更多的天才。遺憾的是并沒有“人造諾貝爾才子”降世，因為卓越人士的產(chǎn)生不僅與遺傳有關，更重要的是環(huán)境因素對遺傳的影響，況且這些成功人士一般年齡偏高，甚至年過花甲，而精子的基因突變率與年齡成正比，這使子代出現(xiàn)先天性遺傳病的概率也隨之增高。同時還涉及倫理方面的諸多問題。

國內(nèi)外的相關研究表明，發(fā)達國家的男性，其精子數(shù)量和質(zhì)量都呈現(xiàn)下降趨勢。這與環(huán)境污染、地球變暖、生育年齡推遲有著密切的關系。另外，生活環(huán)境與工作壓力，以及疾病、意外傷害等諸多不可預測的因素，都可能使人們的生育能力發(fā)生變化。而人生的最佳生育時間僅為十幾年，精子庫的建立就是為男士們未雨綢繆，提供 “生殖保險”和“優(yōu)生保險”，以解除后顧之憂。現(xiàn)在精液冷凍技術在醫(yī)學、生物學和畜牧業(yè)等許多領域得到廣泛應用。我國幾個大城市已分別建立了精子庫。