1.2　分子生物學(xué)在油藏微生物多樣性研究中的應(yīng)用

MEOR技術(shù)從所用的微生物來(lái)看，包括激活油層內(nèi)源微生物群落和注入在地下起作用的外源微生物兩種方法。較外源微生物采油技術(shù)相比，內(nèi)源微生物采油技術(shù)省去菌種開(kāi)發(fā)與評(píng)價(jià)、菌液發(fā)酵等繁瑣過(guò)程，具有適應(yīng)性廣、成本低的優(yōu)勢(shì)，是一項(xiàng)潛力巨大的微生物提高采收率技術(shù)。進(jìn)行內(nèi)源微生物采油，最關(guān)鍵的工作是深入調(diào)查分析地層中微生物群落以及限制微生物活躍增殖的環(huán)境因素。但目前，因?yàn)橛筒刂写罅康呢殸I(yíng)養(yǎng)微生物（uncultured microbes）和不依賴(lài)培養(yǎng)微生物（cultured independent microbes）在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中不宜生長(zhǎng)；同時(shí)，傳統(tǒng)技術(shù)在培養(yǎng)過(guò)程中都不可避免地將微生物置于偏離它們?cè)瓉?lái)的小環(huán)境的新的人為操縱的條件下，從而會(huì)改變有關(guān)微生物群落原來(lái)的結(jié)構(gòu)，微生物有機(jī)體有可能會(huì)偏離原來(lái)自然種群的生理習(xí)性，甚至有可能偏離它們?cè)瓉?lái)的基因型組合。因此，任何利用傳統(tǒng)微生物技術(shù)來(lái)正確認(rèn)識(shí)微生物生態(tài)系統(tǒng)的嘗試都會(huì)面臨障礙，也埋沒(méi)了大量有實(shí)用價(jià)值的微生物資源（未培養(yǎng)微生物約占99%），最終導(dǎo)致油藏微生物多樣性及生態(tài)學(xué)研究一直落后于其他群落微生物的研究水平。

另一方面，隨著環(huán)境的日益惡化和人們環(huán)保意識(shí)的不斷加強(qiáng)，石油污染問(wèn)題的嚴(yán)重性已經(jīng)引起了人們的極大關(guān)注。環(huán)境中的石油污染危害表現(xiàn)在土壤中石油的沉積對(duì)植物根系的損害造成植物的死亡，石油的某些有害成分在糧食中形成積累，并進(jìn)入食物鏈；同時(shí)污染地下水體，危及人類(lèi)健康；海洋中的石油污染使藻類(lèi)的光合作用受到嚴(yán)重影響，使其產(chǎn)氧量減少。可喜的是，對(duì)微生物修復(fù)研究的不斷深入，為石油污染的治理提供了新的方法，作為傳統(tǒng)的化學(xué)處理方法的延伸，直接利用土著微生物菌群可以處理石油污染物，但在許多條件下，由于土著微生物菌群的生長(zhǎng)受到限制，因而向環(huán)境中提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)激活降解微生物或篩選一些降解污染物的高效菌種強(qiáng)化降解作用，是生物修復(fù)的必然要求。因此，對(duì)石油污染環(huán)境進(jìn)行生物檢測(cè)，探索微生物生態(tài)與石油污染環(huán)境之間的相互關(guān)系，并從其中分離高效菌株成為環(huán)境微生物技術(shù)亟待解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，基因組學(xué)和現(xiàn)代分子技術(shù)的成熟逐漸滲透到有關(guān)生命科學(xué)的整個(gè)領(lǐng)域，也為微生物生態(tài)學(xué)提供了新的研究方法和機(jī)遇。自1985年P(guān)ace等以核酸測(cè)序技術(shù)研究微生物的生態(tài)和進(jìn)化問(wèn)題以來(lái)，對(duì)微生物的多樣性研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段，并逐步發(fā)展形成了成型的分子微生物生態(tài)學(xué)（molecular ecological technology of microorganisms）方法和技術(shù)。國(guó)際上大量的研究和開(kāi)發(fā)實(shí)踐證明，微生物分子生態(tài)學(xué)方法不受微生物是否可以分離培養(yǎng)的限制、不受微生物在實(shí)驗(yàn)室中是否活潑的限制，可以快速、準(zhǔn)確、全面和真實(shí)地分析復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，分子生態(tài)學(xué)方法的發(fā)展為研究石油微生物群落提供了一個(gè)新的工具。

1.2.1　微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)及其在石油微生物研究中的應(yīng)用

目前微生物分子生態(tài)學(xué)研究的焦點(diǎn)集中在具有保守序列的16S rRNA上，研究方法包括16S rRNA序列分析、核酸探針雜交法、PCR法、DGGE法、TGGE法、RFLP法等（表1-2）。以下分別介紹幾類(lèi)當(dāng)前主要的分子生物學(xué)研究方法及其在石油微生物生物多樣性研究中的應(yīng)用。

（1）16S rRNA序列分析

16S rRNA序列測(cè)定與分析方法對(duì)不同細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較分析是推斷細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)重要方法。基本原理就是從微生物樣本中的16S rRNA的基因片段，通過(guò)克隆、測(cè)序或酶切、探針雜交獲得16S rRNA序列信息，再與16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)或其他數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，從序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn)化距離，確定其在進(jìn)化樹(shù)中位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類(lèi)。Gerrit Voordouw等人通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增克隆測(cè)序研究了加拿大北部油田微生物群落的多樣性，檢測(cè)到多種革蘭氏陰性的SRB和許多有限數(shù)量的厭氧菌、發(fā)酵菌或產(chǎn)乙酸菌。Yah Takahata等人對(duì)日本新潟縣Kubiki 油藏內(nèi)的超嗜熱菌（hyperthermophiles）及其生化性質(zhì)進(jìn)行研究，通過(guò)16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)其中的超嗜熱菌主要是由熱球菌屬（Thermococcus）和棲熱袍菌屬（Thermotoga），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超嗜熱的球菌和桿菌能通過(guò)增強(qiáng)自身的抗饑餓能力和抗變溫能力在地下油藏內(nèi)生活，說(shuō)明它們?cè)诘叵聲?huì)有很大的分布。

（2）核酸探針雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)技術(shù)。核酸雜交技術(shù)快速，能靈敏地探測(cè)出環(huán)境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度測(cè)定法直接比較核酸雜交所得到的陽(yáng)性條帶或斑點(diǎn)就能得出定量的結(jié)果，從而反映出相關(guān)微生物的存在及功能。探針可以是長(zhǎng)探針（100～1000bp），也可以是短的寡核苷酸（10～50bp）；雜交方式可以是全細(xì)胞雜交（whole-cell hybridization）、數(shù)量印跡雜交（quantitative dot blot）、原位雜交（in situ hybridization）及生物芯片（biochip）。

（3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）

目前依靠在PCR試驗(yàn)中使用具有類(lèi)群特異性的引物，不進(jìn)行酶切、變性、克隆和電泳等后續(xù)手段，也能夠用來(lái)鑒別特定微生物類(lèi)群的存在。競(jìng)爭(zhēng)性PCR（competitive PCR）是其中較為常用的方法，具體操作是在同一反應(yīng)條件下，同一試管內(nèi)同步擴(kuò)增一段靶序列和另一段內(nèi)參序列，作為競(jìng)爭(zhēng)模板的內(nèi)參序列與靶序列使用相同的引物，并以相同效率擴(kuò)增。擴(kuò)增后，當(dāng)二者的終濃度相同時(shí)，理論上其模板濃度也應(yīng)相同。將待測(cè)標(biāo)本與10倍系列稀釋的競(jìng)爭(zhēng)模板混合，擴(kuò)增后分別用各自的熒光探針雜交，當(dāng)混合標(biāo)本中目的基因和內(nèi)參序列信號(hào)值相同時(shí)，待測(cè)標(biāo)本濃度即為該份混合物中競(jìng)爭(zhēng)模板的稀釋濃度。Kazuya Watanable等人使用8對(duì)通用古生菌引物對(duì)地下儲(chǔ)油罐中排出的地下污水中的古菌進(jìn)行16S rRNA序列分析，將其分為5個(gè)基因型，分別是KuA1、KuA6、KuA12、KuA16和KuA22，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性PCR的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在所有古菌拷貝中，KuA12含量最豐富，達(dá)到50%。

（4）基于PCR的基因指紋圖譜技術(shù)

環(huán)境樣品中的微生物DNA提取物必然是不同微生物的DNA混合物，被稱(chēng)為宏基因組（metagenom）。將宏基因組經(jīng)PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物是序列等長(zhǎng)但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多樣性和不同序列的豐富度在一定程度上反映了原始樣品中微生物種群的多樣性和不同物種的豐度。如果可以將這些序列等長(zhǎng)但不同源DNA片段分離開(kāi)，則可對(duì)樣品中微生物群落的組成進(jìn)行初步的分析。經(jīng)過(guò)多年研究，現(xiàn)在已經(jīng)有多種DNA指紋技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）。其中DGGE、TGGE和RFLP在石油微生物研究中使用較為廣泛，下面將著重加以介紹。

a.變性梯度凝膠電泳（DGGE）

DGGE技術(shù)是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于檢測(cè)DNA突變的一種電泳技術(shù)。1993年Muzyers等首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于分子微生物學(xué)研究領(lǐng)域，并證實(shí)了這種技術(shù)在揭示自然界微生物區(qū)系的遺傳多樣性和種群差異方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性。DGGE技術(shù)檢測(cè)核酸序列是通過(guò)不同序列的DNA片段在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降，最后在其相應(yīng)的變性劑梯度位置停滯，經(jīng)過(guò)染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更高，可以檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異。R?ling等對(duì)被石油污染的海岸進(jìn)行模擬研究，分析營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的投放及投放方式對(duì)微生物群落降解石油的影響。他們利用DGGE對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，與沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的投放相比，固體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的投放能夠使石油降解速度加快，使微生物群落結(jié)構(gòu)的變化加快，而液體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效果要更加明顯，并發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的投放會(huì)使具有相同結(jié)構(gòu)的微生物種群產(chǎn)生不同的降解速率。

b.溫度梯度凝膠電泳（TGGE）

TGGE技術(shù)的基本原理與DGGE技術(shù)相似，含有高濃度甲醛和尿素的凝膠溫度梯度呈線性增加，這樣的溫度梯度凝膠可以有效分離PCR產(chǎn)物及目的片段。但TGGE與DGGE相比，梯度形成更加便捷，重現(xiàn)性更強(qiáng)。Pu-Yi Cheung等人對(duì)石油污染土壤微生物降解多環(huán)芳烴（PAH）進(jìn)行研究，他們使用分枝桿菌（Mycobacterium）的特異性引物對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行TGGE分離，TGGE圖譜顯示，重度污染土壤中微生物群落的多樣性低于輕度污染的土壤中微生物群落。

c.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）

1980年，Botsein提出DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）可以作為遺傳標(biāo)記。RFLP最初比較簡(jiǎn)單，但是當(dāng)時(shí)該技術(shù)需要依賴(lài)southern blot技術(shù)，克隆基因作探針，工作量很大；而且DNA用量較大（5～10μg），純度要求高。為克服RFLP技術(shù)的缺點(diǎn)，學(xué)者們將PCR應(yīng)用于RFLP分析，發(fā)明了PCR-RFLP技術(shù)。PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標(biāo)記，反應(yīng)后用合適的限制酶切、電泳分析，再根據(jù)片斷的大小不同以及標(biāo)記片斷種類(lèi)和數(shù)量的不同分析群落的結(jié)構(gòu)及組成多樣性，或檢測(cè)因環(huán)境改變引起的微生物群落的變化。因此，現(xiàn)在很多研究人員利用PCR-RFLP來(lái)研究環(huán)境微生物的多樣性。Orphan等人對(duì)美國(guó)加利福尼亞州高溫富硫油藏內(nèi)的嗜熱微生物群落進(jìn)行研究。他們分別用細(xì)菌通用引物和古生菌引物對(duì)環(huán)境DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了細(xì)菌克隆文庫(kù)和古生菌克隆文庫(kù)，然后利用RFLP對(duì)克隆文庫(kù)分別進(jìn)行分析，通過(guò)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)硫降解菌、產(chǎn)甲烷菌在油藏內(nèi)部具有廣泛的分布，并且對(duì)C、H、S的地球生物化學(xué)循環(huán)有重要作用。

d.末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）

T-RFLP又被稱(chēng)為16S rRNA基因的末端限制性片段（terminal restriction fragment，TRF）分析技術(shù)，是一種最近才出現(xiàn)的研究微生物多態(tài)性的分子生物學(xué)技術(shù)。相對(duì)于其他的分子生物學(xué)手段，T-RFLP技術(shù)具有三個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)：①序列數(shù)據(jù)庫(kù)具有直接參考意義，即從消化產(chǎn)物中獲得的所有的末端片段大小，可以與序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的末端片段相對(duì)比，從而可以做系統(tǒng)發(fā)育的推斷；②核酸測(cè)序技術(shù)要比DGGE或者SSCP所依賴(lài)的電泳系統(tǒng)獲得的結(jié)果更為可靠；③T-RFLP的毛細(xì)管凝膠電泳分析更為快速，而且結(jié)果是以數(shù)據(jù)的形式輸出。T-RFLP技術(shù)的這三個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)必然使其成為一種理想的群落對(duì)比分析的方法。因此，T-RFLP已經(jīng)越來(lái)越受到相關(guān)研究人員重視。Wen Tso Liu等人利用T-RFLP法分析了活性污泥、生物反應(yīng)器內(nèi)污泥、含沙水層中微生物種群的多樣性，是最早利用T-RFLP技術(shù)進(jìn)行微生物群落對(duì)比分析的研究之一。因此，我們可以考慮將這門(mén)新出現(xiàn)的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到對(duì)石油微生物群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)中，建立環(huán)境中各優(yōu)勢(shì)菌群的峰值圖譜，可在短時(shí)間內(nèi)確定石油微生物種群的豐度及均勻度等各特征值，為快速檢測(cè)石油微生態(tài)系統(tǒng)的變化提供可靠的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2　變性梯度凝膠電泳DGGE的原理和應(yīng)用

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來(lái)檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變。Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。此后十年間，該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。

1.2.2.1　原理

雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA片段能夠被區(qū)分開(kāi)，但同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。一個(gè)特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域（meltingdomain，MD）和解鏈行為（melting behavior）。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成（圖1-1）。當(dāng)溫度逐漸升高（或是變性劑濃度逐漸增加）達(dá)到其最低的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈。當(dāng)溫度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域溫度時(shí)，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到溫度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域溫度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而使雙鏈DNA完全解鏈。圖1-1顯示的是一個(gè)234bp長(zhǎng)的DNA片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA片段的序列，依次從第一個(gè)堿基到第234個(gè)堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA片段共有3個(gè)解鏈區(qū)域。MD1是解鏈溫度最低的一個(gè)解鏈區(qū)域，MD3是溫度最高的一個(gè)解鏈區(qū)域。

不同的雙鏈DNA片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時(shí)，一開(kāi)始溫度（或變性劑濃度）比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦DNA片段遷移到一特定位置，其溫度（或變性劑濃度）剛好能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時(shí)，雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段會(huì)在膠中不同位置處達(dá)到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈溫度，發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開(kāi)來(lái)。

然而，一旦溫度（或變性劑濃度）達(dá)到DNA片段最高的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，DNA片段會(huì)完全解鏈，成為單鏈DNA分子，此時(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此如果不同DNA片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時(shí)，這些片段就不能被區(qū)分開(kāi)來(lái)。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30～50個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問(wèn)題。含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區(qū)域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈溫度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC夾子后，DNA片段中每個(gè)堿基處的序列差異基本上都能被區(qū)分開(kāi)。

當(dāng)用DGGE技術(shù)來(lái)研究微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，要結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)，用PCR擴(kuò)增的16S rRNA產(chǎn)物來(lái)反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。通常根據(jù)16S rRNA基因中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5’-端含有一段GC夾子，用來(lái)擴(kuò)增微生物群落基因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE分析。

DGGE有兩種電泳形式：垂直電泳和水平電泳。前者是指變性劑梯度或溫度梯度的方向與電泳方向垂直；后者是指兩個(gè)方向是平行的。在分析微生物群落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，一般先要用垂直電泳來(lái)確定一個(gè)大概的變性劑范圍或溫度范圍。垂直電泳時(shí)，膠從左到右是變性劑梯度或溫度梯度。在膠的左邊，變性劑濃度或溫度低，DNA片段是雙鏈形式，因此沿著電泳方向一直遷移。在膠的另一邊，由于變性劑濃度或溫度高，DNA一進(jìn)入膠立刻就發(fā)生部分解鏈，因此遷移很慢。在膠的中間，DNA片段有不同程度的解鏈。在變性劑濃度或溫度臨界于DNA片段最低的解鏈區(qū)域時(shí)，DNA的遷移速率有急劇的變化。因此，DNA片段在垂直膠中染色后呈S形的曲線。根據(jù)垂直電泳確定的范圍，再用水平電泳來(lái)對(duì)比分析不同的樣品。

通過(guò)各種染色方法可以看到DGGE膠中的DNA條帶。最常用的幾種染色方法是溴化乙啶（EB），SYBR Green Ⅰ，SYBR Gold和銀染法。EB法染色的靈敏度最低。SYBR Green Ⅰ和SYBR Gold相比EB，能更好地消除染色背景，因此它們的檢測(cè)靈敏度比EB法高很多。EB和SYBR染色時(shí)，雙鏈DNA能很好地顯色，單鏈DNA基本上不能顯色。銀染法的靈敏度最高，它不但能染雙鏈DNA，也能染單鏈DNA，但它的缺點(diǎn)是不能用于隨后的雜交分析。

1.2.2.2　PCR-DGGE在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

PCR-DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的一個(gè)主要用途是分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成。Muyzer等人于1993年首次將該技術(shù)用于研究微生物菌苔和生物膜系統(tǒng)的群落多樣性。此后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括土壤、活性污泥、人體和動(dòng)物腸道、溫泉、植物根系、海洋、淡水湖、油藏等。絕大部分研究都是通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌或古細(xì)菌的16S rRNA基因來(lái)研究各生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌或古細(xì)菌群落多樣性。也有用真菌的通用引物擴(kuò)增18S rRNA基因，從而研究真菌的群落多樣性。

除了通過(guò)核糖體RNA基因來(lái)分析微生物群落結(jié)構(gòu)外，還可以通過(guò)擴(kuò)增功能基因來(lái)研究功能基因及功能菌群的多樣性。氨單加氧酶（ammonia monooxygenase gene，amoA）基因被用來(lái)研究氨氧化菌群；氫化酶基因被用來(lái)研究硫酸鹽還原菌群；多組分苯酚羥化酶大亞基基因（the largest subunit of the multi-component phenol hydroxylase，LmPH）被用來(lái)研究降酚菌群。PCR-DGGE技術(shù)的另一大優(yōu)點(diǎn)是能快速同時(shí)對(duì)比分析大量的樣品。因此它既可以對(duì)比分析不同的微生物群落之間的差異，也可以研究同一個(gè)微生物群落隨時(shí)間和外部環(huán)境壓力的變化過(guò)程。

除了上述兩個(gè)主要用途外，PCR-DGGE技術(shù)還有很多其他用途。它可以跟蹤監(jiān)測(cè)細(xì)菌的富集和分離，從而評(píng)價(jià)不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)分離菌種的影響；可以檢測(cè)單個(gè)純菌rRNA基因的微異質(zhì)性；可以用來(lái)比較不同的DNA提取方法；另外，它還可以輔佐篩選克隆文庫(kù)以及檢測(cè)PCR和克隆過(guò)程中的偏差。

1.2.2.3　DGGE技術(shù)的缺陷及優(yōu)化

在用分子生物學(xué)方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時(shí)，有很多偏差。不同細(xì)菌的基因組大小和核糖體RNA拷貝數(shù)不同；提取基因組總DNA時(shí)細(xì)胞的裂解效率不同；DNA提取和純化時(shí)有偏差；PCR擴(kuò)增過(guò)程中有偏差。除了這些，在應(yīng)用DGGE技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成時(shí)還有很多其他的缺陷。DGGE一般只能分析500個(gè)堿基對(duì)以下的DNA片段，因此得到的系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)的信息就很少。

（1）在研究復(fù)雜環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)（如土壤、人體腸道）時(shí)，涉及的微生物種類(lèi)很多。但DGGE圖譜中一般只有一二十個(gè)條帶，這些條帶反映的是群落中的優(yōu)勢(shì)菌群。一般只有在總的微生物群落中占1%以上的種群才能被檢測(cè)出來(lái)，系統(tǒng)中的弱勢(shì)菌群不能被檢測(cè)到。為了降低分析群落多樣性時(shí)的復(fù)雜度，一種方法是先根據(jù)GC含量的不同，將基因組總DNA分成各個(gè)部分，再分別通過(guò)PCR-DGGE分析。另一個(gè)方法是使用類(lèi)群特異性（group-specific）引物對(duì)基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用于DGGE分析。

（2）在設(shè)計(jì)PCR引物去擴(kuò)增某些特定菌群時(shí)，由于某些菌群的序列相互之間同源性不是很高，因此需要設(shè)計(jì)兼并性引物。此時(shí)，相同的微生物會(huì)有2個(gè)條帶，這會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成造成高估。另外，同一個(gè)細(xì)菌也可以有多個(gè)核糖體RNA操縱單元，它們的序列可以有微小差異，這也會(huì)高估微生物群落多樣性。

（3）DGGE的電泳條件不一樣，即使相同的樣品所得的圖譜也會(huì)有差異。在應(yīng)用DGGE時(shí)，如果所用電壓太低，需要的電泳時(shí)間就很長(zhǎng)，變性劑梯度會(huì)有變化，因此導(dǎo)致圖譜也會(huì)有變動(dòng)。

（4）DGGE的一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)膠中所感興趣的條帶進(jìn)行研究，得到它們的序列，從而可以直接獲得和系統(tǒng)生態(tài)功能相關(guān)的微生物種群的系統(tǒng)進(jìn)化信息。以前研究DGGE膠中單一條帶序列組成的一個(gè)比較普遍的方法是先構(gòu)建整個(gè)微生物群落的16S rRNA克隆文庫(kù)，然后再對(duì)文庫(kù)中的克隆進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)將DGGE和原始樣品的條帶進(jìn)行對(duì)比，能遷移到相同位置處的克隆的序列就是原始條帶所含的序列。然而，已有研究表明，不同的DNA條帶在DGGE膠中可以遷移到相同的位置，因此單一DGGE條帶可能含有不止一種序列。這種情形在分析復(fù)雜環(huán)境樣品時(shí)會(huì)更多。

（5）研究DGGE膠中單一條帶序列組成的方法是直接從膠中回收DNA，然后構(gòu)建其克隆文庫(kù)，再對(duì)其中的克隆進(jìn)行測(cè)序。然而，PCR過(guò)程中產(chǎn)生的異源雙鏈（heteroduplex）和單鏈DNA（single-stranded DNA）也會(huì)對(duì)分析單一條帶序列造成偏差。

1.2.3　基于16S rRNA的分子生物學(xué)方法的組合

考慮到一般的分子生物學(xué)方法雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但又都有不足之處，在實(shí)際進(jìn)行微生物群落生物多樣性研究時(shí)，往往需要將兩種以上的方法組合起來(lái)使用，這樣可以有效地提高檢測(cè)的精度，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，并且可以克服一些實(shí)驗(yàn)中存在的困難。在一般的克隆中，為了使回收的序列具有代表性，通常需要選取相當(dāng)數(shù)量的單菌落進(jìn)行序列回收。回收的序列最好全部進(jìn)行測(cè)序，但限于測(cè)序費(fèi)用，不可能將回收的全部序列測(cè)序，就需要先進(jìn)行篩選，剔除重復(fù)序列，僅將代表性的、豐度較大的序列測(cè)序。序列篩選一般采用前面提到的DNA指紋技術(shù)，例如DGGE、RFLP、ARDRA等。Gisele Laguerre等人應(yīng)用ARDRA技術(shù)對(duì)48株根瘤菌菌株進(jìn)行了分析，所得的結(jié)果與其他分類(lèi)學(xué)方法進(jìn)行了比較。顯示ARDRA法所得到的PCR-RFLP 16S rDNA的基因型與16S rDNA測(cè)序所得結(jié)果一致。所得數(shù)據(jù)反映的基因型關(guān)系與DNA-rRNA雜交及16S rRNA測(cè)序結(jié)果相符合，并對(duì)未知根瘤菌進(jìn)行了有效的區(qū)分和歸類(lèi)。Lisa ?vre?s等人將ARDRA、寡核苷酸探針雜交、REP-PCR、DGGE等方法結(jié)合起來(lái)對(duì)兩個(gè)微生物生態(tài)系統(tǒng)的可培養(yǎng)細(xì)菌和細(xì)菌總量的多樣性，以及微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和比較。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示將多種分子生物學(xué)方法結(jié)合可以獲得相比于單個(gè)方法更廣泛的微生物群落信息。

另外，John Dunbar等人認(rèn)為對(duì)克隆基因文庫(kù)進(jìn)行RFLP法或測(cè)序法分析能夠提供關(guān)于微生物群落多樣性的最詳細(xì)、最可靠的信息。柳承璋等則認(rèn)為，克隆+克隆文庫(kù)分析試驗(yàn)方案的精確度不適于用來(lái)做群落結(jié)構(gòu)空間和時(shí)間尺度上定量的生態(tài)學(xué)研究，但若將克隆+克隆文庫(kù)分析法與T-RFLP結(jié)合使用，則可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，因?yàn)門(mén)-RFLP可以提供微生物的種類(lèi)和相對(duì)數(shù)量的信息，盡管還是無(wú)法確定是何種微生物，定性信息不足，但將其與16S rRNA克隆文庫(kù)分析或者核酸雜交分析結(jié)合，即可確定微生物的種類(lèi)，獲得最優(yōu)化的信息。JoséM González等人對(duì)赤潮海域的細(xì)菌做了16S rDNA克隆文庫(kù)測(cè)序和T-RFLP分析，對(duì)其中的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行了分析。