學習任務(wù)3培養(yǎng)基制備技術(shù)

【學習目標】 1．掌握植物組織培養(yǎng)基的主要成分及常用培養(yǎng)基的配方。

2．能獨立進行培養(yǎng)基母液的配制。

3．能按照配方要求制備培養(yǎng)基。

【工作情境】 植物組織培養(yǎng)是一項技術(shù)性很強的工作。為了確保組織培養(yǎng)工作順利進行，除了具備基本的實驗設(shè)備條件，還要熟練掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)，其中培養(yǎng)基的配制是主要技術(shù)之一。培養(yǎng)基配制通常需要預(yù)先配制好各種營養(yǎng)物質(zhì)及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的母液，再根據(jù)培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的配制量，依次計算并量取各種母液的體積，經(jīng)混合及添加其他物質(zhì)充分溶解后，分裝于相應(yīng)的培養(yǎng)容器內(nèi)，再經(jīng)高溫高壓滅菌。

【工作流程】

以MS培養(yǎng)基為例進行學習。

圖3-1培養(yǎng)基制備流程圖

學習活動1 培養(yǎng)基的成分及常用培養(yǎng)基的特點

【學習目標】 明確培養(yǎng)基的基本成分、常用培養(yǎng)基的配方及特點。

【學習準備】 常用培養(yǎng)基成分的主要化學物質(zhì)、常用的培養(yǎng)基介質(zhì)。

【學習過程】

問題1

培養(yǎng)基中的化學物質(zhì)主要為植物材料提供營養(yǎng)元素，植物所需要的營養(yǎng)元素主要有氮（N）、磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、硫（S）、鐵（Fe）、硼（B）、錳（Mn）、鋅（Zn）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鋁（Al）等。那么，在中學里我們學到的哪些化學物質(zhì)中含有這些元素呢？

基本知識

一、培養(yǎng)基的概念

培養(yǎng)基是根據(jù)植物的需求，將人工配制的含有各種營養(yǎng)成分的營養(yǎng)液盛裝于一定的容器內(nèi)，并經(jīng)高溫高壓滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的核心，也是決定植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵因素之一。外植體之所以能沿著不同的組織培養(yǎng)途徑生長、分化，主要原因就在于培養(yǎng)基中的物質(zhì)成分對細胞的生長發(fā)育起著定向調(diào)控作用。

在離體培養(yǎng)條件下，不同植物的組織對營養(yǎng)的要求不同，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，在進行植物組織培養(yǎng)時，首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。

二、培養(yǎng)基的成分

圖3-1-1培養(yǎng)基成分

（一）水分

水分是離體植物生長所必需的成分。在培養(yǎng)基制備過程中所用的水必須是蒸餾水或純水，以免水中雜質(zhì)以及所含礦質(zhì)元素離子對培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生影響。

（二）無機養(yǎng)分

指在植物生長發(fā)育中所必需的各種礦質(zhì)元素、無機鹽等。根據(jù)植物對礦質(zhì)元素的吸收量，將無機養(yǎng)分分為大量元素和微量元素兩大類。

1．大量元素：植物所需濃度大于0.5 mmol/L的元素，主要有氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、碳及來源于水中的氫和氧。

2．微量元素：植物所需濃度小于0.5 mmol/L的元素，主要有鐵、錳、鋅、銅、硼、碘、鉬和鈷等。

3．各種礦質(zhì)元素的生理作用及缺乏時的癥狀如表3-1-1所示。

表3-1-1各種礦質(zhì)元素的生理作用及缺乏時的癥狀

續(xù)表

（三）有機養(yǎng)分

培養(yǎng)基中還需要加入一定量的有機養(yǎng)分以利于植物快速生長。有機養(yǎng)分是指植物生長發(fā)育所需的有機碳、氫、氮等物質(zhì)，主要有各種維生素、肌醇、氨基酸等。

1．維生素：維生素以輔酶的形式參與多種酶系的反應(yīng)，直接影響蛋白質(zhì)、糖、脂肪等物質(zhì)的代謝活動，對離體植物生長、分化有很好的促進作用。常用的維生素有鹽酸硫胺素（維生素B1）、鹽酸吡哆醇（維生素B6）、鈷胺素（維生素B12）、葉酸（維生素B9）、抗壞血酸（維生素C）等。其中，維生素B1可全面促進植物的生長；維生素C有抗氧化作用，防止褐變；維生素B6能促進根的生長。維生素遇熱易變性，易在高溫下降解，可進行過濾滅菌。

2．肌醇：肌醇是維生素B族中的一種，又稱為環(huán)己六醇，主要在糖的互相轉(zhuǎn)化中起作用，具有促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用的效果，能使培養(yǎng)的植物組織快速生長。肌醇還能促進愈傷組織生長、胚狀體和芽的形成，培養(yǎng)基中1 mg/L的肌醇足夠促進鹽酸硫胺素效應(yīng)的發(fā)揮。

3．氨基酸：氨基酸是蛋白質(zhì)的組成成分，也是一種有機氮源，對植物外植體芽、根、胚狀體的生長、分化均有良好的促進作用。植物組織培養(yǎng)中常用的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸以及多種氨基酸的混合物，如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。其中，甘氨酸能促進根的生長；絲氨酸和谷氨酰胺有利于花藥胚狀體或不定芽的分化；半胱氨酸可作為抗氧化劑，防止培養(yǎng)材料褐化，延緩酚氧化。

另外，培養(yǎng)基中還加入一些天然的有機物，如椰子乳、酵母提取液、麥芽提取液及各種果汁、菜汁等。天然有機物中常含有植物激素和多種維生素等成分，對某些植物組織的生長和分化有特殊的作用。

4．生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物的生長分化和器官發(fā)育過程中起著非常重要的作用，它是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，用量雖少，但對外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和根、芽等器官的分化起到重要和非常明顯的作用。培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用必須根據(jù)所培養(yǎng)的植物組織種類及培養(yǎng)目的來確定。組織培養(yǎng)中常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有以下幾類。

（1）生長素：主要作用是促進植物細胞的伸長生長和細胞分裂，促進根的形成，誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，促進細胞脫分化。常用的生長素有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）等。在生理活性上，2,4-D活性最強， NAA、IBA居中，IAA最弱，但是2,4-D有抑制芽形成的副作用，一般用于愈傷組織的誘導(dǎo)。

（2）細胞分裂素：具有促進細胞分裂、誘導(dǎo)芽的分化和生長以及抑制頂端優(yōu)勢的作用，能延緩葉片老化。常用的細胞分裂素有6-芐氨基嘌呤（6-BA）、6-糠氨基嘌呤（6-KT）、2-異戊烯基腺嘌呤（2-ip）、玉米素（ZT）等。

（3）赤霉素：以GA3運用最廣泛，有促進不定芽和幼株伸長的作用。

另外，植物組織培養(yǎng)中還用脫落酸、多效唑等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。

5．糖：糖不僅能提供給植物培養(yǎng)材料所需的碳源，也能維持一定的滲透壓。常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖等，最常用的是蔗糖。在規(guī)模化生產(chǎn)中從經(jīng)濟適用的角度出發(fā)，可利用白糖作為碳源。

（四）其他物質(zhì)

在培養(yǎng)基中，往往根據(jù)培養(yǎng)目的、植物材料的不同，加入其他添加物，如活性炭、抗生素、抗氧化劑、誘變劑、生長抑制劑等。

1．活性炭：是木炭粉碎后經(jīng)加工形成的粉末狀物質(zhì)，結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力，粒度越小，吸附能力越大。溫度低，吸附力強；溫度高，吸附力減弱，甚至解吸附。通常使用濃度為0.5~10 g/L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5- 羥甲基糖醛及激素等，防止植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象，同時對防止產(chǎn)生玻璃化苗和促進試管苗生根有明顯的作用。

2．抗生素：在培養(yǎng)基中加入抗生素可防止菌類污染，減少培養(yǎng)基中材料的損失。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。

3．抗氧化劑：植物組織在切割時會溢出一些酚類物質(zhì)，接觸空氣中的氧氣后，氧化為醌類物質(zhì)，使植物材料和培養(yǎng)基變?yōu)楹稚春肿儸F(xiàn)象），嚴重時植物材料死亡。所以褐變現(xiàn)象也是植物組織培養(yǎng)中的一大難題。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可減輕褐變現(xiàn)象。常用的抗氧化劑有抗壞血酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽等。

4．瓊脂：瓊脂不是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，而是一種凝固劑。瓊脂是從海藻中提取出來的高分子糖類，在水中需加熱至95℃時才開始溶化，溶化后的溶液溫度需降到40℃時才開始凝固，所以是配制固體培養(yǎng)基最好的凝固劑。瓊脂本身不提供任何營養(yǎng)成分，具有無毒、可塑、遇熱溶化、冷卻后固形化、可使各種可溶性物質(zhì)均勻分布等特性，因此是目前固體培養(yǎng)基中最好最常用的凝固劑。瓊脂用量過高培養(yǎng)基變硬，過低培養(yǎng)基不凝固。

問題2

我們知道，不同的植物對營養(yǎng)條件的要求不同，而且同一種植物的不同器官和組織的再生能力也不同，也就是說在植物組織培養(yǎng)中，要根據(jù)不同的植物、不同的培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的選用不同的培養(yǎng)基。那么，在植物組織培養(yǎng)中如何選擇適宜的培養(yǎng)基呢？

基本知識

三、常用培養(yǎng)基的類型

（一）按照培養(yǎng)基的營養(yǎng)水平分

1．基本培養(yǎng)基：就是通常所說的培養(yǎng)基，只含有植物材料所需的基本營養(yǎng)成分，如MS、B5、Miller、White培養(yǎng)基等。

2．完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)實驗的不同要求，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等。

（二）按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分

1．固體培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入凝固劑的培養(yǎng)基，多為瓊脂。

2．液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，培養(yǎng)材料能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料。

3．半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)。它有利于培養(yǎng)材料對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

（三）按照培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程分

1．初代培養(yǎng)基：是指第一次用來接種外植體的培養(yǎng)基。

2．繼代培養(yǎng)基：是指用來接種初代培養(yǎng)之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。

（四）按照培養(yǎng)基的作用分

誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。

四、常用培養(yǎng)基的配方

植物組織培養(yǎng)是否成功，在很大程度上取決于對培養(yǎng)基的選擇。不同培養(yǎng)基有不同的特點，適用于不同的植物種類和接種材料。開展植物組織培養(yǎng)活動時，應(yīng)對各種培養(yǎng)基進行了解和分析，以便從中選擇使用。培養(yǎng)基中的激素種類和濃度，隨著培養(yǎng)階段和材料的不同而有變化，因此各配方中均不列入。

植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基有MS、White、N6、B5、Nitsch、Miller、SH等，它們的配方如下。

表3-1-2常用培養(yǎng)基配方 （單位：mg/L）

五、幾種常用培養(yǎng)基的特點

目前，國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，常用的培養(yǎng)基及特點如下。

1. MS培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基是目前普遍使用的培養(yǎng)基。它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細胞而設(shè)計的。特點是無機鹽離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足多數(shù)植物的營養(yǎng)和生理需要。其硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。

2. B5培養(yǎng)基：1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設(shè)計。其主要特點是含有較低的銨，這可能是因為銨對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用。從實踐得知，有些植物在B5培養(yǎng)基上生長更適宜，如雙子葉植物，特別是木本植物。

3. White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計。1963年又作了改良，稱作White改良培養(yǎng)基，提高了MgSO4的濃度，增加了硼素。其特點是無機鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)。

4. N6培養(yǎng)基：1974年由朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計。其特點是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。

5. SH培養(yǎng)基：1972年由Schenk和Hidebrandt設(shè)計。其主要特點與B5培養(yǎng)基相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是礦質(zhì)鹽濃度較高的培養(yǎng)基。在很多雙子葉植物和單子葉植物上使用效果很好。

6. Miller培養(yǎng)基：與MS培養(yǎng)基比較，無機鹽用量減少1/3~1/2，微量元素種類減少，無肌醇。