學習活動3 培養(yǎng)基配制

【學習目標】 1．能根據(jù)母液濃度、培養(yǎng)基配方及配制培養(yǎng)基的數(shù)量要求，計算各種母液的取量。

2．能均勻分裝營養(yǎng)液，并正確封口。

3．能正確使用高壓鍋對培養(yǎng)基進行滅菌。

【學習準備】 配制好的各種母液、蒸餾水、培養(yǎng)瓶、有刻度的鋼精鍋、電磁爐、pH試紙或酸度計、0.1 N的NaOH、0.1 N的HCl、量筒、移液管、蔗糖、瓊脂、高壓鍋。

【學習過程】

問題1

前面我們已經(jīng)制備好了培養(yǎng)基的各種母液，也已經(jīng)準備好了培養(yǎng)基制備的設備，現(xiàn)在接到公司技術部下達的一培養(yǎng)基配方及制備數(shù)量，我們怎么來制備培養(yǎng)基呢？

基本操作

一、培養(yǎng)基配制基本操作

配方：MS+6-BA 2 mg+NAA 0.5 mg+蔗糖30 g+瓊脂6 g，培養(yǎng)基制備量：10 L。

1．將已配好的各種母液按照大量元素（母液Ⅰ、母液Ⅱ、母液Ⅲ）、微量元素、鐵鹽、有機物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的順序擺放好。

2．根據(jù)母液濃縮倍數(shù)和培養(yǎng)基制備量計算各種母液的取量，并計算瓊脂和蔗糖的量。

已知：大量元素母液Ⅰ、母液Ⅱ、母液Ⅲ濃縮20倍。

微量元素母液濃縮200倍。

有機物質(zhì)母液濃縮200倍。

鐵鹽母液濃縮200倍。

6-BA母液濃度為1 mg/mL。

NAA母液濃度為0.5 mg/mL。

所以，1 L（1000 mL）培養(yǎng)基需要量取：

大量元素母液Ⅰ:1000÷20=50（mL）

大量元素母液Ⅱ:1000÷20=50（mL）

大量元素母液Ⅲ:1000÷20=50（mL）

微量元素母液：1000÷200=5（mL）

鐵鹽母液：1000÷200=5（mL）

有機物質(zhì)母液：1000÷200=5（mL）

6-BA母液：2 mg÷1 mg/mL=2（mL）

NAA母液：0.5 mg÷0.5 mg/mL=1（mL）

那么，配制10 L培養(yǎng)基需要量取：

大量元素母液Ⅰ:50 mL×10=500（mL）

大量元素母液Ⅱ:50 mL×10=500（mL）

大量元素母液Ⅲ:50 mL×10=500（mL）

微量元素母液：5 mL×10=50（mL）

鐵鹽母液：5 mL×10=50（mL）

有機物質(zhì)母液：5 mL×10=50（mL）

6-BA母液：2 mL×10=20（mL）

NAA母液：1 mL×10=10（mL）

瓊脂：6 g×10=60（g）

蔗糖：30 g×10=300（g）

3．用量筒或移液管量取各種母液。

用天平稱取瓊脂用量：6 g×10=60（g）

用天平稱取蔗糖用量：30 g×10=300（g）

4．一般在鋼精鍋中加入配制培養(yǎng)基總量2/3的蒸餾水，即約7L蒸餾水。

5．加入瓊脂，放在電爐或電磁爐上加熱，并不斷攪拌使之溶解。

6．將量取好的各種母液按照順序倒入瓊脂已溶化的鋼精鍋中，繼續(xù)加溫并不斷攪拌，使之均勻溶解。

7．將稱取好的蔗糖加入，攪拌溶解。

8．加蒸餾水定容至最終體積。

9．用pH試紙或酸度計測pH值，用0.1 N的HCl或0.1 N的NaOH調(diào)溶液pH值至5.6~5.8。

10．將已配好的培養(yǎng)液在瓊脂沒有凝固之前及時分裝到培養(yǎng)容器中。分裝時掌握好分裝量，一般以占培養(yǎng)容器的1/4~1/3為宜。分裝時注意不要把培養(yǎng)液黏附在瓶口上，以防引起污染。

11．用棉塞、封口膜或培養(yǎng)瓶蓋封口。

12．培養(yǎng)液分裝完畢后，應立即滅菌。通常應在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在汽相121℃條件下，滅菌20~25 min。滅菌后取出培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)基自然冷卻凝固。最好放置1d后再使用。

經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應置于10℃下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基最好在4℃～5℃低溫下保存。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的1周內(nèi)用完，其他培養(yǎng)基最多也不應超過1個月。在多數(shù)情況下，應在滅菌后2周內(nèi)用完。

圖3-3-1培養(yǎng)基的滅菌

問題2

經(jīng)過培養(yǎng)基制備的實際操作，我們能否總結出培養(yǎng)基的配制流程？

基本知識

二、培養(yǎng)基的配制流程

圖3-3-2培養(yǎng)基的配制流程圖

問題3

在配制母液及培養(yǎng)基時應注意哪些問題？

經(jīng)驗總結

三、配制母液和培養(yǎng)基時需要注意的問題

1．使用儲備的母液時，應在量取各種母液之前輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰該母液，重新進行配制。

2．用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管沖洗2次。

3．量取母液時，最好將各種母液按量取的順序寫在紙上，量取1種，畫掉1種，以免出錯。

4．在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替，但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。

5．調(diào)pH值時，用滴管吸取0.1 N的NaOH或HCl，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)液中，邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙（5.4~7）測試培養(yǎng)液的pH值，一直到培養(yǎng)液的pH值為5.8為止。

6．培養(yǎng)液分裝時，先將培養(yǎng)液倒入燒杯中，然后倒入錐形瓶或培養(yǎng)瓶中。注意不要讓培養(yǎng)液黏附到瓶口和瓶壁上。培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的量為錐形瓶容量的1/5～1/4。每升培養(yǎng)液可分裝20~30瓶。培養(yǎng)液分裝完畢后，應及時封蓋瓶口。

【思考題】

1．培養(yǎng)基的成分主要有哪些？

2．用于植物組織培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有哪些？它們的主要作用是什么？

3．培養(yǎng)基母液一般有哪幾類？如何配制？

4．簡述培養(yǎng)基的配制流程。