EGFR突變基礎(chǔ)上的小分子酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKis）開啟了肺癌個(gè)體化治療新時(shí)代，亦催生了后續(xù)多種分子靶向藥物雨后春筍般進(jìn)入臨床前或臨床研究，大有“忽如一夜春風(fēng)來，千樹萬樹梨花開”之景。然而，一個(gè)有生命力的靶向藥物必須具備明確的靶基因、靶人群及有效的檢測方法。而高效敏感的檢測是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療的基石與關(guān)鍵。

對肺癌驅(qū)動(dòng)基因的深入研究導(dǎo)致了基因檢測的巨大變革。尤其近年來以EGFR突變?yōu)榇淼幕蜃儺惍愘|(zhì)性和耐藥的研究，使腫瘤界同仁認(rèn)識到既往單一基因、單點(diǎn)靜態(tài)和定性檢測不能準(zhǔn)確很好地反映異質(zhì)性腫瘤內(nèi)的多個(gè)亞克隆基因變異及其治療選擇過程中的動(dòng)態(tài)改變規(guī)律。肺癌驅(qū)動(dòng)基因的檢測正在經(jīng)歷從單基因到多基因、從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、從定性到定量、從組織水平到單細(xì)胞水平的變革。

70%肺腺癌和50%以上肺鱗癌驅(qū)動(dòng)基因已經(jīng)確定。盡管大部分肺腺癌呈現(xiàn)單一驅(qū)動(dòng)基因變異，但越來越多的研究顯示部分患者腫瘤內(nèi)存在遺傳異質(zhì)性，即初始腫瘤組織標(biāo)本耐藥基因以低頻狀態(tài)與驅(qū)動(dòng)基因并存。隨著治療壓力的選擇作用，腫瘤細(xì)胞耐藥克隆增加而導(dǎo)致臨床耐藥。初始標(biāo)本中耐藥基因存在與否影響患者靶向治療的療效和生存。另一方面45%肺鱗癌常常表現(xiàn)多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因變異或通路改變。因此僅僅進(jìn)行單基因檢測不能很好地反映腫瘤遺傳學(xué)特點(diǎn)，多基因平行檢測有助于確定腫瘤內(nèi)的遺傳異質(zhì)性及治療過程中驅(qū)動(dòng)基因與旁路基因的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化過程。而且越來越多的基于分子靶藥物的臨床問世亦迫切需要建立多基因檢測平臺。

美國M.D.Andersong腫瘤中心牽頭的BATTLE試驗(yàn)是國際上第一項(xiàng)進(jìn)行多基因檢測基礎(chǔ)上的個(gè)體化靶向治療研究。該研究對復(fù)治患者二次活檢后進(jìn)行EGFR、KRAS突變及VEGF，Cycling D檢測，并根據(jù)分子檢測結(jié)果相應(yīng)給予厄羅替尼、索拉非尼、凡德他尼及厄羅替尼聯(lián)合貝沙羅汀治療，結(jié)果顯示臨床實(shí)踐中重復(fù)活檢是可行且8周疾病控制患者總生存時(shí)間延長?；诟喾伟?qū)動(dòng)基因檢測基礎(chǔ)上的個(gè)體化治療研究（BATTLE II）正在進(jìn)行中。

近期，美國肺癌突變聯(lián)盟（LCMC）、法國肺癌生物標(biāo)志物（BM）項(xiàng)目等多個(gè)協(xié)作組對肺腺癌和鱗癌進(jìn)行多基因平行檢測，在此基礎(chǔ)上指導(dǎo)個(gè)體化策略的制定。在LCMC 項(xiàng)目公布的數(shù)據(jù)中，共有1000余例患者接受檢測。其中，60%以上的患者可以鑒定出驅(qū)動(dòng)基因突變。相較沒有基因突變者及有突變但沒有接受靶向治療者，有驅(qū)動(dòng)基因同時(shí)又接受靶向治療者的中位生存時(shí)間顯著延長。

與臨床多基因檢測的需要相呼應(yīng)的是分子檢測技術(shù)的革命性進(jìn)展。如可進(jìn)行多個(gè)熱點(diǎn)突變檢測的SNaPshot，SNP測序，下一代基因測序技術(shù)如全基因組/外顯子組測序，轉(zhuǎn)錄組測序等在生物標(biāo)本研究中的應(yīng)用及檢測價(jià)格的降低，為臨床大規(guī)?；蚱叫袡z測提供了可行性和堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在不同治療階段或疾病進(jìn)展過程中，肺癌的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)特點(diǎn)可能發(fā)生改變，即存在時(shí)間分布上的腫瘤異質(zhì)性，因此既往應(yīng)用初治前的組織標(biāo)本進(jìn)行分子檢測試圖指導(dǎo)整個(gè)治療過程的策略對部分患者并不合適，通過重復(fù)活檢進(jìn)行實(shí)時(shí)的基因分析才能更精準(zhǔn)地反映治療過程中細(xì)胞內(nèi)各亞克隆的動(dòng)態(tài)變化。

然而在臨床實(shí)踐中，反復(fù)進(jìn)行組織活檢無論從倫理或?qū)嶋H操作上均存在一定的難度。故利用外周血（游離DNA、循環(huán)瘤細(xì)胞等）建立實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無創(chuàng)、定量的分子檢測體系具有重要的意義。著名的前瞻、隨機(jī)、多中心臨床研究FAST ACTⅡ的回顧性血漿DNA EGFR突變分析結(jié)果則表明以外周血為基礎(chǔ)的基因檢測指導(dǎo)個(gè)體化治療指日可待。該研究在427例可用于分析的血漿標(biāo)本中，32%（136/427）EGFR突變陽性。其中224例有配對組織標(biāo)本，血漿檢測的敏感性、特異性、兩種標(biāo)本的一致性分別為為77%（69/90），為96%（129/134），88% （198/224）。此數(shù)據(jù)與筆者所在團(tuán)隊(duì)既往的研究非常接近。尤其重要的是該研究顯示血漿DNA EGFR突變對生存時(shí)間的預(yù)測與組織突變者高度一致。

這些研究結(jié)果表明外周血EGFR突變的假陽性率低，臨床上一旦檢測結(jié)果陽性，可以指導(dǎo)EGFR-TKIs的選擇，但若檢測結(jié)果陰性，有20%～30%可能性為假陰性。故未來的研究將致力于提高外周血EGFR突變檢測的敏感性和對治療預(yù)測的準(zhǔn)確性。同時(shí)，基于目前的研究均為回顧性多中心或單中心研究，前瞻性多中心研究迫在眉睫。唯有如此，才能改寫基于液體活檢基礎(chǔ)上的個(gè)體化治療歷史。

臨床實(shí)踐中，部分EGFR突變陽性患者EGFR-TKI治療無效或效果不佳，其原因可能與EGFR突變含量或豐度有關(guān)。異質(zhì)性高、EGFR突變含量低的腫瘤，可能更少從EGFR TKI治療中受益。國內(nèi)吳一龍教授團(tuán)隊(duì)利用標(biāo)準(zhǔn)的測序法和高敏的ARMS方法巧妙地將EGFR突變患者分為高豐度與低豐度組，發(fā)現(xiàn)兩組患者EGFR TKI治療療效有顯著差異，凸顯出腫瘤內(nèi)EGFR突變含量檢測的重要性。

近年多組研究探尋EGFR-TKI敏感與耐壓基因變異的定量檢測。如北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院采用DHPLC法，通過觀察峰值的變化對EGFR突變實(shí)現(xiàn)半定量分析。Azuara等利用納米流體數(shù)字化PCR陣列（Nanofluidic digital PCR Array）定量分析結(jié)直腸腫瘤和胰腺腫瘤KRAS基因的變異狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)數(shù)字化PCR可提高KRAS等位基因突變的檢測率。近期Oxnard等的研究亦發(fā)現(xiàn)利用數(shù)字化PCR檢測肺癌血漿游離DNA EGFR突變量的改變能很好預(yù)測治療療效，且耐藥基因的出現(xiàn)能在改變前影像學(xué)改變前16周即已出現(xiàn)。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院亦利用數(shù)字化PCR，對135例EGFR-TKIs初始治療有效6個(gè)月以上而后治療失敗的晚期NSCLC 的配對外周血標(biāo)本進(jìn)行了EGFR突變及T790M突變的定量、動(dòng)態(tài)分析，在一定程度上表明基因變異在瘤灶內(nèi)的異質(zhì)性。除數(shù)字化PCR外，BEAMing檢測、下一代基因測序技術(shù)等均能對異質(zhì)性腫瘤的基因變異進(jìn)行定量分析。這對實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的個(gè)體化治療無疑具有重要的意義。

CTC是有關(guān)外周血分子標(biāo)志研究的焦點(diǎn)，作為完整的、無損傷的腫瘤細(xì)胞，能反映腫瘤的轉(zhuǎn)移、耐藥、進(jìn)展等過程。既往的研究更多聚焦于乳腺癌、前例腺癌、腸癌治療前后CTC的數(shù)量或單一基因如Her2等的變化與療效、預(yù)后的關(guān)系。肺癌CTC的研究滯后于上述幾種腫瘤，主要涉及數(shù)量變化的預(yù)測意義。近期哈佛大學(xué)Yu博士分析乳腺癌CTC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與其化療或靶向治療的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CTC中EMT比例增高者治療反應(yīng)差于上皮標(biāo)志高的患者。而大部分腫瘤微量的CTC是進(jìn)行基因組分析的最大挑戰(zhàn)。

近期筆者所在團(tuán)隊(duì)與哈佛大學(xué)和北京大學(xué)生命研究科學(xué)院的謝曉亮教授合作，進(jìn)行晚期肺癌CTC單細(xì)胞基因組和外顯子組分析，試圖探尋肺癌靶向治療耐藥、轉(zhuǎn)移、甚至表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制。該研究成功檢測到與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的原癌基因和抑癌基因上的重要單核苷酸變異和插入/缺失。結(jié)果顯示CTC中外顯子組突變的異質(zhì)性雖然明顯，但與腫瘤耐藥或表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因變異在CTC中高度富集。故單細(xì)胞水平CTCs的基因突變的檢測不僅可避免反復(fù)穿刺活檢給患者帶來的傷害和痛苦，并能及時(shí)提供個(gè)體化治療所需的重要信息。

此外，該研究還發(fā)現(xiàn)肺腺癌中，來自同一患者不同CTC均展現(xiàn)出高度一致的全基因組拷貝數(shù)變化模式，與其轉(zhuǎn)移灶組織的基因拷貝數(shù)變化模式一致。而不同的肺腺癌患者中，CTC展示的全基因拷貝數(shù)變化模式具有高度的相似性。腫瘤的異質(zhì)性長期以來被視為惡性腫瘤的重要特征。首次在CTC中觀察到的高度一致的拷貝數(shù)變異模式將會(huì)改變傳統(tǒng)上對腫瘤異質(zhì)性的理解，揭示特定的拷貝數(shù)變異在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。有可能作為肺癌早期診斷或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志。

綜上，隨著組織病理學(xué)到分子病理學(xué)的發(fā)展，NSCLC不再被認(rèn)為是一個(gè)疾病而是由不同驅(qū)動(dòng)基因作用的一組疾病。驅(qū)動(dòng)基因的發(fā)現(xiàn)對肺癌個(gè)體化治療有重要的指導(dǎo)價(jià)值。在這些生物標(biāo)記物中EGFR突變、ALK融合基因目前證據(jù)最為有力。而檢測技術(shù)的變革已經(jīng)并將繼續(xù)推動(dòng)肺癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療的深入發(fā)展：“從單基因到多基因、從腫瘤組織到單細(xì)胞”的檢測變革”，使在臨床實(shí)踐中能更充分地利用有限的腫瘤標(biāo)本獲得更多的可指導(dǎo)個(gè)體化治療的信息；“從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)”的檢測變革，使對靶向治療的療效和耐藥監(jiān)測成為可能；而“從定性到定量”的檢測變革，則有助于更深入地了解NSCLC異質(zhì)性，指導(dǎo)更為合理的治療策略的制定。