1.3　革蘭氏陽性菌中單加氧酶基因（alkB）的研究

1.3.1　微生物降解烷烴的機理

石油中屬于飽和碳氫化合物的有正構烷烴、分枝烷烴和環烷烴。在自然界中很多微生物可以利用烷烴，包括細菌、真菌和藻類，主要有Pseudomonas、Acinetobacter、Achromobacter、Bacillus、Micrococcus、Candida、Rhodotorula及Penicillium等。在石油混合物中，正構烷烴最易受到微生物的降解，甚至C₄₄或更長碳鏈的正構烷烴也能被某些微生物降解。其降解途徑主要有四條（圖1-2）。

1.3.1.1　單末端氧化途徑

Fennewald等利用插入缺失的方法研究了Pseudomonas oleovorans GPo1烷烴降解途徑，May等指出烷烴的降解通常是從烷烴鏈的一個末端開始氧化，即微生物產生的烷烴羥化酶（又稱單加氧酶）攻擊正烷烴的末端甲基，氧化產物為伯醇類化合物，伯醇類化合物依次被氧化成醛和脂肪酸，然后進入β-氧化途徑產生乙酰COA，再進入三羧酸循環完全氧化成CO₂和H₂O，具體途徑如下：

1.3.1.2　次末端氧化途徑

Markovetz等研究發現Norcardia sp.等細菌降解烷烴時，發現烷烴氧化的第一步是從烷烴一端的第二位碳原子被氧化，其產物是仲醇類化合物，然后進一步氧化成酮、再氧化成酯（Ester），酯鍵裂解產生伯醇和脂肪酸，伯醇進一步被氧化成醛和脂肪酸，途徑如下：

1.3.1.3　雙末端氧化途徑

Rehm等指出某些細菌和真菌能同時氧化長鏈烷烴的兩個末端甲基，產生二羧酸產物，即所謂的ω-氧化：

在某些具有支鏈的烷烴中，由于分支鏈會阻礙β-氧化，微生物利用雙末端氧化途徑的這一方式可以避免這種情況發生。

上述三條途徑中的第一步反應都是由烷烴羥化酶（又稱單加氧酶）催化完成的。

1.3.1.4　雙加氧氧化途徑

Finnerty研究發現Acinetobacter sp.HO1-N菌氧化長鏈烷烴時，首先生成烷基氫過氧化物（Alkyl hydroperoxide），然后直接氧化成脂肪酸。

該途徑中的第一步反應是由烷烴雙加氧酶催化完成的。該途徑后來被Maeng等研究Acinetobacter sp. M-1證實，并指出烷烴雙加氧酶不需要NAD（P）H輔酶，但必須有分子氧（O₂）的參與。

1.3.2　烷烴羥化酶的種類

烷烴是一高度還原性物質，微生物對其降解的第一步是在烷烴分子中加入氧使其氧化為醇或酮，再進一步氧化為脂肪酸進入β-氧化途徑進行氧化分解。其中催化烷烴氧化的第一步酶特別關鍵，因此對其研究也較多。目前，已發現的催化烷烴氧化的第一步酶的種類見表1-3。

盡管對烷烴的生物降解研究自1941年就開始了，但長期以來一直集中于酶學的研究，1963年Baptist等，指出Pseudomonas putida菌利用烷烴的第一階段是將烷烴氧化成脂肪酸，然后進一步代謝。然而對其分子生物學的研究較晚，1973年，Chakrabarty發現在可利用中等鏈長（C₆～C₁₂）的烷烴中作唯一碳源和能源的P. putida GPo1（ATCC29347，曾被命名為P.oleovorans GPo1，或P.oleovorans TF4-1L）中，氧化烷烴的酶系是由一個大質粒OCT（辛烷降解質粒）上的基因編碼的。

1977年，Benson、Fennewald和Shapiro等對P. putida GPo1的OCT質粒的alk基因作圖表明：alk基因由兩個相隔約40kb的轉座子構成。1978年Fennewald等研究發現P. putida GPo1中alk基因的GC含量大大低于宿主菌基因組和OCT質粒，表明alk基因是整合在OCT質粒上的長約55kb的轉座子的一部分。1979年，Benson等指出編碼烷烴降解基因位于P. putida GPo1的OCT質粒上的兩個基因簇內。

1979年，Fennewald等用一系列的突變互補實驗證明，P. putida GPo1中alk基因聚集成兩個基因簇，形成了兩個被命名為alkBAC（可編碼烷烴羥化酶、后來被證實為紅素氧還蛋白的可溶性組分及醇脫氫酶）和alkR（可識別誘導物并調節alkBAC表達）的操縱子，這兩個操縱子相距約40kb。alkBAC可被非氧化烷烴誘導，伯醇、安慰誘導劑如DCPK（二環丙酮）等也能誘導其高效表達。

1984年，Owen等發現轉座子Tn7S只單方向插入alkBAC，并且以此方向相反的方向插入alkR，推斷這兩個操縱子的轉錄方向相反。1987年，Eggink及其同事從P. putida GPo1中的OCT質粒上用EcoR Ⅰ切出16.9kb和18kb長的兩個片斷，并將其克隆入pLAFRI黏粒載體中，構建成pGEC47質粒，為以后的研究創造了有利的條件。

Eggink、Kok和van Beilen等分析了插入pGEC47的alkBAC operon（7.5kb）和alkR的功能，并用小細胞（minicells）實驗證實，18kb長的插入片斷是編碼雙組分的烷烴羥化酶系和其他參與烷烴進一步氧化的各種酶的基因簇。

1992年，van Beilen等利用定點突變方法研究了P. putida GPo1菌株OCT質粒中alkB基因的功能，并利用融合蛋白的方法對AlkB蛋白的跨膜結構進行了研究。1994年，van Beilen等利用基因缺失互補的方法進一步研究了OCT質粒上alk基因功能，發現只有alkB、alkG和alkS不能被基因組上的基因所互補。

1999年，Canosa、Panke和Staijen等研究了插入pGEC47中的16kb片斷中alkS基因的表達對烷烴單加氧酶基因alkB的轉錄調節作用，發現alkS基因是alk的調節基因。2000年，Canosa等進一步研究了alkS的正反饋機制，在烷烴的誘導條件下，烷烴降解基因的啟動子被激活，整個基因簇表達。同時也發現了紅素氧還蛋白還原酶基因alkT與調節基因alkS整合在一起，構成了獨立于alkBAC之外的基因簇alkR。

alkBAC（1979年由Fennewald等命名）實際上由7個基因組成，可編碼7個多肽：alkB編碼烷烴羥化酶AlkB；alkF、alkG分別編碼紅素氧還蛋白AlkF和AlkG；alkH編碼醛脫氫酶AlkH；alkJ編碼醇脫氫酶AlkJ；alkK編碼脂酰CoA合成酶AlkK；alkL編碼一個功能未知的外膜蛋白AlkL，因而該操縱子后來被重新命名為alkBFGHJKL。

alkR由兩個基因組成：編碼具有誘導物識別功能的轉錄調節因子AlkS的alkS及編碼紅素氧還蛋白還原酶AlkT的alkT，因此alkR后來也被重新更名為alkST。

2001年，van Beilen等發現P. putida GPo1中alkBFGHJKL和alkST這兩個操縱子的間隔序列只有9.7kb，其中在alkL下游2kb處有1.5kb的序列，可編碼一個與接納甲基趨化蛋白（MCP，可識別萘等）氨基酸序列同源性達30%的蛋白AlkN。像前述的alk基因一樣，這個趨化受體基因的GC含量遠低于OCT質粒和P. putida GPo1基因組。此外，alkN的起始密碼子ATG的上游230bp的區域含有alkB基因的前76bp，并與alkB啟動子的同源性高達56%，推測alkN編碼烷烴趨化性轉導蛋白。

在詳細研究P. putida GPo1中OCT質粒上的alk基因的同時，其他能利用烷烴的微生物也受到廣泛關注。1999年，Smits等用兼并引物的PCR方法和基因組測序對不同來源的G⁺和G^-烷烴降解菌的alk基因進行了比較研究，結果顯示其他菌alk基因編碼的蛋白質大都是P. putida GPo1中相應酶的同系物，同源性為43.2%～93.8%。但是P. putida P1中的alk基因位于基因組上，并且也形成兩個操縱子alkBFGHJKL和alkST。平均而言，P. putida P1與 P. putida GPo1中相應的兩個基因簇的ORF分別有80%和92%的序列相似性，且大多數的Alk蛋白顯示出相似水平的同源性，功能一致，但P. putida P1的alk基因位于基因組上，基因間的相對位置也發生了改變。P. putida P1的alkST位于基因簇alkBFGHJKL的上游，兩個操縱子的間隔序列也較短，alkN只剩殘跡，稱alkN'，位于alkL的下游135bp處，該距離只比alkBFGHJKL操縱子編碼的間距稍遠一點。van Beilen等認為alkN∕alkN'是以前存在的alkBFGHJKLN操縱子的一部分，只是在進化過程中，該操縱子被插入序列（IS）所打斷。

2001年，Marin等從Burkholderia cepacia RR10的基因組上克隆出P.putida GPo1的alkB同系物（homologs）。2002年，Smith等從Pseudomonas aeruginosa PAO1、Pseudomonas fluorescens CHA0、Alcanivorax borkumensis AP1、Myco-bacterium tuberculosis H37Rv和Prauserella rugosa NRRL B-2295中克隆了alkB的同系物，并用缺失互補方法驗證了其功能，同時對其alk基因的結構進行了比較分析（圖1-3），發現不同AlkB蛋白之間的氨基酸序列同源性較低，只有35%左右；alk基因的結構在不同菌中有所差異，有些成簇存在，有些分散存在，并且不同菌株之間除了alkB基因外，其他基因在基因簇內并不一定出現；進化分析又表明Pseudomonas屬不同物種的AlkB之間親緣關系卻較近。進行功能互補分析還發現P.fluorescens CHA0的alkB基因屬于長鏈烷烴（C₁₂以上）降解基因，構建的alkB缺失菌P.fluorescens KOB2 Δ1可通過其他菌中的alkB基因互補，為分析和鑒定中長鏈烷烴降解菌的基因功能提供了較好的方法。另外，基因簇比較分析還發現在Pseudomonas aeruginosa PAO1的基因組中存在兩個相似的alkB基因，并對其alk基因進行了功能互補分析。2004年，Hara和van Beilen等又對Alcanivorax borkumensis的alkB1和alkB2進行了功能鑒定，說明在一個菌的基因組上有可能存在多個烷烴降解基因簇。

2001年，Smits等構建了E.coli和Pseudomonas穿梭質粒pCom系列，該質粒含有P.putida GPo1的PalkB啟動子和調節基因alkS，啟動子能用烷烴或安慰誘導物二環丙酮（dicyclopropyl ketone，DCPK）誘導表達，并且該質粒與pLAFR衍生質粒和Pseudomonas 的表達質粒RSF1010相兼容，因此，pCom系列質粒的建立為研究烷烴降解基因的功能提供了很好的工具。

1999年，Ger?d?rfer和Ratajczak等對Acinetobacter calcoaceticus ADP1的alk基因進行了研究，結果發現Acinetobacter calcoaceticus ADP1的alk基因也位于基因組上，與P. putida GPo1對應的基因同源性較高，但并不都形成操縱子，有些基因獨立存在（圖1-4）。在A. calcoaceticus ADP1中rubA（編碼紅素氧還蛋白）、rubB（編碼紅素氧還蛋白還原酶）、xcp（編碼一種分泌蛋白）、oxyR（烷烴降解非必需基因，編碼過氧化物反應調節因子）及estB（編碼一種脂酶）組成一個操縱子，該操縱子與alkM（編碼烷烴羥化酶）和alkR（編碼alkM的轉錄調節因子）距離很遠。但alkM和alkR距離較近，且轉錄方向相反。雖然這些基因與P. putida GPo1有所不同，但其編碼的蛋白功能卻相同，AlkM、RubA和RubB也形成一個類似于P. putida的三組分的烷烴單加氧酶復合物。

1996年，Sakai和Maeng等發現能利用長鏈烷烴的Acinetobacter sp.M-1，降解烷烴的最長碳鏈可達C₄₄。2001年，Tani等對Acinetobacter sp.M-1的烷烴降解基因與Acinetobacter sp.ADP1相似，但在Acinetobacter sp.M-1中存在著兩套alk基因：alkMa和alkMb，并分別受各自的調節基因alkRa和alkRb調節（圖1-4）。

然而，目前對G⁺菌的烷烴降解基因的分子生物學的研究較少。1998年，Cole等通過對Mycobacterium tuberculosis H37Rv基因組測序，預測并鑒定了其烷烴羥化酶基因；1999年，Smits等通過對G^-菌P.putida GPo1和Acinetobacter sp. ADP1的烷烴羥化酶氨基酸序列比對，發現了幾處高度保守區，他們選擇了分別包含兩個保守區的編碼序列設計出兼并引物，從G⁺菌Rhodococcus erythropolis NRRL B-16531和Prauserella rugosa NRRL B-2295中擴增出alkB的相似序列，并用互補生長實驗鑒定了其功能；2001年，Hamamura等又以相同的引物從Nocardioides sp.CF8擴增出了兩個alkB類似物，并且G⁺菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv和Prauserella rugosa NRRL B-2295的alkB基因也能在G^-菌的烷烴羥化酶缺失菌Pseudomonas flourescens CHA0和P.putida GPo12（pGEc47ΔB）中實現功能互補，證明了兩株菌的AlkB氧化烷烴范圍為C₁₀～C₁₆，也為G⁺菌烷烴降解基因的研究提供了有利的工具。2002年，加拿大的Whyte和瑞士的van Beilen等聯合報道了兩株Rhodococcus屬菌株Q15和NRRL B-16531的多重烷烴羥化酶系統，兩株菌都有四個烷烴降解基因簇（圖1-4），并且其alkB2基因簇結構與Mycobacterium tuberculosis H37Rv的alkB基因簇相似，但其他三個基因簇的結構相差較大；對各個基因簇的基因進行功能鑒定時又發現Q15和NRRL B-16531的alkB2能互補P.fluorescens KOB2Δ1中的alkB缺失（C₁₂～C₁₆），而不能在E.coli Gec137和P.putida GPo12中互補（C₆～C₁₂缺失），表明alkB2與C₁₂以上的烷烴羥化有關，并且只有NRRL B-16531的rubA2和rubA4能互補E.coli Gec137中的alkG 缺失，而Q15的rubA1和rubA2卻不能互補，只有Q15的rubB能互補E.coli Gec137中的alkT缺失，而NRRL B-16531的rubB不能互補，從而說明兩株菌的AlkB2至少與C₁₂～C₁₆的羥化有關，RubA2、RubA4和RubB主要是參與電子轉移，其他基因的功能未能得到鑒定可能是沒有合適互補表達系統。2002年，van Beilen等指出AlkB3、AlkB4常出現在能降解超過C₂₀的G⁺菌中，由于Rhodococcus降解烷烴的最大碳鏈長度為C₃₂～C₃₆，除了AlkB2檢測到功能外，極有可能AlkB1、AlkB3、AlkB4分別參與C₁₈～C₃₆的不同碳鏈長度烷烴的氧化。因此，有關G⁺菌的長鏈烷烴降解的分子生物學研究還不清楚，引起了許多微生物學工作者對該領域研究的高度重視。

最近，van Beilen等發現Mycobacterium sp.菌株中有細胞色素P450烷烴羥化酶CYP153，該酶與以前屬于膜蛋白的羥化酶明顯不同，而與Acinetobacter sp. EB104中的羥化酶CYP153A1相似，屬于胞內可溶性蛋白，但CYP153具有氧化C₁₂～C₁₆的功能，并在Pseudomonas GPo12中進行了功能互補，是一新的細胞色素P450家族成員。該研究為探索新的胞內可溶性烷烴單加氧酶提供了有利的依據。

近十多年來，從不同的環境中又分離到一些嗜熱解烴的微生物。1993年，Sorkhoh等從科威特沙漠的石油污染區分離到一株能降解C₁₅～C₁₇的Bacillus（Geobacillus）stearothermophilus；2001年，Kato等從地下油藏中分離到一株在70℃能降解C₂₃的Bacillus thermoleovorans；2003年，Feitkenhauter等分離到一株能降解C₁₆的Thermus brockii；2005年，Nazina等從高溫油田分離到兩株能降解C₆～C₁₆的Geobacillus jurassicus。直到2007年，南開大學劉如林等從大港油田地層水中分離獲得的嗜熱采油菌Geobacillus thermodenitrificans NG80-2，克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因，并對其進行了功能鑒定。NG80-2的烷烴單加氧酶屬于可溶性蛋白且具有耐高溫的特性，是世界上首次對嗜熱菌的烷烴降解基因研究。因此，探索和發現革蘭氏陽性菌尤其是功能性嗜熱菌的烷烴降解基因，將是一個艱巨的任務。