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第一節 微小殘留病變定義及檢測方法

一、MRD定義
MRD定義為經放、化療及HSCT等治療,未達到清除療效時,患者體內殘留在形態學檢測敏感度以下的白血病細胞或惡性細胞數。臨床常規細胞形態學及傳統染色體檢測的敏感性在10 -2左右,難以鑒別單個或數個白血病細胞或異常核型。因此需要更敏感的方法才能檢測到殘存在體內的異常細胞。白血病及腫瘤細胞的抗原表型異常改變,染色體的丟失、易位或倒位,基因的重排、插入或缺失而形成的融合基因等變異,為MRD的檢測提供了可靠的標志。MRD的常用檢測方法敏感性一般可達10 -2~10 -6,因而比普通形態學要敏感且特異。常用的MRD檢測方法主要包括熒光原位雜交(FISH)、流式細胞學分析(FCM)和聚合酶鏈反應(PCR)等,各項技術檢測的敏感和特異性亦各不相同。不同類型的白血病或血液腫瘤細胞可能存在不同的遺傳變異,同一種遺傳變異也可能出現于多種疾病中,因此在進行MRD檢測時需要根據疾病的種類、特點選擇合適的標志,結合相應檢測技術的敏感性及特異性,進行有針對性的分析。利用上述方法只要檢測到相關標志,即可認為仍存在MRD。
二、MRD檢測方法

(一)染色體熒光原位雜交

部分白血病及實體腫瘤細胞有染色體異常,是檢測白血病細胞存在的客觀標志。傳統的細胞遺傳學方法在分裂象足夠分析的條件下可見檢測到100個正常細胞中的1個白血病細胞。染色體FISH技術是利用已知的核酸探針,與染色體標本中相關核酸序列雜交,通過間接免疫熒光反應,直接定位異常的基因,其檢測MRD的敏感度為10 -1~10 -3,但由于是對細胞內熒光數的直觀判斷,且被檢測的標本不必經過細胞培養,分裂間期、中期及終末期細胞標本均可,因而假陰性率較低,檢出率更高。與染色體核型分析相比,FISH方法快捷、靈敏、特異,能快速掃描200~10 000個骨髓或外周血細胞的染色體異常,特別是對那些之前用傳統顯帶方法未能檢出的低比例異??寺?。FISH分析證明有白血病細胞或腫瘤細胞特異存在的染色體易位和融合基因,是檢測MRD的標準技術。如在化療緩解后或HSCT后,急性髓性白血?。ˋML)-M2中檢測t(8;21)形成的AML1/ETO,急性早幼粒細胞白血?。ˋPL)中檢測染色體t(15;17)形成的PML/RARα以及慢性髓性白血病(CML)中檢測BCR/ABL等融合基因。檢測結果陽性即表明患者體內殘留有白血病細胞。所檢出的異常染色體在治療緩解時會減少或呈陰性,而復發時又增多,提示殘留白血病細胞的增殖。用雙色或多色FISH分析同一個細胞不同的染色體異常標志,也可提高檢測特異性,減少假陽性。

(二)流式細胞學檢測

近20年來的研究表明,當體內白血病細胞低于10 6時才有可能依靠機體自身的免疫保護機制清除殘留的白血病細胞,這意味著用于MRD監測技術的敏感性要達到10 -4以上,而目前可以滿足這個條件的檢測方法主要是FCM及PCR。白血病細胞是惡性克隆增殖,并在某一階段分化停滯,細胞表面的抗原表達可將惡性細胞與正常細胞區分開,但至今未發現白血病細胞特異且固有的抗原表型。盡管如此,惡性細胞表面抗原表達與正常細胞仍存在質和量的差異,包括跨系列表達、不同步表達、染色體相關的異常表達以及過高/低的抗原表達。FCM可利用相應單克隆抗體,檢測不同分化階段中的細胞在抗原免疫表型數量上的異常,快速、直觀地判斷異常白血病細胞的存在。對于不同類型白血病或血液系統惡性腫瘤運用多種抗體組合可找出表達異常抗原的細胞,最終以多個抗體組合的檢測結果最大值作為最終報告。FCM檢測MRD敏感度達10 -4左右,如檢測到MRD持續存在,提示無病生存時間較短,預示病情將復發。目前FCM對于AML和ALL來說都是非常有效的MRD檢測手段,為防止白血病細胞的抗原表達在化療或疾病進展過程中發生變化而導致假陰性結果,需要在MRD檢測時用到適合患者的所有抗體組合。

(三)聚合酶鏈式反應

目前為止檢測MRD最為敏感的方法為PCR技術,它的敏感性可達到10 -5~10 -6。隨著分子生物學技術的發展,發現越來越多的基因異常與血液病相關,一些特異的基因靶點可作為腫瘤標記用于MRD的檢測,如t(15;17)染色體異常可以產生PML/RARα融合基因,t(9;22)染色體異常可以產生BCR/ABL融合基因,t(8;21)異??梢援a生RUNX1/RUNX1T1融合基因,免疫球蛋白(Ig)基因和T細胞受體(TCR)基因可重排形成克隆特異性片段。目前,利用這些基因標志檢測MRD,不僅是定性分析,而且可以進行定量檢測,聯合多個基因及其他參數的檢測結果,可提高敏感度和特異性,成為臨床更可靠的依據。目前已發現數百種基因與白血病有關,多重巢式PCR及基因芯片技術可快速檢測數百種白血病基因,這些基因可以幫助白血病的分型、判斷預后、指導治療,監測MRD。有時檢測結果染色體無異常但白血病基因異常,其臨床意義與染色體異常的價值相近。

(四)高通量測序技術及數字PCR技術

近年來隨著MRD檢測技術的發展,新一代高通量測序(next-generation sequencing,NGS)技術及數字PCR(digital PCR,dPCR)技術也越來越多地應用于臨床MRD檢測領域。NGS實現了多基因多樣本并行的高通量測序。初診AML患者存在具有預后意義的一系列基因突變成為突變組合,采用NGS靶向測序法檢測特定的基因突變具有經濟、實用、快速的優點,是當前臨床常規中初診AML患者基因突變的篩查方式。NGS另一個特點是可以對突變比例準確定量,通過提高檢測深度有可能提高敏感度,因此采用NGS隨訪檢測AML患者初診篩查出的突變有可能成為新的MRD監測指標。dPCR是最新的定量技術,基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量,是一種絕對定量的方法。它可根據每個患者的特異性基因設計個體化探針,對突變的檢出率可達到0.001%,因此也是一種非常適用于MRD低頻突變檢測的新技術。
可以根據其評價骨髓凈化的程度,比較各種預處理方案的臨床效果,以及預測復發和判斷預后等。MRD在體內可以長期存在,其數量也可隨治療及緩解的時間長短有較大范圍的變化。PCR基因檢測作為最敏感的指標雖然有時被檢出陽性,患者仍可長期無病生存。因此目前認為MRD負荷可能存在最低閾值,低于這個閾值的患者其MRD可能會與體內免疫系統達成平衡或被其清除,因而患者可長期無病存活;高于該閾值MRD患者如未得到有效干預,仍會逐漸走向復發。還有時不同患者體內MRD水平相近,臨床結果卻各異,也提示MRD的閾值可能是相對的,最終的臨床結果可能還與其動態走向密切相關。因此,長期動態監測患者MRD水平,并明確什么時段、什么水平的MRD可預示復發極為重要。
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