學(xué)習(xí)活動(dòng)4 外植體的污染與防止

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1．能認(rèn)識(shí)外植體的真菌、細(xì)菌等污染類型。

2．能正確分析外植體污染的原因。

3．能提出防止外植體污染的措施。

【學(xué)習(xí)準(zhǔn)備】 被真菌、細(xì)菌污染的外植體。

【學(xué)習(xí)過(guò)程】

問(wèn)題

外植體接種后污染的培養(yǎng)基有哪些特征？為什么會(huì)產(chǎn)生污染？

基本知識(shí)

一、污染現(xiàn)象

污染是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。

二、污染產(chǎn)生的原因及防止措施

污染分為細(xì)菌污染和真菌污染兩種情況。

（一）細(xì)菌污染的癥狀及引起的原因

培養(yǎng)材料及培養(yǎng)基上出現(xiàn)黏液狀物體或渾濁的水跡狀痕或發(fā)酵狀泡沫，或在材料附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡，即細(xì)菌污染現(xiàn)象。細(xì)菌污染一般在接種后1~2d可發(fā)現(xiàn)。除了材料帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底會(huì)造成成批接種材料被細(xì)菌污染外，接種人員操作不慎也是造成細(xì)菌污染的重要原因，主要由工具滅菌不徹底以及呼吸時(shí)呼出的細(xì)菌所引起。手接觸培養(yǎng)材料或器皿表面也會(huì)引起污染。因此，要求工作人員嚴(yán)格按照無(wú)菌操作程序操作。

（二）真菌污染的癥狀及引起的原因

培養(yǎng)基和培養(yǎng)物上長(zhǎng)霉，即真菌污染現(xiàn)象。接種后3~5d就可發(fā)現(xiàn)。霉的顏色有黑、黃、白等。真菌污染多由環(huán)境不清潔和空氣污染造成，如接種室的環(huán)境不潔凈，灰塵很多；超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效；培養(yǎng)用的容器口過(guò)大；操作不慎等。

雖然組織培養(yǎng)技術(shù)操作并不難，但對(duì)一些技術(shù)環(huán)節(jié)的要求十分嚴(yán)格，稍有疏忽便會(huì)延誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，甚至導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗，為此必須重視組織培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程中污染帶來(lái)的危害。

圖4-4-1培養(yǎng)材料的真菌污染

（三）組織培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程中污染的來(lái)源

1．外植體自身帶菌

許多植物都栽培在室外，而空氣中有大量微生物存在，這些微生物可通過(guò)植物自然的孔口或傷口進(jìn)入植物內(nèi)部，也有一些兼性腐生菌，可由外植體或通過(guò)相應(yīng)的侵入機(jī)制侵入植株內(nèi)部，如果在接種操作前對(duì)這些認(rèn)識(shí)不足，對(duì)外植體消毒不嚴(yán)，就很容易發(fā)生污染現(xiàn)象。

2．培養(yǎng)基或接種工具滅菌不徹底

培養(yǎng)基滅菌過(guò)程中，滅菌時(shí)間過(guò)短、滅菌時(shí)溫度達(dá)不到要求、滅菌鍋壓力記數(shù)不準(zhǔn)等因素都有可能導(dǎo)致培養(yǎng)基滅菌不徹底，使一些病原微生物殘留在培養(yǎng)基中，從而造成污染。使用滅菌不徹底的接種工具、滅過(guò)菌的接種工具存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)在生產(chǎn)中造成污染，所以要做好培養(yǎng)基和接種工具的滅菌工作。

3．接種室消毒不嚴(yán)

在組織培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程中，除了植物本身外，大部分污染來(lái)自接種室。因?yàn)樵诮臃N室中，未過(guò)濾的空氣中含有大量的微生物，這些微生物可隨著操作人員或植株接觸而發(fā)生污染，所以接種室消毒不嚴(yán)也易引發(fā)污染。

4．人員因素

在整個(gè)操作室內(nèi)，人員是最大的帶菌者，不管是毛發(fā)還是衣服等，都隱藏著數(shù)不清的微生物。這些微生物的存在都可能造成一定的危害。為此，在進(jìn)入操作室前，接種人員的工作服、鞋帽必須進(jìn)行消毒處理，進(jìn)入接種室必須換上消毒過(guò)的鞋帽；接種前，接種人員必須認(rèn)真洗手，還要用70%酒精棉球擦拭雙手，這樣可在一定程度上減輕污染的危害。

5．超凈工作臺(tái)上的濾網(wǎng)過(guò)濾不徹底

超凈工作臺(tái)使用過(guò)久或保養(yǎng)不當(dāng)，造成濾網(wǎng)壞掉或灰塵過(guò)多，導(dǎo)致在接種操作時(shí)對(duì)空氣過(guò)濾不徹底，也易產(chǎn)生污染。

（四）防止污染的方法

1．認(rèn)真做好外植體的選擇和消毒工作

外植體的選擇要考慮選擇的時(shí)間和部位，盡量選取帶菌少的材料。一般植株生長(zhǎng)旺盛的季節(jié)（如春季和夏季），病原微生物數(shù)量相對(duì)少些，幼嫩部位病原微生物也相對(duì)少些，且組織活力旺盛。另外要做好外植體的消毒滅菌工作，消毒劑和消毒時(shí)間要根據(jù)外植體的幼嫩程度和部位確定，一般要求既將外植體表面的微生物殺死，又盡可能少傷害外植體組織和表層細(xì)胞。在生產(chǎn)實(shí)踐中防止外植體污染，也可采用多次滅菌和交替滅菌相結(jié)合的辦法，最終達(dá)到消滅雜菌的目的。

2．改善接種室和培養(yǎng)室的環(huán)境條件

與外植體自身帶菌所產(chǎn)生的污染相比，操作污染和環(huán)境污染是可以避免的。生產(chǎn)中要做好接種室與培養(yǎng)室消毒工作，定期熏蒸滅菌，減少環(huán)境中的微生物數(shù)量，減輕污染的危害。為此，接種前要認(rèn)真做好接種室消毒工作，超凈工作臺(tái)在接種前要認(rèn)真擦洗，紫外線燈要開(kāi)20~30 min。培養(yǎng)室的相對(duì)濕度應(yīng)控制在70%左右。放到超凈工作臺(tái)上的每件物品都要先用75%酒精認(rèn)真擦洗一遍，只有這樣才能在一定程度上控制污染程度。

3．操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程

接種人員在接種操作中應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。接種人員的工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品要定期進(jìn)行濕熱滅菌。在超凈工作臺(tái)的操作區(qū)內(nèi)不要放置過(guò)多的備用物品，避免氣流被擋住而產(chǎn)生污染。定期清洗或更換超凈工作臺(tái)過(guò)濾器。接種前15~20 min打開(kāi)風(fēng)機(jī)，風(fēng)速調(diào)整到20~30 m/min，并對(duì)臺(tái)面用75%酒精噴霧消毒。工作人員進(jìn)入操作室前必須對(duì)工作服、鞋帽進(jìn)行消毒處理，進(jìn)入接種室必須換上消毒過(guò)的鞋帽。接種前，接種人員必須認(rèn)真洗手，還要用70%酒精棉球擦拭雙手。只有接種過(guò)程中嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，才可避免人為因素造成的污染。

4．培養(yǎng)基及接種工具要嚴(yán)格滅菌，確保滅菌質(zhì)量

在對(duì)培養(yǎng)基和接種工具滅菌時(shí)，要先檢查滅菌鍋的使用情況，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題立即檢修。滅菌過(guò)程中要保證滅菌應(yīng)達(dá)到的壓力、時(shí)間，確保滅菌質(zhì)量。培養(yǎng)基一般要求在汽相121℃條件下滅菌20~25 min。壓力表降到零后不能馬上出鍋，防止外界冷空氣倒吸入已滅菌的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)引起真菌污染，應(yīng)待鍋內(nèi)稍冷卻后再出鍋。培養(yǎng)容器封口使用的塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等材料，在使用前要認(rèn)真做好清洗和消毒工作，不符合要求堅(jiān)決不用。在分裝培養(yǎng)基時(shí)，勿觸瓶口，防止培養(yǎng)基黏在瓶口上，引起污染；瓶口封好后要檢查封口是否破損，瓶口綁扎位置是否適當(dāng)，松緊是否適宜。已污染的組織培養(yǎng)瓶要經(jīng)高壓滅菌后再清洗，防止污染源擴(kuò)散。

5．在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素

這是目前較常用的方法，抗生素可以直接加到培養(yǎng)基中，也可以用抗生素噴灑或浸泡外植體。植物種類不同，所用抗生素的種類、濃度和處理時(shí)間也不同。一般情況下，為消除革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)某些木本植物莖段組培苗的污染，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素、頭孢等混合物。另外，用頭孢菌素Ⅱ消除某些觀賞植物外植體中的內(nèi)生菌也有非常明顯的效果。

6．利用培養(yǎng)基中高鹽或高糖的濃度，抑制微生物生長(zhǎng)

培養(yǎng)基中適當(dāng)增大鹽或糖的濃度可抑制微生物生長(zhǎng)，單寧酸存在時(shí)也可以達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的效果。

7．減少培養(yǎng)基中某些有機(jī)成分，可抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖

培養(yǎng)基中有機(jī)物如維生素B1、維生素B6、煙酸等有機(jī)成分，是某些細(xì)菌生長(zhǎng)的必需物質(zhì)，去除這些有機(jī)物后，細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)繁殖，逐漸死亡。這樣也可在一定程度上減輕污染所帶來(lái)的危害。

總之，組織培養(yǎng)中污染很容易發(fā)生，只有思想上高度重視，行動(dòng)上嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，才能在一定程度上減輕污染所帶來(lái)的危害。