學(xué)習(xí)任務(wù)4外植體培養(yǎng)

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1．掌握外植體選擇的原則。

2．能正確選擇外植體。

3．能正確清洗外植體。

4．能正確進(jìn)行外植體表面滅菌及接種。

5．能針對(duì)外植體培養(yǎng)過(guò)程中的污染現(xiàn)象采取相應(yīng)的防治措施。

6．能防止外植體培養(yǎng)過(guò)程中的褐變及玻璃化現(xiàn)象。

【工作情境】 一園林公司從外地引進(jìn)優(yōu)良的園林綠化樹(shù)種北海道黃楊，該公司得知我校有植物組織培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)室，與我校聯(lián)系共同開(kāi)發(fā)該樹(shù)種的組培育苗技術(shù)。我們認(rèn)為這是一個(gè)很好的校企合作機(jī)會(huì)，同意合作，并著手技術(shù)研發(fā)。該項(xiàng)工作從外植體的選擇開(kāi)始，建立無(wú)菌培養(yǎng)物，誘導(dǎo)芽增殖，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根，移栽成活，并建立快繁技術(shù)體系。

【工作流程】

圖4-1外植體培養(yǎng)工作流程圖

學(xué)習(xí)活動(dòng)1 外植體的選擇、清洗與消毒

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】 1．掌握外植體選擇的原則。

2．能正確清洗外植體。

3．能正確對(duì)外植體進(jìn)行消毒。

【學(xué)習(xí)準(zhǔn)備】 北海道黃楊苗木、洗衣粉、0.1%氯化汞、75%酒精、自來(lái)水、毛刷、瓷缸。

【學(xué)習(xí)過(guò)程】

問(wèn)題1

你了解北海道黃楊這一綠化樹(shù)種嗎？見(jiàn)到過(guò)有關(guān)其植物組織培養(yǎng)的研究報(bào)道嗎？

獲取信息

北海道黃楊為大葉黃楊的栽培品種，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬的長(zhǎng)綠闊葉樹(shù)種，原產(chǎn)于日本北海道札幌市，樹(shù)枝挺拔，可修剪整形。在城市公園中可孤植、列植，也可群植。能耐-23.9℃低溫，對(duì)干旱和鹽堿的忍受能力比普通黃楊強(qiáng)。其主要特點(diǎn)為：頂端優(yōu)勢(shì)明顯，表現(xiàn)出優(yōu)良苗木特性。長(zhǎng)勢(shì)較快，年生長(zhǎng)量最高可達(dá)170 cm，平均年生長(zhǎng)量70 cm,5年生苗可達(dá)3m以上。入冬后成熟的果實(shí)開(kāi)裂，露出紅色假種皮，鑲嵌在綠葉叢中，觀賞價(jià)值極高，被譽(yù)為“申奧樹(shù)”，特別適合在北方冬季寒冷、干旱的地區(qū)種植。其根、皮、果可入藥，治療燙傷極佳。

北海道黃楊的繁殖方法主要有扦插、組織培養(yǎng)、嫁接等。用扦插、嫁接方法繁殖，年增殖率低，還會(huì)破壞已長(zhǎng)成之植株。組織培養(yǎng)一年四季均可進(jìn)行，而且繁殖速度最快，苗木壯實(shí)，幾乎不攜帶病蟲(chóng)害。因此，建立北海道黃楊的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，對(duì)該樹(shù)種在本地區(qū)的推廣具有重要作用。

現(xiàn)提供北海道黃楊組織培養(yǎng)的研究資料。

一、初代培養(yǎng)

1．外植體的選擇

選擇健壯、品質(zhì)優(yōu)良的北海道黃楊新品種，盆栽經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間后，選用帶有飽滿(mǎn)而未萌發(fā)側(cè)芽的當(dāng)年生嫩莖做外植體，經(jīng)清洗、表面滅菌后，接種于培養(yǎng)基上。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枝條中部的側(cè)芽萌發(fā)最快，產(chǎn)生芽叢數(shù)量較多且苗壯，生長(zhǎng)速度快。

2．培養(yǎng)基選擇及外植體培養(yǎng)

北海道黃楊整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程都選用MS基本培養(yǎng)基，再加入適量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。外植體培養(yǎng)所加的植物激素，一般只需細(xì)胞分裂素（6-BA）一種即可。將外植體接種在適宜的培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)室的溫度為（25±3）℃，光照強(qiáng)度為1000~1600 lx，光照時(shí)間為12~15 h/d。20 d后芽開(kāi)始萌發(fā)，40 d可形成芽叢2~3個(gè)，60 d苗高2~3.5 cm。不同濃度的6-BA對(duì)北海道黃楊外植體的作用效果見(jiàn)表4-1-1。

表4-1-1不同濃度的6-BA對(duì)北海道黃楊外植體的作用效果

從表4-1-1可知，6-BA的濃度對(duì)外植體的萌發(fā)有明顯的影響，在無(wú)6-BA的培養(yǎng)基上，北海道黃楊外植體不萌發(fā)，隨著6-BA濃度的增高，芽叢數(shù)量及苗高逐漸增加，但超過(guò)一定量又表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，因此，適合北海道黃楊外植體的培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 0.5~0.8 mg/L。

二、繼代培養(yǎng)（莖芽增殖）

將初代培養(yǎng)所獲得的無(wú)菌苗從原莖段上切下來(lái)，切成1.5 cm長(zhǎng)的小段，轉(zhuǎn)接到MS+細(xì)胞分裂素+生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，促使嫩莖長(zhǎng)出更多的側(cè)芽，原莖段棄去。經(jīng)50 d左右第一代繼代培養(yǎng)可獲得4~6株具有嫩梢的試管苗（每瓶），以后每隔6~7周轉(zhuǎn)接繼代一次，可使無(wú)菌試管苗迅速、健壯增殖，數(shù)量不斷擴(kuò)大。莖芽增殖過(guò)程中，培養(yǎng)基中要加入適量的細(xì)胞分裂素（6-BA），以促進(jìn)側(cè)芽形成，同時(shí)加入少量的生長(zhǎng)素類(lèi)藥劑（IAA、NAA），以促進(jìn)幼苗健壯生長(zhǎng)。培養(yǎng)室條件同初代培養(yǎng)。不同濃度的6-BA、NAA對(duì)北海道黃楊試管苗的莖芽增殖分化及苗的健壯生長(zhǎng)作用效果見(jiàn)表4-1-2、表4-1-3。

表4-1-2以MS+NAA 0.05 mg/L為基礎(chǔ)，不同濃度的6-BA對(duì)北海道黃楊的作用效果

表4-1-3以MS+6-BA 1.0 mg/L為基礎(chǔ)，不同濃度的NAA對(duì)北海道黃楊的作用效果

由表4-1-2、表4-1-3可知，6-BA對(duì)北海道黃楊莖芽增殖有明顯影響，NAA在一定范圍內(nèi)對(duì)增殖的影響不顯著，但隨著NAA濃度的增高，愈傷組織產(chǎn)生數(shù)量逐漸增多，同時(shí)NAA濃度過(guò)高會(huì)對(duì)嫩芽的增殖和伸長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。因此，北海道黃楊莖芽增殖階段培養(yǎng)基配方以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L效果較好。

三、生根培養(yǎng)

通過(guò)繼代培養(yǎng)獲得的試管苗一般為無(wú)根苗，因?yàn)樵谇o芽增殖階段要控制根的產(chǎn)生，以減少對(duì)養(yǎng)分的消耗。當(dāng)無(wú)根苗的數(shù)量達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期數(shù)量時(shí)，即可進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基選用1/2 MS或1/4 MS培養(yǎng)基，植物激素一般只加入生長(zhǎng)素（IBA、NAA），培養(yǎng)基中再加300 mg/L活性炭，效果更好。選取2~3 cm高的健壯小苗接種于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室的溫度控制在28℃~30℃，光照強(qiáng)度增加至1600~2000 lx，光照時(shí)間延長(zhǎng)至16 h/d,15 d即可產(chǎn)生根原基，20 d左右可長(zhǎng)成1~2 mm的白色正常根系，根系較發(fā)達(dá)，每株苗均在2~6根。不同濃度的生長(zhǎng)素對(duì)北海道黃楊生根的作用效果見(jiàn)表4-1-4。

表4-1-4以1/2 MS為基礎(chǔ)，不同濃度的生長(zhǎng)素對(duì)北海道黃楊生根的作用效果

由表4- 1- 4可知，北海道黃楊生根培養(yǎng)基以1/2 MS+IBA 0.5 mg/L或1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L效果較好。

四、移栽管理

試管苗合適的移栽時(shí)間是根原基突起或長(zhǎng)出1~2 mm的短根時(shí)，此時(shí)移栽既容易清洗，又不傷根，移栽成活率較高。

1．移栽基質(zhì)：組培苗的移栽基質(zhì)應(yīng)疏松透氣，有一定的保水、保肥能力，而且容易進(jìn)行滅菌處理。選用北海道黃楊移栽基質(zhì)時(shí)，營(yíng)養(yǎng)杯底部裝營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（田園土∶粗沙=1∶1），上部2~3 cm裝珍珠巖。

2．移栽技術(shù)：將已生根的試管苗放在溫室中煉苗3~5d，然后移栽。移栽時(shí)，取出的試管苗首先用0.1%多菌靈溶液輕輕洗掉根部的培養(yǎng)基，然后種入經(jīng)過(guò)消毒滅菌的基質(zhì)中。

移栽后最初幾天要求保持高濕（相對(duì)濕度90%~100%），可以在大棚內(nèi)設(shè)小拱棚，每天噴霧3~4次，并且注意通風(fēng)和防治病菌，可用0.1%多菌靈溶液定期（每周1~2次）噴灑。當(dāng)試管苗適應(yīng)了新的環(huán)境后，再逐漸降低空氣濕度，最終過(guò)渡到可在正常的溫室或自然條件下生長(zhǎng)。

移栽過(guò)程中應(yīng)避免強(qiáng)烈的直射光，以較高強(qiáng)度的散射光為好，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，再逐漸增加光照強(qiáng)度。溫室溫度控制在18℃~20℃為宜。1個(gè)月后，進(jìn)行第二次移栽，實(shí)行正常管理。移栽成活率可達(dá)到85%以上。

基本知識(shí)

一、外植體的選擇

外植體是指植物組織培養(yǎng)中第一次接種用的各種材料，包括植物體的各種器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。

從理論上講，植物細(xì)胞具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體。但實(shí)際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養(yǎng)的難易程度不同。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。

1．選擇優(yōu)良的種質(zhì)及母株

無(wú)論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，還是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)、特殊的基因型和生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲(chóng)害植株。尤其是進(jìn)行離體快繁，只有選取優(yōu)良的種質(zhì)和基因型，離體快繁出來(lái)的種苗才能轉(zhuǎn)化成商品；生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株及器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后容易成功。

北海道黃楊是優(yōu)良綠化樹(shù)種，特別適合在北方冬季寒冷、干旱的地區(qū)栽植，因此，建立北海道黃楊的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，對(duì)該樹(shù)種在本地區(qū)的推廣具有重要作用。

2．選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)期

組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)發(fā)育階段。對(duì)大多數(shù)植物而言，應(yīng)在其開(kāi)始生長(zhǎng)或生長(zhǎng)旺季采樣，此時(shí)材料微生物侵染比較少，同時(shí)內(nèi)源激素含量高，容易分化，不僅成活率高，而且生長(zhǎng)速度快，增殖率高。花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核靠邊期取材，這時(shí)比較容易形成愈傷組織。百合在春夏季采集的鱗莖、葉片，在不加生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中可自由地生長(zhǎng)、分化，其他季節(jié)則不能。葉子花的腋芽培養(yǎng)，如果在11月至翌年2月間采集，則腋芽萌發(fā)非常遲緩；在3~8月間采集，則萌發(fā)數(shù)目多，萌發(fā)速度快。對(duì)多數(shù)一年生的花卉植物來(lái)說(shuō)，雖然無(wú)明顯的生長(zhǎng)期和休眠期，但仍以幼嫩的組織和器官為好。北海道黃楊選擇健壯的植株，經(jīng)室內(nèi)盆栽培養(yǎng)一段時(shí)間后，形成當(dāng)年生嫩莖，此時(shí)進(jìn)行組織培養(yǎng)最適宜。

3．選取適宜的大小

培養(yǎng)材料的大小根據(jù)植物種類(lèi)、器官和培養(yǎng)目的來(lái)確定。通常情況下，快速繁殖時(shí)葉片、花瓣等面積為20~25 mm2，其他培養(yǎng)材料的長(zhǎng)度為0.5~1 cm。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。莖尖分生組織帶1~2個(gè)葉原基，長(zhǎng)度為0.2~0.3 mm。材料太大，不易徹底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難以成活。

二、外植體的取材部位

植物組織培養(yǎng)的材料幾乎包括了植物體的各個(gè)部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。

木本植物、較大的草本植物一般選取莖段比較適宜，其能在培養(yǎng)基中萌發(fā)側(cè)芽，進(jìn)一步發(fā)育出繁殖材料，如月季、黃楊、變?nèi)~木等。一些草本植物本身矮小，或缺乏顯著的莖，一般可選用葉片、葉柄、花葶或花瓣等做外植體，如非洲菊、紫羅蘭、康乃馨、秋海棠、菊花等。北海道黃楊選用帶有飽滿(mǎn)而未萌發(fā)側(cè)芽的當(dāng)年生嫩莖做外植體，取得了良好效果。

圖4-1-1月季外植體培養(yǎng)

1．莖尖

莖尖不僅生長(zhǎng)速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，而且莖尖培養(yǎng)是獲得脫毒苗木的有效途徑，因此莖尖是植物組織培養(yǎng)中最常用的外植體。

2．節(jié)間部

大部分果樹(shù)和花卉等植物，新梢的節(jié)間部是組織培養(yǎng)較好的材料。新梢節(jié)間部不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強(qiáng)，因此是常用的組織培養(yǎng)材料。

3．葉片和葉柄

葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實(shí)驗(yàn)操作方便，是植物組織培養(yǎng)中常用的材料，尤其是近年在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，以葉片為試驗(yàn)材料的報(bào)道很多。

4．鱗片

水仙、百合、蔥、蒜、風(fēng)信子等鱗莖類(lèi)植物常以鱗片為材料。

5．其他

種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養(yǎng)的材料。

但是，不同種類(lèi)的植物以及同種植物不同的器官對(duì)誘導(dǎo)條件的反應(yīng)是不一致的。如百合科植物風(fēng)信子、虎眼萬(wàn)年青等比較容易形成再生小植株，而郁金香就比較困難。百合鱗莖的鱗片外層比內(nèi)層再生能力強(qiáng)，下段比中、上段再生能力強(qiáng)。選取材料時(shí)要對(duì)所培養(yǎng)植物各部位的誘導(dǎo)及分化能力進(jìn)行比較，從中篩選出合適的、最易表達(dá)全能性的部位作為外植體。

三、外植體的消毒

植物組織培養(yǎng)用的外植體大部分取自田間，表面附著大量的微生物，這是組織培養(yǎng)的一大障礙。因?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的，所以無(wú)菌的外植體是取得組織培養(yǎng)成功的基本保證。接種培養(yǎng)前必須對(duì)材料進(jìn)行消毒處理，消毒要求既把材料表面的各種微生物殺滅，又不能損傷或只輕微損傷材料而不影響其生長(zhǎng)。因此，外植體的消毒處理是植物組織培養(yǎng)工作中的重要環(huán)節(jié)。

1．外植體的沖洗、刷洗

植株在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到土壤、肥料中雜菌的污染，所以采回并修剪好的外植體應(yīng)首先用自來(lái)水沖洗，然后用濃洗衣粉水浸泡，用軟毛刷輕輕刷洗后，再用清水沖洗干凈。

2．常用的消毒劑及其效果比較

不同的外植體，不同年齡以及不同季節(jié)選取的外植體，消毒方法也不相同。首先是消毒劑的種類(lèi)、濃度不同，其次是消毒的時(shí)間不同，最終是消毒效果也不同。

常用的消毒劑如表4-1-5所示。理想的消毒劑應(yīng)消毒效果好，易被無(wú)菌水沖洗掉或能自行分解，對(duì)材料損傷小，對(duì)人體及其他生物無(wú)害，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉。

表4-1-5常用消毒劑的使用方法及效果

（1）酒精：酒精是最常用的表面消毒劑，以70%~75%酒精殺菌效果最好，95%或無(wú)水酒精會(huì)使菌體表面蛋白質(zhì)快速脫水凝固，形成一層干燥膜，阻止酒精的繼續(xù)滲入，殺菌效果大大降低。

酒精具有較強(qiáng)的穿透力，可使菌體蛋白質(zhì)變性，殺菌效果好。同時(shí)它還具有較強(qiáng)的濕潤(rùn)作用，可排除材料上的空氣，有利于其他消毒劑的滲入。但酒精對(duì)植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物材料的生長(zhǎng)會(huì)受到影響，甚至被酒精殺死，使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間。但酒精不能徹底消毒，一般不單獨(dú)使用，多與其他消毒劑配合使用。

（2）升汞：又稱(chēng)氯化汞，Hg2+可以與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，從而殺死菌體。升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無(wú)菌水反復(fù)多次沖洗。升汞對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人畜的毒性極強(qiáng)，使用后應(yīng)做好回收工作。

（3）次氯酸鈉：次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體。其消毒能力很強(qiáng)，不易殘留，對(duì)環(huán)境無(wú)害。但次氯酸鈉溶液堿性很強(qiáng)，對(duì)植物材料也有一定的破壞作用。

（4）漂白粉：漂白粉的有效成分是次氯酸鈣［Ca（ClO）2］，消毒效果很好，對(duì)環(huán)境無(wú)害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。

（5）過(guò)氧化氫：也稱(chēng)雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會(huì)損傷外植體，常用于葉片的消毒。

（6）新潔爾滅：這是一種廣譜表面活性消毒劑，對(duì)絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，殺菌效果好。

3．外植體的消毒方法

（1）莖尖、莖段及葉片等的消毒：消毒前先對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，然后用自來(lái)水沖洗。對(duì)于一些表面不光滑或長(zhǎng)有絨毛的材料，可用洗滌劑清洗，必要時(shí)用毛刷充分刷洗，硬質(zhì)材料可用刀刮。

消毒工作在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，先用70%酒精浸泡10~30 s，以無(wú)菌水沖洗2~3次，然后按材料的老嫩和枝條的堅(jiān)實(shí)程度，分別用2%次氯酸鈉浸泡10~15 min或用0.1%升汞浸泡5~10 min。消毒時(shí)要不斷攪動(dòng)，使植物材料與消毒劑充分接觸。若材料有絨毛，最好在消毒液中加入幾滴Tween-20，最后用無(wú)菌水沖洗3~5次。

（2）果實(shí)及種子的消毒：先用自來(lái)水沖洗10~20 min，再用酒精迅速漂洗一下。果實(shí)用2%次氯酸鈉浸泡10 min，后用無(wú)菌水沖洗2~3次。種子則先用10%次氯酸鈉浸泡20~30 min，難以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10 min。對(duì)于種皮太硬的種子，也可預(yù)先去掉種皮，再用4%次氯酸鈉浸泡8~10 min。

（3）花藥的消毒：用于組織培養(yǎng)的花藥多未成熟，其外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，處于無(wú)菌狀態(tài)。消毒時(shí)將整個(gè)花蕾或幼穗用70%酒精浸泡數(shù)秒鐘，然后用無(wú)菌水沖洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10 min，最后用無(wú)菌水沖洗2~3次。

（4）根及地下部器官的消毒：由于這類(lèi)材料生長(zhǎng)于土壤中，表面帶菌量大，消毒較為困難。可先用自來(lái)水沖洗，軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴(yán)重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸泡5~10 min或2%次氯酸鈉中浸泡10~15 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次。

在操作時(shí)要根據(jù)材料的大小、老嫩、質(zhì)地等差異作出判斷后，再選擇適宜的消毒劑種類(lèi)、濃度和消毒時(shí)間，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果應(yīng)是最大限度殺死材料上的微生物而又對(duì)材料的損傷最小。

問(wèn)題2

外植體消毒滅菌是外植體培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵，那么外植體消毒滅菌工作應(yīng)遵循怎樣的操作流程呢？

基本操作

四、外植體消毒滅菌的操作流程

圖4-1-2外植體消毒滅菌的操作流程