學習任務4外植體培養

【學習目標】 1．掌握外植體選擇的原則。

2．能正確選擇外植體。

3．能正確清洗外植體。

4．能正確進行外植體表面滅菌及接種。

5．能針對外植體培養過程中的污染現象采取相應的防治措施。

6．能防止外植體培養過程中的褐變及玻璃化現象。

【工作情境】 一園林公司從外地引進優良的園林綠化樹種北海道黃楊，該公司得知我校有植物組織培養實訓室，與我校聯系共同開發該樹種的組培育苗技術。我們認為這是一個很好的校企合作機會，同意合作，并著手技術研發。該項工作從外植體的選擇開始，建立無菌培養物，誘導芽增殖，進行繼代培養，誘導生根，移栽成活，并建立快繁技術體系。

【工作流程】

圖4-1外植體培養工作流程圖

學習活動1 外植體的選擇、清洗與消毒

【學習目標】 1．掌握外植體選擇的原則。

2．能正確清洗外植體。

3．能正確對外植體進行消毒。

【學習準備】 北海道黃楊苗木、洗衣粉、0.1%氯化汞、75%酒精、自來水、毛刷、瓷缸。

【學習過程】

問題1

你了解北海道黃楊這一綠化樹種嗎？見到過有關其植物組織培養的研究報道嗎？

獲取信息

北海道黃楊為大葉黃楊的栽培品種，是衛矛科衛矛屬的長綠闊葉樹種，原產于日本北海道札幌市，樹枝挺拔，可修剪整形。在城市公園中可孤植、列植，也可群植。能耐-23.9℃低溫，對干旱和鹽堿的忍受能力比普通黃楊強。其主要特點為：頂端優勢明顯，表現出優良苗木特性。長勢較快，年生長量最高可達170 cm，平均年生長量70 cm,5年生苗可達3m以上。入冬后成熟的果實開裂，露出紅色假種皮，鑲嵌在綠葉叢中，觀賞價值極高，被譽為“申奧樹”，特別適合在北方冬季寒冷、干旱的地區種植。其根、皮、果可入藥，治療燙傷極佳。

北海道黃楊的繁殖方法主要有扦插、組織培養、嫁接等。用扦插、嫁接方法繁殖，年增殖率低，還會破壞已長成之植株。組織培養一年四季均可進行，而且繁殖速度最快，苗木壯實，幾乎不攜帶病蟲害。因此，建立北海道黃楊的組織培養快繁技術體系，對該樹種在本地區的推廣具有重要作用。

現提供北海道黃楊組織培養的研究資料。

一、初代培養

1．外植體的選擇

選擇健壯、品質優良的北海道黃楊新品種，盆栽經室內培養一段時間后，選用帶有飽滿而未萌發側芽的當年生嫩莖做外植體，經清洗、表面滅菌后，接種于培養基上。試驗發現，枝條中部的側芽萌發最快，產生芽叢數量較多且苗壯，生長速度快。

2．培養基選擇及外植體培養

北海道黃楊整個培養過程都選用MS基本培養基，再加入適量的生長調節物質。外植體培養所加的植物激素，一般只需細胞分裂素（6-BA）一種即可。將外植體接種在適宜的培養基上，控制培養室的溫度為（25±3）℃，光照強度為1000~1600 lx，光照時間為12~15 h/d。20 d后芽開始萌發，40 d可形成芽叢2~3個，60 d苗高2~3.5 cm。不同濃度的6-BA對北海道黃楊外植體的作用效果見表4-1-1。

表4-1-1不同濃度的6-BA對北海道黃楊外植體的作用效果

從表4-1-1可知，6-BA的濃度對外植體的萌發有明顯的影響，在無6-BA的培養基上，北海道黃楊外植體不萌發，隨著6-BA濃度的增高，芽叢數量及苗高逐漸增加，但超過一定量又表現為下降趨勢，因此，適合北海道黃楊外植體的培養基配方為：MS+6-BA 0.5~0.8 mg/L。

二、繼代培養（莖芽增殖）

將初代培養所獲得的無菌苗從原莖段上切下來，切成1.5 cm長的小段，轉接到MS+細胞分裂素+生長素的培養基上，促使嫩莖長出更多的側芽，原莖段棄去。經50 d左右第一代繼代培養可獲得4~6株具有嫩梢的試管苗（每瓶），以后每隔6~7周轉接繼代一次，可使無菌試管苗迅速、健壯增殖，數量不斷擴大。莖芽增殖過程中，培養基中要加入適量的細胞分裂素（6-BA），以促進側芽形成，同時加入少量的生長素類藥劑（IAA、NAA），以促進幼苗健壯生長。培養室條件同初代培養。不同濃度的6-BA、NAA對北海道黃楊試管苗的莖芽增殖分化及苗的健壯生長作用效果見表4-1-2、表4-1-3。

表4-1-2以MS+NAA 0.05 mg/L為基礎，不同濃度的6-BA對北海道黃楊的作用效果

表4-1-3以MS+6-BA 1.0 mg/L為基礎，不同濃度的NAA對北海道黃楊的作用效果

由表4-1-2、表4-1-3可知，6-BA對北海道黃楊莖芽增殖有明顯影響，NAA在一定范圍內對增殖的影響不顯著，但隨著NAA濃度的增高，愈傷組織產生數量逐漸增多，同時NAA濃度過高會對嫩芽的增殖和伸長產生抑制作用。因此，北海道黃楊莖芽增殖階段培養基配方以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L效果較好。

三、生根培養

通過繼代培養獲得的試管苗一般為無根苗，因為在莖芽增殖階段要控制根的產生，以減少對養分的消耗。當無根苗的數量達到試驗預期數量時，即可進行生根培養。生根培養基選用1/2 MS或1/4 MS培養基，植物激素一般只加入生長素（IBA、NAA），培養基中再加300 mg/L活性炭，效果更好。選取2~3 cm高的健壯小苗接種于生根培養基上，培養室的溫度控制在28℃~30℃，光照強度增加至1600~2000 lx，光照時間延長至16 h/d,15 d即可產生根原基，20 d左右可長成1~2 mm的白色正常根系，根系較發達，每株苗均在2~6根。不同濃度的生長素對北海道黃楊生根的作用效果見表4-1-4。

表4-1-4以1/2 MS為基礎，不同濃度的生長素對北海道黃楊生根的作用效果

由表4- 1- 4可知，北海道黃楊生根培養基以1/2 MS+IBA 0.5 mg/L或1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L效果較好。

四、移栽管理

試管苗合適的移栽時間是根原基突起或長出1~2 mm的短根時，此時移栽既容易清洗，又不傷根，移栽成活率較高。

1．移栽基質：組培苗的移栽基質應疏松透氣，有一定的保水、保肥能力，而且容易進行滅菌處理。選用北海道黃楊移栽基質時，營養杯底部裝營養基質（田園土∶粗沙=1∶1），上部2~3 cm裝珍珠巖。

2．移栽技術：將已生根的試管苗放在溫室中煉苗3~5d，然后移栽。移栽時，取出的試管苗首先用0.1%多菌靈溶液輕輕洗掉根部的培養基，然后種入經過消毒滅菌的基質中。

移栽后最初幾天要求保持高濕（相對濕度90%~100%），可以在大棚內設小拱棚，每天噴霧3~4次，并且注意通風和防治病菌，可用0.1%多菌靈溶液定期（每周1~2次）噴灑。當試管苗適應了新的環境后，再逐漸降低空氣濕度，最終過渡到可在正常的溫室或自然條件下生長。

移栽過程中應避免強烈的直射光，以較高強度的散射光為好，經過一段時間后，再逐漸增加光照強度。溫室溫度控制在18℃~20℃為宜。1個月后，進行第二次移栽，實行正常管理。移栽成活率可達到85%以上。

基本知識

一、外植體的選擇

外植體是指植物組織培養中第一次接種用的各種材料，包括植物體的各種器官、組織、細胞和原生質體等。

從理論上講，植物細胞具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個細胞和原生質體都可以作為外植體。但實際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養的難易程度不同。為保證植物組織培養獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。

1．選擇優良的種質及母株

無論是離體培養繁殖種苗，還是進行生物技術研究，培養材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優良的種質、特殊的基因型和生長健壯的無病蟲害植株。尤其是進行離體快繁，只有選取優良的種質和基因型，離體快繁出來的種苗才能轉化成商品；生長健壯、無病蟲害的植株及器官或組織代謝旺盛，再生能力強，培養后容易成功。

北海道黃楊是優良綠化樹種，特別適合在北方冬季寒冷、干旱的地區栽植，因此，建立北海道黃楊的組織培養快繁技術體系，對該樹種在本地區的推廣具有重要作用。

2．選擇適當的時期

組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節和生長發育階段。對大多數植物而言，應在其開始生長或生長旺季采樣，此時材料微生物侵染比較少，同時內源激素含量高，容易分化，不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。花藥培養應在花粉發育到單核靠邊期取材，這時比較容易形成愈傷組織。百合在春夏季采集的鱗莖、葉片，在不加生長素的培養基中可自由地生長、分化，其他季節則不能。葉子花的腋芽培養，如果在11月至翌年2月間采集，則腋芽萌發非常遲緩；在3~8月間采集，則萌發數目多，萌發速度快。對多數一年生的花卉植物來說，雖然無明顯的生長期和休眠期，但仍以幼嫩的組織和器官為好。北海道黃楊選擇健壯的植株，經室內盆栽培養一段時間后，形成當年生嫩莖，此時進行組織培養最適宜。

3．選取適宜的大小

培養材料的大小根據植物種類、器官和培養目的來確定。通常情況下，快速繁殖時葉片、花瓣等面積為20~25 mm2，其他培養材料的長度為0.5~1 cm。如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。莖尖分生組織帶1~2個葉原基，長度為0.2~0.3 mm。材料太大，不易徹底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難以成活。

二、外植體的取材部位

植物組織培養的材料幾乎包括了植物體的各個部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。

木本植物、較大的草本植物一般選取莖段比較適宜，其能在培養基中萌發側芽，進一步發育出繁殖材料，如月季、黃楊、變葉木等。一些草本植物本身矮小，或缺乏顯著的莖，一般可選用葉片、葉柄、花葶或花瓣等做外植體，如非洲菊、紫羅蘭、康乃馨、秋海棠、菊花等。北海道黃楊選用帶有飽滿而未萌發側芽的當年生嫩莖做外植體，取得了良好效果。

圖4-1-1月季外植體培養

1．莖尖

莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發生變異，而且莖尖培養是獲得脫毒苗木的有效途徑，因此莖尖是植物組織培養中最常用的外植體。

2．節間部

大部分果樹和花卉等植物，新梢的節間部是組織培養較好的材料。新梢節間部不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，因此是常用的組織培養材料。

3．葉片和葉柄

葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養中常用的材料，尤其是近年在植物的遺傳轉化中，以葉片為試驗材料的報道很多。

4．鱗片

水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。

5．其他

種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養的材料。

但是，不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的。如百合科植物風信子、虎眼萬年青等比較容易形成再生小植株，而郁金香就比較困難。百合鱗莖的鱗片外層比內層再生能力強，下段比中、上段再生能力強。選取材料時要對所培養植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選出合適的、最易表達全能性的部位作為外植體。

三、外植體的消毒

植物組織培養用的外植體大部分取自田間，表面附著大量的微生物，這是組織培養的一大障礙。因為植物組織培養是在無菌條件下進行的，所以無菌的外植體是取得組織培養成功的基本保證。接種培養前必須對材料進行消毒處理，消毒要求既把材料表面的各種微生物殺滅，又不能損傷或只輕微損傷材料而不影響其生長。因此，外植體的消毒處理是植物組織培養工作中的重要環節。

1．外植體的沖洗、刷洗

植株在生長過程中會受到土壤、肥料中雜菌的污染，所以采回并修剪好的外植體應首先用自來水沖洗，然后用濃洗衣粉水浸泡，用軟毛刷輕輕刷洗后，再用清水沖洗干凈。

2．常用的消毒劑及其效果比較

不同的外植體，不同年齡以及不同季節選取的外植體，消毒方法也不相同。首先是消毒劑的種類、濃度不同，其次是消毒的時間不同，最終是消毒效果也不同。

常用的消毒劑如表4-1-5所示。理想的消毒劑應消毒效果好，易被無菌水沖洗掉或能自行分解，對材料損傷小，對人體及其他生物無害，來源廣泛，價格低廉。

表4-1-5常用消毒劑的使用方法及效果

（1）酒精：酒精是最常用的表面消毒劑，以70%~75%酒精殺菌效果最好，95%或無水酒精會使菌體表面蛋白質快速脫水凝固，形成一層干燥膜，阻止酒精的繼續滲入，殺菌效果大大降低。

酒精具有較強的穿透力，可使菌體蛋白質變性，殺菌效果好。同時它還具有較強的濕潤作用，可排除材料上的空氣，有利于其他消毒劑的滲入。但酒精對植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時間過長，植物材料的生長會受到影響，甚至被酒精殺死，使用時應嚴格控制時間。但酒精不能徹底消毒，一般不單獨使用，多與其他消毒劑配合使用。

（2）升汞：又稱氯化汞，Hg2+可以與帶負電荷的蛋白質結合，使蛋白質變性，從而殺死菌體。升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無菌水反復多次沖洗。升汞對環境危害大，對人畜的毒性極強，使用后應做好回收工作。

（3）次氯酸鈉：次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體。其消毒能力很強，不易殘留，對環境無害。但次氯酸鈉溶液堿性很強，對植物材料也有一定的破壞作用。

（4）漂白粉：漂白粉的有效成分是次氯酸鈣［Ca（ClO）2］，消毒效果很好，對環境無害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。

（5）過氧化氫：也稱雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會損傷外植體，常用于葉片的消毒。

（6）新潔爾滅：這是一種廣譜表面活性消毒劑，對絕大多數植物外植體傷害很小，殺菌效果好。

3．外植體的消毒方法

（1）莖尖、莖段及葉片等的消毒：消毒前先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，然后用自來水沖洗。對于一些表面不光滑或長有絨毛的材料，可用洗滌劑清洗，必要時用毛刷充分刷洗，硬質材料可用刀刮。

消毒工作在超凈工作臺上進行，先用70%酒精浸泡10~30 s，以無菌水沖洗2~3次，然后按材料的老嫩和枝條的堅實程度，分別用2%次氯酸鈉浸泡10~15 min或用0.1%升汞浸泡5~10 min。消毒時要不斷攪動，使植物材料與消毒劑充分接觸。若材料有絨毛，最好在消毒液中加入幾滴Tween-20，最后用無菌水沖洗3~5次。

（2）果實及種子的消毒：先用自來水沖洗10~20 min，再用酒精迅速漂洗一下。果實用2%次氯酸鈉浸泡10 min，后用無菌水沖洗2~3次。種子則先用10%次氯酸鈉浸泡20~30 min，難以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10 min。對于種皮太硬的種子，也可預先去掉種皮，再用4%次氯酸鈉浸泡8~10 min。

（3）花藥的消毒：用于組織培養的花藥多未成熟，其外面有花萼、花瓣或穎片保護，處于無菌狀態。消毒時將整個花蕾或幼穗用70%酒精浸泡數秒鐘，然后用無菌水沖洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10 min，最后用無菌水沖洗2~3次。

（4）根及地下部器官的消毒：由于這類材料生長于土壤中，表面帶菌量大，消毒較為困難。可先用自來水沖洗，軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸泡5~10 min或2%次氯酸鈉中浸泡10~15 min，最后用無菌水沖洗3次。

在操作時要根據材料的大小、老嫩、質地等差異作出判斷后，再選擇適宜的消毒劑種類、濃度和消毒時間，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果應是最大限度殺死材料上的微生物而又對材料的損傷最小。

問題2

外植體消毒滅菌是外植體培養成功與否的關鍵，那么外植體消毒滅菌工作應遵循怎樣的操作流程呢？

基本操作

四、外植體消毒滅菌的操作流程

圖4-1-2外植體消毒滅菌的操作流程