學(xué)習(xí)活動(dòng)5 外植體的褐變、玻璃化及防止

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1．能認(rèn)識(shí)外植體褐變及玻璃化現(xiàn)象。

2．能分析褐變及玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。

3．能制定防止褐變及玻璃化現(xiàn)象的措施。

【學(xué)習(xí)準(zhǔn)備】 培養(yǎng)室、褐變瓶苗、玻璃化瓶苗。

【學(xué)習(xí)過(guò)程】

問(wèn)題1

觀察外植體培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的褐變現(xiàn)象，分析為什么會(huì)褐變？怎樣預(yù)防？

基本知識(shí)

污染、褐變和玻璃化現(xiàn)象被稱(chēng)為植物組織培養(yǎng)的三大難題。

一、外植體褐變及防止

褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，還會(huì)抑制其他酶的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后使培養(yǎng)材料變褐而死亡。在植物組織培養(yǎng)中，控制褐變比控制污染和玻璃化更加困難。因此，能否有效地控制褐變是某些植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

圖4-5-1蝴蝶蘭組培苗的褐變現(xiàn)象

（一）褐變的原因

影響褐變的因素極其復(fù)雜，植物種類(lèi)、基因型、外植體的部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。

1．種類(lèi)和品種

不同植物與品種的褐變程度是不同的，有人把此歸結(jié)為基因型的不同。一般來(lái)說(shuō)，植物材料中單寧類(lèi)和多種羥酚類(lèi)化合物的含量高，易引起外植體材料的嚴(yán)重褐變。多數(shù)木本植物比草本植物易產(chǎn)生褐變，多年生草本植物比一年生草本植物易產(chǎn)生褐變。

2．外植體的生理狀態(tài)和大小

通常幼齡部位產(chǎn)生褐變較輕，隨著組織的老齡化，其木質(zhì)素含量增高，所含醌類(lèi)物質(zhì)增多而褐變加重。因此，在外植體接種時(shí)常需要?jiǎng)內(nèi)[片和大葉片，以切取幼嫩的芽尖或頂芽分生組織（或帶少量葉原基）接種更為理想。

3．外植體取材時(shí)間和部位

一般在春夏季，尤其是春季選取的生長(zhǎng)旺盛的外植體產(chǎn)生褐變較輕，已木栓化或木質(zhì)化的枝條和處于休眠狀態(tài)的芽作為外植體時(shí)褐變嚴(yán)重。這是分生部位接種后形成醌類(lèi)物質(zhì)少、分化部位形成醌類(lèi)物質(zhì)較多的緣故。

4．培養(yǎng)基的成分

外植體的培養(yǎng)基狀態(tài)（固體、半固體、液體培養(yǎng)基）、無(wú)機(jī)鹽濃度、激素種類(lèi)和濃度以及培養(yǎng)基的pH值，都與外植體接種后的褐變程度有關(guān)。

過(guò)高的無(wú)機(jī)鹽濃度會(huì)引起棕櫚科植物外植體酚的氧化而褐變，低鹽培養(yǎng)基，尤其是Mn2+和Cu2+離子濃度較低時(shí)，外植體的褐化程度較輕。例如油棕用MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)容易引起外植體的褐變，而用降低了無(wú)機(jī)鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基時(shí)則可減輕褐變程度，且可獲得愈傷組織和胚狀體。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)時(shí)，培養(yǎng)材料也容易褐變。細(xì)胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，這一現(xiàn)象在甘蔗的組織培養(yǎng)中十分明顯。

培養(yǎng)基的pH值較低時(shí)常有利于減輕外植體的褐變程度。

一般在液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基上褐化程度比在固體培養(yǎng)基上輕。

5．培養(yǎng)條件

溫度過(guò)高、光照過(guò)強(qiáng)、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。

6．材料轉(zhuǎn)移時(shí)間

在同一培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)引起材料的褐變，以至全部死亡。

（二）褐變的防止措施

1．選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基

許多成功的經(jīng)驗(yàn)表明，選擇適宜的外植體并建立最佳的培養(yǎng)條件是防止外植體褐變最主要的手段。外植體材料應(yīng)有較強(qiáng)的分生能力，在最適宜的細(xì)胞脫分化與再分化的培養(yǎng)條件下使外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，便可大大減輕褐變程度。在諸多因子中，較為重要的是適宜的無(wú)機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度及激素水平。在適宜的溫度及黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)可顯著減輕材料的褐變程度。如能在初始培養(yǎng)的1~6周內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，或在150 lx左右的光照強(qiáng)度下進(jìn)行光培養(yǎng)，可抑制酚類(lèi)物質(zhì)氧化。

2．連續(xù)轉(zhuǎn)移

對(duì)易褐變的材料進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移可以減輕醌類(lèi)物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物的毒害作用。在無(wú)刺黑莓的莖尖培養(yǎng)中，接種后1~2d就轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，可明顯減輕褐變程度；在山月桂樹(shù)的莖尖培養(yǎng)中，接種后12~24 h便轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基，然后繼續(xù)每天轉(zhuǎn)移1次，連續(xù)7 d，褐化便得到了完全控制。

3．加入抗氧化劑

在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，或用抗氧化劑進(jìn)行材料的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，可預(yù)防醌類(lèi)物質(zhì)的形成。抗氧化劑包括抗壞血酸（維生素C）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和牛血清白蛋白等。在靜止的液體培養(yǎng)基中加入抗氧化劑比在固體培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，效果要明顯得多。在倒掛金鐘莖尖培養(yǎng)中加入0.01%PVP，對(duì)褐變有抑制作用。

4．加入活性炭

0.1%～0.5%活性炭對(duì)吸附酚類(lèi)氧化物的效果很明顯。在許多熱帶樹(shù)木的組織培養(yǎng)中均曾觀察到活性炭防止外植體褐變的明顯效果。

問(wèn)題2

觀察玻璃化試管苗，分析為什么會(huì)產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象？怎樣預(yù)防？

基本知識(shí)

二、試管苗的玻璃化現(xiàn)象及預(yù)防措施

試管苗玻璃化是指試管苗呈半透明和水漬狀的現(xiàn)象。

與正常苗相比，玻璃化苗最顯著的變化就是其外觀呈半透明狀。此外，玻璃化苗莖尖分生組織相對(duì)較小，并且莖尖發(fā)育部分保持分生組織性的時(shí)期也縮短；葉片表面積縮小或增大，葉片常皺縮并縱向卷曲，并且脆弱易破，顏色不正常；玻璃化苗難以增殖、生根、成苗。玻璃化苗由于生理功能異常，難以移栽成活。因此，玻璃化現(xiàn)象對(duì)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行植物的快速微繁殖是不利的。

（一）玻璃化苗產(chǎn)生的原因

產(chǎn)生玻璃化苗的因素主要有激素濃度、瓊脂濃度、溫度、離子水平、光照時(shí)間、通風(fēng)條件等。

1．激素濃度

激素主要包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，激素濃度升高尤其是細(xì)胞分裂素濃度升高（或細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例高），易導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。產(chǎn)生玻璃化苗的細(xì)胞分裂素濃度因植物種類(lèi)的不同而異。

細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)芽的分化，打破頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腋芽發(fā)生，因而玻璃化苗表現(xiàn)出莖節(jié)較短、分枝較多的特點(diǎn)。

2．瓊脂濃度

培養(yǎng)基中瓊脂濃度低時(shí)玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴(yán)重。隨著瓊脂濃度的升高，玻璃化苗比例減少，但硬化的培養(yǎng)基又會(huì)影響?zhàn)B分的吸收，試管苗生長(zhǎng)減慢，分蘗也減少。因此，瓊脂濃度一定要適當(dāng)。

3．溫度

適宜的溫度可以使試管苗生長(zhǎng)良好。溫度低時(shí)，容易形成玻璃化苗，溫度越低，玻璃化苗的比例越高。隨著溫度升高，玻璃化苗減少，但溫度超過(guò)一定限度后，會(huì)對(duì)試管苗正常的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生影響，反而促進(jìn)玻璃化苗的產(chǎn)生；變溫培養(yǎng)時(shí)，若溫度變化幅度大，容易在瓶壁內(nèi)產(chǎn)生小水滴，增加瓶?jī)?nèi)濕度，提高玻璃化苗發(fā)生率。

4．光照時(shí)間

不同的植物對(duì)光照的要求不同，達(dá)到植物需要的光照時(shí)間，試管苗才能正常生長(zhǎng)。大多數(shù)植物在10～12 h光照下、強(qiáng)度1000～3000 lx時(shí)都能良好生長(zhǎng)。光照不足再加上高溫，極易引起組培苗過(guò)度生長(zhǎng)，加速玻璃化發(fā)生。但是，光照時(shí)數(shù)大于15 h時(shí)，玻璃化苗的比例明顯增加。

5．通風(fēng)條件

試管苗生長(zhǎng)期間要求有足夠的氣體交換，氣體交換的好壞取決于生長(zhǎng)量、瓶?jī)?nèi)空間、培養(yǎng)時(shí)間和瓶蓋種類(lèi)。在一定容量的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，愈傷組織和試管苗生長(zhǎng)越快，越容易形成玻璃化苗。如果培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，易發(fā)生玻璃化。愈傷組織和試管苗長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，不及時(shí)轉(zhuǎn)移，容易出現(xiàn)玻璃化苗。組織培養(yǎng)所用瓶蓋有棉塞、錫箔紙、濾紙、封口紙、牛皮紙、塑料膜等，其中棉塞、濾紙、封口紙、牛皮紙通氣性較好，玻璃化苗的比例較低；而錫箔紙不透氣，影響氣體交換，玻璃化苗增加。用塑料膜封口時(shí)，玻璃化苗劇增。

6．培養(yǎng)基成分

植物生長(zhǎng)需要一定的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，如果營(yíng)養(yǎng)離子之間失去平衡，試管苗生長(zhǎng)就會(huì)受到影響。植物種類(lèi)不同，對(duì)礦物質(zhì)的量、離子形態(tài)、離子間的比例要求不同。如果培養(yǎng)基中離子種類(lèi)及其比例不適合該種植物，玻璃化苗的比例就會(huì)增加。一般認(rèn)為，提高培養(yǎng)基的碳氮比，可以降低玻璃化苗的比例。

7．培養(yǎng)材料

植物種類(lèi)、外植體的類(lèi)型以及大小顯著影響玻璃化苗的產(chǎn)生。外植體越小，玻璃化苗產(chǎn)生率越大，這可能是由于外植體的較老組織中含有防止玻璃化苗產(chǎn)生的物質(zhì)，或者是較大外植體的分生組織遠(yuǎn)離培養(yǎng)基表面，使其生長(zhǎng)環(huán)境的水分狀況得到改善。

（二）玻璃化苗的預(yù)防措施

1．選不易玻璃化的基因型及組織部位做外植體

2．增加自然光，控制光照時(shí)間

自然光中的紫外線(xiàn)能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化，減少玻璃化現(xiàn)象。因此，光照培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)增加自然光，提高光照強(qiáng)度，有助于克服玻璃化。但光照時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，多數(shù)植物以每天光照時(shí)間8~12 h、光照強(qiáng)度1000~3000 lx為宜。

3．改善培養(yǎng)容器的氣體交換

使用棉塞、通氣性好的封口膜封口，增加通氣，盡可能降低培養(yǎng)容器內(nèi)的空氣相對(duì)濕度，改善氧氣供應(yīng)狀況，有助于減少玻璃化現(xiàn)象。

4．提高培養(yǎng)基中瓊脂濃度

適當(dāng)提高瓊脂濃度，有利于減少玻璃化現(xiàn)象。在提高培養(yǎng)基中瓊脂濃度的同時(shí)，要選用含灰量低的瓊脂粉。因?yàn)榄傊s質(zhì)中的Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+等含量高會(huì)影響培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素的含量和比例，進(jìn)而影響玻璃化現(xiàn)象。

5．提高培養(yǎng)基中蔗糖濃度

適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖濃度，可降低培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，減少外植體從培養(yǎng)基中獲得的水分，從而減少玻璃化現(xiàn)象。

6．降低細(xì)胞分裂素濃度

適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素的濃度，同時(shí)注意細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配合以及激素和K+之間的配合，力求兼顧不定芽增殖系數(shù)并控制玻璃化苗的產(chǎn)生。

【思考題】

1．什么是外植體？如何選擇外植體？

2．簡(jiǎn)述外植體接種的技術(shù)步驟。

3．說(shuō)明外植體褐變的原因和防止措施。

4．說(shuō)明玻璃化苗產(chǎn)生的原因和預(yù)防措施。

5．組織培養(yǎng)工作中防止污染的措施有哪些？