一、概述

（一）CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)簡介

1.CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)發(fā)展史

針對(duì)不同腫瘤抗原靶點(diǎn)的CAR-T免疫治療已經(jīng)大規(guī)模地進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，并有大量相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。CAR-T技術(shù)臨床操作中，兩個(gè)技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)是T細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立和T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用anti-CD3和CD28共刺激因子可以有效促進(jìn)T細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增，這為臨床治療對(duì)T細(xì)胞數(shù)量的要求提供了保障。對(duì)200多例患者回輸體外培養(yǎng)的CD4和CD8陽性T細(xì)胞，均未發(fā)生明顯的副反應(yīng)^［2］。

CAR-T療法的第一個(gè)積極臨床結(jié)果由Baylor醫(yī)學(xué)院的Malcolm K.Brenner研究組于2008年公布，靶向GD2的CAR-T療法，盡管24h血液中CAR-T細(xì)胞含量不足0.1%，仍使得11名神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中的3人完全緩解^［3］。隨之而來的一個(gè)問題是如何保持CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)長期存活。第二代CAR-T引入了共刺激信號(hào)CD28和4-1BB，前者通過上調(diào)Bcl-X_L延長T細(xì)胞的壽命，后者可以增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)^［3，4］。

2007～2009年，Baylor醫(yī)學(xué)院的Michel Sadelain、賓夕法尼亞大學(xué)的Carl H.June和NCI研究所的Steven Rosenberg研究組分別報(bào)道了anti-CD19 CAR-T的臨床前研究結(jié)果。2010年，Steven Rosenberg研究組用CD28共刺激信號(hào)，將第二代CAR-T技術(shù)用于治療晚期濾泡性淋巴瘤。這項(xiàng)研究由8名患者參與，6名患者治療后病情得到緩解。5名患者治療后CAR-T細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞中的含量超過1%，10天后達(dá)到峰值，一個(gè)月后含量回落到0.01%以下^［5，6］。2011年，Carl H.June教授發(fā)表了一例基于4-1BB共刺激信號(hào)，靶向CD19的第二代CAR-T細(xì)胞治療CLL的案例。患者完全緩解，但伴隨著細(xì)胞因子風(fēng)暴帶來的副反應(yīng)^［7，8］。同年，Michel Sadelain和Renier J.Brentjens教授發(fā)表了基于CD28共刺激信號(hào)，靶向CD19的第二代CAR-T細(xì)胞治療CLL和ALL的臨床試驗(yàn)結(jié)果^［9，10］。使用的治療劑量是10⁷個(gè)/kg體重。大部分患者在接受治療的24h內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀，多數(shù)是暫時(shí)性的，只有1名患者持續(xù)發(fā)熱最終死亡，死亡原因不明，但可能與之前已存在的膿毒癥有關(guān)。1例CLL患者得到緩解，療效維持了6個(gè)月。1例ALL患者病情緩解。治療2周后，患者血液中均檢測不到CAR-T細(xì)胞存在。針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞療法大獲成功，更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在其他B細(xì)胞相關(guān)的惡性腫瘤患者中開展。比如Till等^［11］用電轉(zhuǎn)的方法將anti-CD20 CAR導(dǎo)入CD8⁺ T細(xì)胞，用于臨床治療難治濾泡性淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤。招募了7名患者，均接受3次CD20 CAR-T細(xì)胞逐量遞增輸注（分別為10⁸個(gè)/m²，10⁹個(gè)/m²和3.3×10⁹個(gè)/m²）。其中3例患者輸注CAR-T細(xì)胞后，細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間較短。后4例患者進(jìn)行皮下低劑量IL-2（500000IU/m²）注射，每天2次，持續(xù)14天，CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間明顯延長。由于CAR結(jié)構(gòu)中的scFv段來源于小鼠，輸注后的3個(gè)月和6個(gè)月分別有2名患者出現(xiàn)人抗鼠免疫反應(yīng)，但臨床可控。

CAR-T技術(shù)使T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別越過了MHC的遞呈機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞不能通過下調(diào)MHC的表達(dá)躲避T細(xì)胞的追殺。但是CAR-T可以識(shí)別的抗原僅局限于腫瘤細(xì)胞的表面抗原，一般只能占到腫瘤抗原的20%左右。另外，這些腫瘤相關(guān)抗原大部分也表達(dá)在正常細(xì)胞表面，CAR-T細(xì)胞容易造成“誤傷”，具有脫靶毒性。臨床上用CAR-T細(xì)胞治療后也存在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險(xiǎn)。CAR-T療法的安全問題主要體現(xiàn)在脫靶毒性和細(xì)胞因子風(fēng)暴上。

2.CAR-T細(xì)胞基本組成元件

如圖1-5所示^［12］， CAR的結(jié)構(gòu)組成包含五部分，分別簡介如下：

（1）抗原識(shí)別區(qū)　CAR-T細(xì)胞之所以能特異性地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表達(dá)的靶抗原，依賴于抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域（antigen recognition domain，ARD）。ARD從抗體的單鏈可變區(qū)（single-chain variable fragment，scFv），或者從受體配體相互作用、TCR模擬物、可變的淋巴細(xì)胞受體（variable lymphocyte receptors，VLR）衍生而來，到目前為止，ARD最為常見的來源是抗體的scFv段。

（2）鉸鏈區(qū)　作用于CAR抗原結(jié)合區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）之間的連接稱之為鉸鏈區(qū)。這個(gè)區(qū)域通過給予抗原結(jié)合域一定范圍的活動(dòng)，允許CAR識(shí)別抗原，并且也可以形成免疫突觸。目前使用的鉸鏈區(qū)主要來源于IgG1、IgG4的Fc區(qū)域、CD84、CD28，IgD和CD7也有少量使用。此外，典型的鉸鏈區(qū)還包含一些殘基，這些殘基參與CAR二聚化，有助于增加抗原的敏感性。

（3）跨膜結(jié)構(gòu)域　跨膜結(jié)構(gòu)域連接著CAR 結(jié)構(gòu)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外成分。不同的TM可以影響CAR 的表達(dá)和穩(wěn)定性，但是并不直接參與信號(hào)傳遞，通過相互作用可以提高下游信號(hào)傳遞。CD3是第一代CAR 分子使用的TM，對(duì)于后來的CARs，CD28、CD88的TM使用也比較多，其他的TM也來源于CD4、OX40、CD7、Fc70和H-2K^b片段的一部分。

（4）胞內(nèi)共刺激分子　盡管已經(jīng)有多個(gè)研究組研究了不同的胞內(nèi)共刺激分子對(duì)CAR-T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的影響，但到目前為止，仍然沒有一致的結(jié)果說明哪個(gè)共刺激分子更為優(yōu)越，因此，共刺激分子的選擇通常是一件具有傾向性的事情。由于較好的效應(yīng)記錄， CD28和4-1BB是使用頻率最高的，此外，還有一些其他的共刺激分子結(jié)構(gòu)域，比如OX40、ICOS、CD27、NKG2D、DAP10、MyD88/CD40和CD244等。

（5）胞內(nèi)T細(xì)胞活化分子　胞內(nèi)信號(hào)分子主要來源于CD3，此外，在早期FcR-γ也比較多。

3.CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)演變

如圖1-6所示^［34］，根據(jù)CAR結(jié)構(gòu)元件組成的不同，目前CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)分為四代。第一代CAR主要由引導(dǎo)肽（linker）、抗原識(shí)別區(qū)（scFv片段）、鉸鏈區(qū)（hinge）、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)T細(xì)胞活化分子（CD3ζ）四部分組成（見本章第三節(jié)）。第二代CAR在第一代CAR的基礎(chǔ)上，增加了一個(gè)胞內(nèi)共刺激因子CD28或者CD137（見本章第四節(jié)）。在第二代CAR的基礎(chǔ)上，將兩個(gè)或兩個(gè)以上的胞內(nèi)共刺激分子串聯(lián)起來，組成第三代CAR（見本章第五節(jié)）。第四代CAR是在第二代或者第三代CAR的基礎(chǔ)上，串聯(lián)細(xì)胞因子IL-12、可調(diào)控的CAR基因等組成的（見本章第五節(jié)）。

（二）TCR-T細(xì)胞治療技術(shù)

TCR是一個(gè)多亞基的轉(zhuǎn)膜復(fù)合物，能調(diào)節(jié)抗原特異性的T細(xì)胞激活。TCR是由兩個(gè)不同的多肽鏈組成的，即TCR的α鏈和β鏈。這些多肽鏈都有一個(gè)N-末端的可變區(qū)域和一個(gè)恒定區(qū)。它們通過一個(gè)二硫鍵連接，每一個(gè)受體都提供一個(gè)單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)。TCR通過識(shí)別抗原配體組成一個(gè)短的鄰近的氨基酸序列。蛋白質(zhì)通過主要組織相容性復(fù)合物分子（MHC）進(jìn)行遞呈。在大部分情況下，對(duì)于CD4來說主要是MHC-Ⅱ類分子，對(duì)于CD8來說主要是MHC-Ⅰ類分子（圖1-7）^［13］。成功構(gòu)建一種腫瘤特異性的TCR，需要確定一個(gè)適當(dāng)?shù)陌悬c(diǎn)序列。一種方法是用免疫轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)人類HLA蛋白與人類腫瘤蛋白，誘導(dǎo)含有特異性TCR（可特異性地結(jié)合人類相應(yīng)抗原）的T細(xì)胞產(chǎn)生^［14］。另一種可選擇的方法是同種異體移植TCR基因，并可通過一些體外技術(shù)提高其腫瘤殺傷活性^［15］。關(guān)于TCR-T技術(shù)見本書第五章。

（三） CAR-T與TCR-T比較

CAR-T細(xì)胞的使用比TCR 轉(zhuǎn)基因的方法有一些優(yōu)勢(shì)^［16］（如圖1-8所示）。此外，CAR-T細(xì)胞識(shí)別技術(shù)獨(dú)立于MHC的表達(dá)可以克服腫瘤免疫逃避的現(xiàn)象。比如CAR-T細(xì)胞技術(shù)包含有細(xì)胞外信號(hào)結(jié)構(gòu)域能補(bǔ)充下游的癌癥共刺激信號(hào)分子。此外，CAR不僅能靶向蛋白抗原，也可以靶向糖類和脂質(zhì)抗原以及其他任何可以被抗體識(shí)別的抗原。

（1）兩種方法的共同之處　基因工程修飾的T細(xì)胞；修飾的T細(xì)胞通過ACT（adoptive cell transfer therapy，過繼細(xì)胞治療）發(fā)揮殺傷作用；需要特異性的TAA靶點(diǎn)；都可以與CD3ζ相互作用刺激T細(xì)胞的應(yīng)答。

（2）CAR-T細(xì)胞治療的特點(diǎn)　HLA非依賴性；較高的結(jié)合親和力；直接識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞；在體外能大量擴(kuò)增和增殖的T細(xì)胞；在體內(nèi)也有少量的擴(kuò)增；不能識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的腫瘤抗原。

（3）TCR-T細(xì)胞治療的特點(diǎn)　HLA限制性；較低的結(jié)合親和力；TCR介導(dǎo)的抗原識(shí)別；能靶向細(xì)胞內(nèi)的腫瘤抗原；具有MHC1。關(guān)于TCR-T細(xì)胞治療見本書第五章。

（四）過繼T細(xì)胞治療技術(shù)流程

目前臨床常使用三種過繼T細(xì)胞治療（adoptive T cell transfer，ACT）^［17］方法，分別是TILs（tumor-infiltrating lymphocytes）、TCR-T（T cell receptor，TCR） 細(xì)胞、CAR-T 細(xì)胞。ACT制備流程如圖1-9所示。

從人體腫瘤組織中分離獲得TIL，并進(jìn)行體外擴(kuò)增，鑒定后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，用于化療和放射治療后的患者免疫治療。從患者體內(nèi)分離T細(xì)胞，經(jīng)基因修飾后在體外擴(kuò)增培養(yǎng)成為TCR-T細(xì)胞或者CAR-T細(xì)胞，TCR-T細(xì)胞是為T細(xì)胞增加一個(gè)靶向腫瘤抗原的T細(xì)胞受體，TCR通過與CD3形成復(fù)合物傳遞激活信號(hào)，進(jìn)一步通過MHC識(shí)別腫瘤抗原從而攻擊腫瘤細(xì)胞。對(duì)于CAR而言，通過增加一個(gè)嵌合抗原受體來識(shí)別特異性的腫瘤抗原，CAR分子與腫瘤抗原識(shí)別，通過自身攜帶的共刺激信號(hào)增加T細(xì)胞的應(yīng)答，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)^［18］。

目前腫瘤免疫治療中使用腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）已經(jīng)顯示了初步的療效。客觀應(yīng)答率（objective response rate，ORR）在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中大約為50%，完全應(yīng)答率（complete response，CR）范圍在10%～20%，包括持續(xù)3年以上的CR^{［19，20］}。雖然TIL治療具有一定療效，但大部分患者并不適合使用TIL治療，因?yàn)椴⒉皇撬械幕颊叨即嬖谟心[瘤浸潤的T細(xì)胞，并且在許多癌癥中，鑒定和獲得腫瘤浸潤T細(xì)胞是非常困難的。因此，為了克服這些不足，基因工程介導(dǎo)的CAR和TCR修飾的T細(xì)胞，成為可供選擇的方法。在靶向CD19的CAR修飾T細(xì)胞治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）取得了明顯的療效，最高的CR可達(dá)90%。在應(yīng)用基因修飾的TCR-T細(xì)胞進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也已經(jīng)取得了一定的療效，但是應(yīng)答率不盡相同。一個(gè)靶向NY-ESO1/HLA-A2的TCR-T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的客觀應(yīng)答率為50%，而在轉(zhuǎn)移性滑液細(xì)胞肉瘤中的應(yīng)答率則高達(dá)70%，并且沒有檢測到明顯的毒性^［21］。一些TCR-T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)也顯示了一定的抗腫瘤應(yīng)答，但是在一定情形下會(huì)對(duì)某些組織產(chǎn)生細(xì)胞毒性，若這些組織表達(dá)與導(dǎo)入的TCR靶抗原相同或者具有高度類似的抗原。