2.3　實驗方法

2.3.1　水樣中細菌總DNA的提取

將1L水樣用濾紙過濾后，4℃于5000r/min離心20min得菌體，用酶法和化學法相結合的方法提取基因組DNA，方法如下。

2.3.1.1　化學裂解法

離心所得菌體重懸于5mL 50mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）中，然后加入4mL 250mmol/L EDTA 和1mL 250mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 10mg/mL溶菌酶，輕輕搖勻后，37℃保溫30min。加入1mL 10% SDS和200μL蛋白酶K，搖勻后55℃保溫30min。然后進行蛋白抽提，加入與上清液等量的酚-氯仿-異戊醇溶液，反復抽提兩次，直至中間層沒有明顯的蛋白質析出為止。將上清液轉移到新離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇溶液，室溫靜置30min；常溫下10000r/min離心20min，倒棄上清液，干燥后加入1mL 70%乙醇洗滌，離心去除酒精風干后，將沉淀溶于500μL TE緩沖液（10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8）中。所提取DNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察，通過測定樣品在260nm的吸光值進行定量分析，確定所提取DNA的濃度。

2.3.1.2　液氮研磨法

離心所得菌體重懸于5mL 50mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）中，先用液氮進行研磨破碎細胞，再加入4mL 250mmol/L EDTA和1mL 250mmol/L Tris-HCl （pH 8.0） 10mg/mL溶菌酶作用，后續步驟同上。所提取的基因組DNA置于-20℃保存備用。

2.3.2　基因組總DNA高可變區的擴增

從水樣基因組中擴增細菌16S rDNA的V3、V8和V9可變區片段（表2-1）。擴增反應體系50μL，包括5μL 10×Buffer、4μL dNTP Mixture（各10mmol/L）、1μL正向引物（20μmol/L）、1μL反向引物（20μmol/L）、1μL DNA模板和1U Taq DNA聚合酶；PCR擴增采用TouchDown PCR方法，改進后反應條件為：94℃預變性5min，循環過程為94℃ 1min，退火溫度 1min，72℃ 3min（其中退火溫度從65～52℃，每個溫度3個循環）；之后再進行15個循環（94℃ 1min，55℃退火1min，72℃ 3min）；72℃再延伸10min，4℃終止。每個反應設置一個空白對照，即在反應體系中不添加模板而是用同體積無菌水替代，以排除引物等污染的可能。PCR反應產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳來消除普通PCR過程中的單鏈DNA和雜合雙鏈DNA污染。

2.3.3　16S rDNA序列可變區的DGGE分析

16S rDNA的V3、V8和V9可變區PCR擴增片段利用Dcode^TM Universal Mutation Detection System（Bio-Rad）進行DGGE分離。膠板面積為16cm×16cm。DGGE條件為：6%的聚丙烯凝膠，40%～60%的變性劑梯度（100%的變性劑為7mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物），將200ng PCR產物加入點樣孔中，在7L 1×TAE緩沖液中，60℃恒溫，160V恒壓條件下電泳200min。電泳完畢后用EB染色，在添加20μL 10mg/mL EB的250mL 1×TAE緩沖液中染色5min后，在相同體積1×TAE緩沖液中脫色后，通過Bio-Rad凝膠成像系統來成像。

2.3.4　DNA片段序列分析

切割凝膠上的優勢條帶用Biospin聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒回收，所得DNA片段用不帶GC夾的V9區引物擴增后連接到pGEM-T載體上，采用CaCl₂法轉化入E.coli DH5α中。

待轉化子長出后，從每個條帶對應的大量轉化子中隨機挑選三個白色菌落，通過酶切鑒定為陽性轉化子后，送至北京三博測序公司測序。如果這三個克隆序列不一致，需挑選更多的轉化子進行測序，目的是消除DGGE彌散條帶的干擾及回收時的污染。序列測定使用ABI 377自動測序儀和T7引物。將測序結果在GenBank/EMBL/DDBJ中比對，以確定其進化地位和親緣。序列差異小于3%即被認為屬于同一種系型，每個種系型都有對應的序列。采用Clustal X進行序列的比對，用Mega3.1軟件中Kimura Two-parameter模和neighbor-joining算法進行各序列間的同源性和進化距離的分析與比較，構建系統發育樹。

2.3.5　高溫解烴菌的分離

2.3.5.1　傳統富集培養法分離

取水樣振蕩均勻后用無菌移液管取10mL，接種至100mL含有2%液蠟的無機鹽培養基中（培養基組成：KH₂PO₄ 0.3g；Na₂HPO₄·12H₂O 1.25g；NH₄Cl 2.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；CaCl₂·2H₂O 0.01g；FeSO₄·7H₂O 0.36g；酵母提取物0.5g；蔗糖1.0g；蒸餾水1000mL；pH=7.2），55℃振蕩培養5d。將富集培養液充分混勻，涂布在營養肉湯瓊脂平板或無機鹽液蠟瓊脂平板上，50～70℃培養2d，觀察長出的菌落。

2.3.5.2　直接培養法分離

直接取水樣涂布在地層水上清液瓊脂平板上，50～70℃兼性厭氧培養2～14d，觀察長出的菌落。挑取單菌落劃線培養并用顯微鏡檢驗其純度。

2.3.5.3　特殊培養法分離

模擬油田實際水樣組成加入氮源、磷源或生長因子，50～70℃兼性厭氧培養2～14d，然后將培養液分別涂布在營養肉湯瓊脂平板、10倍稀釋的營養肉湯瓊脂平板或無機鹽液蠟瓊脂平板上，挑選長出的不同菌落。

2.3.5.4　高溫解烴菌的選育

將高溫下生長的各個菌落，接種至普通LB液體培養基中，培養至OD_630nm為0.8左右，作為種子液以10%（體積比）比例接入100mL無機鹽液蠟培養基中，50～70℃兼性厭氧培養5d。以此為種子液，接種至新鮮的無機鹽液蠟培養基中，反復馴化菌種3～4次，選取對液蠟乳化良好的菌種，接至以原油為碳源的無機鹽培養基中，測定菌株對原油的降黏、降凝效果，并使用紅外測油儀測定菌株對原油的降解率。

2.3.6　高溫解烴菌的16S rDNA鑒定

2.3.6.1　小量提取細菌基因組總DNA

①挑LB平板上新鮮活化的單菌落于5mL LB培養基中，25℃振蕩培養24h。

②轉移3mL菌液于5mL離心管中，4℃，12000r/min，離心5min，棄掉上清。

③將細菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，盡量空干上清液。

④將沉淀重懸于1mL 50mmol/L Tris （pH 8.0）緩沖液中，然后加入0.2mL新鮮配制的溶菌酶溶液（10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0）和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混勻后于37℃處理1h，再加入200μL 10%SDS溶液，混勻后放置于55℃處理5min。

⑤加入等體積的酚-氯仿（1∶1），蓋好上下顛倒混勻3min，12000r/min，離心10min。

⑥轉移上相至新的離心管中，重復步驟⑤直到無白色變性蛋白層出現。

⑦取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h。

⑧重復步驟⑤。

⑨在上相中加入1/10體積的3mol/L NaAc（pH 5.2）和2倍體積的冷無水乙醇，-20℃放置30min。

⑩4℃，12000r/min離心10min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗兩次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存備用。

2.3.6.2　PCR擴增16S rDNA序列

①以上述細菌基因組總DNA為模板，擴增所用引物為：上游引物5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；下游引物5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。

②PCR反應體系

③PCR反應條件

94℃預變性5min，94℃ 45”，56.2℃ 45”，72℃ 1.5min，30個循環；72℃ 9min，4℃停止。

④純化PCR產物

PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用天為時代柱式回收試劑盒回收純化PCR產物。

⑤PCR產物測序

直接采用pGM-T easy vector system kit，4℃連接過夜，轉化CaCl₂法制備的DH5α感受態（分子克隆），轉化子在含X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上，進行藍白斑篩選，選擇有合適大小插入片段的單克隆測序，測序工作由北京三博遠志生物有限責任公司完成。

2.3.6.3　構建進化樹

將菌株16S rDNA的序列與GenBank數據庫中序列比對，同3.4方法構建系統發育樹。