學(xué)習(xí)活動(dòng)3 外植體接種與培養(yǎng)

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1．樹(shù)立起無(wú)菌操作的觀念。

2．能正確使用超凈工作臺(tái)。

3．能正確進(jìn)行外植體接種。

【學(xué)習(xí)準(zhǔn)備】 培養(yǎng)基、外植體、超凈工作臺(tái)、接種器械滅菌器、鑷子、手術(shù)剪、接種刀、無(wú)菌牛皮紙、無(wú)菌濾紙、外植體滅菌劑、75%酒精紗布2份、95%酒精、無(wú)菌水、廢液收集瓶。

【學(xué)習(xí)過(guò)程】

問(wèn)題1

什么是外植體接種？

基本知識(shí)

一、外植體接種的概念

接種是將消毒好的外植體在超凈工作臺(tái)上分離，切割成適宜的大小，并放入培養(yǎng)基的無(wú)菌操作過(guò)程。

二、外植體接種前的準(zhǔn)備工作

1．在接種前2~3個(gè)星期用甲醛熏蒸接種室；每立方米空間用10 mL甲醛溶液加5 g高錳酸鉀，密閉熏蒸24 h，然后打開(kāi)房門(mén)，放走甲醛氣體。平時(shí)的常規(guī)消毒可用70%酒精或0.1%新潔爾滅噴霧，使空氣中的灰塵顆粒沉降。

2．將培養(yǎng)基和接種工具放進(jìn)超凈工作臺(tái)，接種前1 h打開(kāi)紫外線燈進(jìn)行滅菌，30 min后關(guān)掉。

3．在接種前20 min打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)。

4．接種員洗凈雙手，帶上接種材料，在緩沖室換好專用實(shí)驗(yàn)服，戴上口罩，并換上拖鞋等，進(jìn)入接種室。

5．上超凈工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處，然后擦拭工作臺(tái)面。

6．用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭到尾灼燒一遍，然后反復(fù)灼燒工具尖端處，培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干，或用組織培養(yǎng)專用滅菌器對(duì)工具進(jìn)行消毒滅菌。

7．按規(guī)范放好各種用品和接種材料，一般中間放置無(wú)菌紙或培養(yǎng)皿，右邊放置滅菌器、酒精燈和接種材料，左邊放置包扎用品及培養(yǎng)基。

三、接種

1．首先將消毒好的外植體材料放在無(wú)菌紙或滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿或小瓷碟中進(jìn)行切割，切塊大小要適中。外植體的大小一般以0.5~1 cm為宜。具體來(lái)說(shuō)，葉片、花瓣等為20~25 mm2的小方塊，莖段長(zhǎng)0.5~1 cm，莖尖分生組織長(zhǎng)0.2~0.3 mm，并帶1~2個(gè)葉原基。

注意：在切割過(guò)程中，剪刀和鑷子每使用片刻就應(yīng)擦干凈放入95%酒精中，待灼燒放涼備用。通常兩套工具交換使用，可提高工作效率，并防止連續(xù)污染（也稱為交叉污染）的發(fā)生。如鑷子夾了未消毒好的材料，再夾其他材料，就會(huì)造成交叉污染。又如剪刀或鑷子碰到臺(tái)面、管（瓶）的外壁、棉塞，以及手拿的部位過(guò)近，未能充分灼燒，連續(xù)使用過(guò)久等，都易引起交叉污染。經(jīng)常灼燒操作工具可減少這種污染，即便污染，也是一個(gè)個(gè)獨(dú)立發(fā)生的，不會(huì)連續(xù)成批地污染。

圖4-3-1葉片外植體培養(yǎng)

2．用上述灼燒滅菌過(guò)的鑷子將切割好的外植體材料植入培養(yǎng)基表面。具體操作是：左手幾乎水平拿試管或培養(yǎng)瓶，靠近酒精燈焰，將管口外部在燈焰上灼燒數(shù)秒鐘（管口不能灼燒滅菌，否則棉塞易燒壞），將灰塵、雜菌等固定在原處，此時(shí)在燈焰附近用右手慢慢打開(kāi)瓶蓋或棉塞，以免空氣速向管內(nèi)沖擊，導(dǎo)致管口灰塵等沖入，造成污染。瓶蓋或棉塞始終拿在手上，這時(shí)再將管口在燈焰上旋轉(zhuǎn)，使其充分灼燒滅菌，主要注意管口附近，包括管口內(nèi)表面，然后用右手拇、食、中指拿鑷子夾一塊外植體送入管內(nèi)，輕輕插在培養(yǎng)基上，再輕輕蓋上瓶蓋或塞上棉塞，最后將管口及棉塞在燈焰上灼燒數(shù)秒，灼燒時(shí)應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞。鑷子灼燒后放回架上，這樣便完成了一瓶的接種操作，接著再接種第二瓶，如此一直到外植體全部接種完。

操作時(shí)注意瓶蓋、棉塞不能亂放，要仔細(xì)理解并牢固樹(shù)立無(wú)菌操作觀念，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作。

問(wèn)題2

外植體接種應(yīng)遵循怎樣的操作流程？

基本操作

四、外植體接種的基本操作流程

圖4-3-2外植體接種的基本操作流程

五、接種后的工作

1．接種完畢要清理干凈工作臺(tái)，關(guān)掉工作臺(tái)的電源。

2．及時(shí)將接種好的材料放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

3．接種用過(guò)的器皿及有關(guān)用品應(yīng)及時(shí)清洗。

六、培養(yǎng)

接種后的外植體應(yīng)放在培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件要根據(jù)植物對(duì)環(huán)境條件的不同需求進(jìn)行調(diào)控，其中最主要的條件是光照、溫度、濕度、氧氣和培養(yǎng)基的pH值。

1．光照

植物組織培養(yǎng)是在含糖的培養(yǎng)基上進(jìn)行的，所以光照的主要作用在形態(tài)建成的誘導(dǎo)方面。光對(duì)組織培養(yǎng)的影響主要表現(xiàn)在光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和光質(zhì)三個(gè)方面。

（1）光照時(shí)間：大多數(shù)植物選擇通過(guò)一定的光暗周期來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)。每天14~16 h光照，8~10 h黑暗，即可滿足大多數(shù)植物生長(zhǎng)發(fā)育的需要。研究表明，對(duì)短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗培養(yǎng)下比在光照下生長(zhǎng)更好，如紅花、烏飯樹(shù)的愈傷組織。

（2）光照強(qiáng)度：光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，尤其是對(duì)外植體細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)得粗壯，而光照強(qiáng)度較弱，幼苗容易徒長(zhǎng)。對(duì)絕大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，1000~5000 lx的光照強(qiáng)度即能滿足一般組織培養(yǎng)的需要。

（3）光質(zhì)：光質(zhì)通常指不同波長(zhǎng)的光波。光質(zhì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化有明顯的影響。一般紅光可引起細(xì)胞干物質(zhì)的重量增加并利于根的形成；藍(lán)光可引起細(xì)胞中的質(zhì)體轉(zhuǎn)化為葉綠體，對(duì)促進(jìn)腋芽、不定芽生長(zhǎng)有明顯的作用。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后分化出愈傷組織，但在藍(lán)光下培養(yǎng)，十幾周后才出現(xiàn)愈傷組織；唐菖蒲子球塊接種15 d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。倪德祥等對(duì)香石竹的研究表明，白光下生長(zhǎng)量最大，紅、黃、綠、藍(lán)光對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用，單色光對(duì)葉綠素合成有抑制作用，葉綠素的合成需要在復(fù)合光條件下完成。

2．溫度

在植物組織培養(yǎng)中，不同植物繁殖的最適溫度不同，一般在23℃~28℃之間。通常低于15℃時(shí)，培養(yǎng)的外植體組織生長(zhǎng)緩慢或出現(xiàn)停滯，但高于35℃對(duì)生長(zhǎng)也不利。植物組織培養(yǎng)過(guò)程所需溫度與其原產(chǎn)地有關(guān)，一般原產(chǎn)于熱帶或亞熱帶的植物，培養(yǎng)時(shí)需要較高的溫度，即（28±2）℃；生長(zhǎng)在高海拔和較低溫度環(huán)境的植物，則培養(yǎng)的環(huán)境溫度可適當(dāng)?shù)托?，因?yàn)樵谳^高溫度條件下組培苗生長(zhǎng)緩慢。

3．濕度

植物組織培養(yǎng)中的濕度主要有兩個(gè)方面：一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件，二是培養(yǎng)室的濕度條件。培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度主要受培養(yǎng)基影響，相對(duì)濕度可達(dá)100%，而培養(yǎng)室的濕度隨季節(jié)有很大變動(dòng)，它可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%~80%的相對(duì)濕度。培養(yǎng)室的濕度過(guò)高過(guò)低都不利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，過(guò)低會(huì)造成培養(yǎng)基失水，從而改變各種成分的濃度，使?jié)B透壓升高，影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化；過(guò)高又會(huì)造成雜菌滋生，導(dǎo)致污染。

4．通氣狀況

培養(yǎng)容器內(nèi)的氣體成分會(huì)影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和分化。氧氣是植物組織培養(yǎng)必需的，在接種時(shí)應(yīng)避免把整個(gè)外植體全部埋入培養(yǎng)基中，以免缺氧。在靜止的液體培養(yǎng)基中宜架上濾紙橋，由濾紙的浸潤(rùn)提供水分和營(yíng)養(yǎng)。另外，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，瓶中可能有乙烯產(chǎn)生，而且在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)物本身也會(huì)釋放乙烯和高濃度的二氧化碳。高濃度的乙烯對(duì)正常的形態(tài)建成是不利的，會(huì)阻礙培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，甚至?xí)?duì)培養(yǎng)物產(chǎn)生毒害作用。

5．培養(yǎng)基的pH值

外植體的培養(yǎng)增殖都要求一定的pH值。通常一般培養(yǎng)基的pH值在5.6~6.0之間。如果pH值不適則直接影響外植體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響外植體的脫分化、增殖和器官形成。不過(guò)pH值對(duì)不同植物的影響會(huì)有差異，有的宜偏酸，有的宜偏堿，在實(shí)際工作中應(yīng)依不同植物而調(diào)整。