學習任務3培養基制備技術

【學習目標】 1．掌握植物組織培養基的主要成分及常用培養基的配方。

2．能獨立進行培養基母液的配制。

3．能按照配方要求制備培養基。

【工作情境】 植物組織培養是一項技術性很強的工作。為了確保組織培養工作順利進行，除了具備基本的實驗設備條件，還要熟練掌握植物組織培養的基本技術，其中培養基的配制是主要技術之一。培養基配制通常需要預先配制好各種營養物質及生長調節物質的母液，再根據培養基的配方及培養基的配制量，依次計算并量取各種母液的體積，經混合及添加其他物質充分溶解后，分裝于相應的培養容器內，再經高溫高壓滅菌。

【工作流程】

以MS培養基為例進行學習。

圖3-1培養基制備流程圖

學習活動1 培養基的成分及常用培養基的特點

【學習目標】 明確培養基的基本成分、常用培養基的配方及特點。

【學習準備】 常用培養基成分的主要化學物質、常用的培養基介質。

【學習過程】

問題1

培養基中的化學物質主要為植物材料提供營養元素，植物所需要的營養元素主要有氮（N）、磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、硫（S）、鐵（Fe）、硼（B）、錳（Mn）、鋅（Zn）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鋁（Al）等。那么，在中學里我們學到的哪些化學物質中含有這些元素呢？

基本知識

一、培養基的概念

培養基是根據植物的需求，將人工配制的含有各種營養成分的營養液盛裝于一定的容器內，并經高溫高壓滅菌后的培養基質。培養基是植物組織培養的核心，也是決定植物組織培養成敗的關鍵因素之一。外植體之所以能沿著不同的組織培養途徑生長、分化，主要原因就在于培養基中的物質成分對細胞的生長發育起著定向調控作用。

在離體培養條件下，不同植物的組織對營養的要求不同，甚至同一種植物不同部位的組織對營養的要求也不相同。因此，在進行植物組織培養時，首先必須找到一種合適的培養基，培養才有可能成功。

二、培養基的成分

圖3-1-1培養基成分

（一）水分

水分是離體植物生長所必需的成分。在培養基制備過程中所用的水必須是蒸餾水或純水，以免水中雜質以及所含礦質元素離子對培養結果產生影響。

（二）無機養分

指在植物生長發育中所必需的各種礦質元素、無機鹽等。根據植物對礦質元素的吸收量，將無機養分分為大量元素和微量元素兩大類。

1．大量元素：植物所需濃度大于0.5 mmol/L的元素，主要有氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、碳及來源于水中的氫和氧。

2．微量元素：植物所需濃度小于0.5 mmol/L的元素，主要有鐵、錳、鋅、銅、硼、碘、鉬和鈷等。

3．各種礦質元素的生理作用及缺乏時的癥狀如表3-1-1所示。

表3-1-1各種礦質元素的生理作用及缺乏時的癥狀

續表

（三）有機養分

培養基中還需要加入一定量的有機養分以利于植物快速生長。有機養分是指植物生長發育所需的有機碳、氫、氮等物質，主要有各種維生素、肌醇、氨基酸等。

1．維生素：維生素以輔酶的形式參與多種酶系的反應，直接影響蛋白質、糖、脂肪等物質的代謝活動，對離體植物生長、分化有很好的促進作用。常用的維生素有鹽酸硫胺素（維生素B1）、鹽酸吡哆醇（維生素B6）、鈷胺素（維生素B12）、葉酸（維生素B9）、抗壞血酸（維生素C）等。其中，維生素B1可全面促進植物的生長；維生素C有抗氧化作用，防止褐變；維生素B6能促進根的生長。維生素遇熱易變性，易在高溫下降解，可進行過濾滅菌。

2．肌醇：肌醇是維生素B族中的一種，又稱為環己六醇，主要在糖的互相轉化中起作用，具有促進活性物質發揮作用的效果，能使培養的植物組織快速生長。肌醇還能促進愈傷組織生長、胚狀體和芽的形成，培養基中1 mg/L的肌醇足夠促進鹽酸硫胺素效應的發揮。

3．氨基酸：氨基酸是蛋白質的組成成分，也是一種有機氮源，對植物外植體芽、根、胚狀體的生長、分化均有良好的促進作用。植物組織培養中常用的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸以及多種氨基酸的混合物，如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。其中，甘氨酸能促進根的生長；絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體或不定芽的分化；半胱氨酸可作為抗氧化劑，防止培養材料褐化，延緩酚氧化。

另外，培養基中還加入一些天然的有機物，如椰子乳、酵母提取液、麥芽提取液及各種果汁、菜汁等。天然有機物中常含有植物激素和多種維生素等成分，對某些植物組織的生長和分化有特殊的作用。

4．生長調節物質：生長調節物質在植物的生長分化和器官發育過程中起著非常重要的作用，它是培養基中的關鍵物質，用量雖少，但對外植體愈傷組織的誘導和根、芽等器官的分化起到重要和非常明顯的作用。培養基中生長調節物質的使用必須根據所培養的植物組織種類及培養目的來確定。組織培養中常用的生長調節物質主要有以下幾類。

（1）生長素：主要作用是促進植物細胞的伸長生長和細胞分裂，促進根的形成，誘導愈傷組織的產生，促進細胞脫分化。常用的生長素有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）等。在生理活性上，2,4-D活性最強， NAA、IBA居中，IAA最弱，但是2,4-D有抑制芽形成的副作用，一般用于愈傷組織的誘導。

（2）細胞分裂素：具有促進細胞分裂、誘導芽的分化和生長以及抑制頂端優勢的作用，能延緩葉片老化。常用的細胞分裂素有6-芐氨基嘌呤（6-BA）、6-糠氨基嘌呤（6-KT）、2-異戊烯基腺嘌呤（2-ip）、玉米素（ZT）等。

（3）赤霉素：以GA3運用最廣泛，有促進不定芽和幼株伸長的作用。

另外，植物組織培養中還用脫落酸、多效唑等植物生長調節物質。

5．糖：糖不僅能提供給植物培養材料所需的碳源，也能維持一定的滲透壓。常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖等，最常用的是蔗糖。在規模化生產中從經濟適用的角度出發，可利用白糖作為碳源。

（四）其他物質

在培養基中，往往根據培養目的、植物材料的不同，加入其他添加物，如活性炭、抗生素、抗氧化劑、誘變劑、生長抑制劑等。

1．活性炭：是木炭粉碎后經加工形成的粉末狀物質，結構疏松，孔隙大，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力，粒度越小，吸附能力越大。溫度低，吸附力強；溫度高，吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5~10 g/L。它可以吸附非極性物質和色素等大分子物質，包括瓊脂中所含的雜質，培養物分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5- 羥甲基糖醛及激素等，防止植物組織培養中的褐變現象，同時對防止產生玻璃化苗和促進試管苗生根有明顯的作用。

2．抗生素：在培養基中加入抗生素可防止菌類污染，減少培養基中材料的損失。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。

3．抗氧化劑：植物組織在切割時會溢出一些酚類物質，接觸空氣中的氧氣后，氧化為醌類物質，使植物材料和培養基變為褐色（即褐變現象），嚴重時植物材料死亡。所以褐變現象也是植物組織培養中的一大難題。在培養基中加入抗氧化劑可減輕褐變現象。常用的抗氧化劑有抗壞血酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽等。

4．瓊脂：瓊脂不是培養基中的營養成分，而是一種凝固劑。瓊脂是從海藻中提取出來的高分子糖類，在水中需加熱至95℃時才開始溶化，溶化后的溶液溫度需降到40℃時才開始凝固，所以是配制固體培養基最好的凝固劑。瓊脂本身不提供任何營養成分，具有無毒、可塑、遇熱溶化、冷卻后固形化、可使各種可溶性物質均勻分布等特性，因此是目前固體培養基中最好最常用的凝固劑。瓊脂用量過高培養基變硬，過低培養基不凝固。

問題2

我們知道，不同的植物對營養條件的要求不同，而且同一種植物的不同器官和組織的再生能力也不同，也就是說在植物組織培養中，要根據不同的植物、不同的培養部位及不同的培養目的選用不同的培養基。那么，在植物組織培養中如何選擇適宜的培養基呢？

基本知識

三、常用培養基的類型

（一）按照培養基的營養水平分

1．基本培養基：就是通常所說的培養基，只含有植物材料所需的基本營養成分，如MS、B5、Miller、White培養基等。

2．完全培養基：在基本培養基的基礎上，根據實驗的不同要求，附加一些物質，如生長調節物質等。

（二）按照培養基的物理狀態分

1．固體培養基：在培養基中加入凝固劑的培養基，多為瓊脂。

2．液體培養基：液體培養基中不加任何凝固劑。這種培養基的成分均勻，培養材料能充分接觸和利用培養基中的養料。

3．半固體培養基：液體培養基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態。它有利于培養材料對營養物質的吸收。

（三）按照培養物的培養過程分

1．初代培養基：是指第一次用來接種外植體的培養基。

2．繼代培養基：是指用來接種初代培養之后的培養物的培養基。

（四）按照培養基的作用分

誘導培養基、增殖培養基、生根培養基。

四、常用培養基的配方

植物組織培養是否成功，在很大程度上取決于對培養基的選擇。不同培養基有不同的特點，適用于不同的植物種類和接種材料。開展植物組織培養活動時，應對各種培養基進行了解和分析，以便從中選擇使用。培養基中的激素種類和濃度，隨著培養階段和材料的不同而有變化，因此各配方中均不列入。

植物組織培養中常用的培養基有MS、White、N6、B5、Nitsch、Miller、SH等，它們的配方如下。

表3-1-2常用培養基配方 （單位：mg/L）

五、幾種常用培養基的特點

目前，國際上流行的培養基有幾十種，常用的培養基及特點如下。

1. MS培養基：MS培養基是目前普遍使用的培養基。它是1962年由Murashige和Skoog為培養煙草細胞而設計的。特點是無機鹽離子濃度較高，為較穩定的平衡溶液。其養分的數量和比例較合適，可滿足多數植物的營養和生理需要。其硝酸鹽含量較其他培養基高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養，效果良好。有些培養基是由它演變而來的。

2. B5培養基：1968年由Gamborg等為培養大豆根細胞而設計。其主要特點是含有較低的銨，這可能是因為銨對不少培養物的生長有抑制作用。從實踐得知，有些植物在B5培養基上生長更適宜，如雙子葉植物，特別是木本植物。

3. White培養基：1943年由White為培養番茄根尖而設計。1963年又作了改良，稱作White改良培養基，提高了MgSO4的濃度，增加了硼素。其特點是無機鹽含量較低，適于生根培養。

4. N6培養基：1974年由朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養而設計。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內已廣泛應用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養和其他組織培養。

5. SH培養基：1972年由Schenk和Hidebrandt設計。其主要特點與B5培養基相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是礦質鹽濃度較高的培養基。在很多雙子葉植物和單子葉植物上使用效果很好。

6. Miller培養基：與MS培養基比較，無機鹽用量減少1/3~1/2，微量元素種類減少，無肌醇。