高效液相色譜法檢測(cè)黑皮雞樅菌中的水溶性維生素

李崇陽，李艷，孫凱，牟德華^*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

雞樅菌（Termitomyces albuminosus）又叫傘把菇、雞絲菇、蟻巢傘、三壇菌等^[1-2]，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，口蘑科，是一種味道鮮美、營養(yǎng)豐富的珍貴野生食用菌^[3-4]，主要分布在南亞、東亞、非洲以及南太平洋島嶼等熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國云南省是世界雞樅菌的主要分布區(qū)域之一，種類豐富且產(chǎn)量較大。維生素是一種維持機(jī)體正常生理功能所必需的營養(yǎng)物質(zhì)^[5]，它不是構(gòu)成機(jī)體組織和細(xì)胞的原料，也不是能量的主要來源，而是一種在物質(zhì)代謝中起重要作用的調(diào)節(jié)物質(zhì)。絕大多數(shù)維生素在體內(nèi)不能合成或合成量很少，不能滿足機(jī)體的需求，需要通過額外攝入食物來補(bǔ)充，盡管機(jī)體需求量很少但一旦攝入量不足就會(huì)引起相應(yīng)的維生素缺乏癥，造成機(jī)體的損傷。按照維生素的溶解性可分為水溶性和脂溶性兩類，水溶性維生素主要包括維生素C和部分B族維生素（B₁、B₂、B₆、B₁₂、煙酸、葉酸和泛酸），脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K等。檢測(cè)維生素的方法主要有分光光度法^[6]、熒光分析法^[7]、薄層色譜法^[8]和液相色譜法^[9-12]等。高效液相色譜法（HPLC）操作簡單、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，是目前檢測(cè)食品中水溶性維生素最常用的方法。大量文獻(xiàn)^[13-15]針對(duì)雞樅菌中的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、總糖、還原糖、灰分和礦物元素等基礎(chǔ)成分進(jìn)行了分析研究，至今未見對(duì)雞樅菌中維生素類營養(yǎng)成分的分析報(bào)道。本研究旨在建立采用HPLC-UV同時(shí)定性、定量分析檢測(cè)新鮮黑皮雞樅菌和菌粉中7種水溶性維生素的方法，為其深度開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

新鮮黑皮雞樅菌和菌粉均由河北靈濟(jì)食用菌有限公司提供。

維生素C標(biāo)品為分析純，天津博迪化工股份有限公司；維生素B₁、B₂、B₆、B₁₂、煙酸和葉酸標(biāo)品均購自美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉和三乙胺均為分析純；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水。

1.2　儀器與設(shè)備

SHIMADZU高效液相色譜儀(HPLC)LC-20A，日本島津公司；Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱，日本島津公司；Spectrum 756p紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ш循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；DELTA320pH 計(jì)、ARI140 型電子分析天平、微孔過濾器等。

1.3　方法

1.3.1　溶液的配制

流動(dòng)相的配制：稱取6.8g KH₂PO₄，溶于1000ml水中，得到0.05mol/L的KH₂PO₄溶液^[16]，用三乙胺調(diào)節(jié)pH=6.0。流動(dòng)相使用前用0.45μm膜過濾后超聲脫氣 15min。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取維生素C、B₁、B₂、B₆、B₁₂、煙酸和葉酸標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，維生素C、B₁、B₆、B₁₂、煙酸直接用娃哈哈純凈水溶解后定容到10ml棕色容量瓶中，B₂和葉酸先用少量0.1mol/L NaOH溶液溶解后再用娃哈哈純凈水定容到10ml棕色容量瓶中，得到濃度均為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用^[17]，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液臨用新配。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：分別吸取維生素B₁、B₁₂標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.8ml，維生素B₆、煙酸和葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.4ml，維生素C、B₂標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.1ml，混合在一起得到混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，再用娃哈哈純凈水稀釋到所需的濃度，進(jìn)樣前過0.45μm膜。

1.3.2　樣品的制備

新鮮黑皮雞樅菌樣品處理：隨機(jī)挑選新鮮的黑皮雞樅菌→分成菌蓋、菌腿和完整菌三份樣品→分別切丁→打漿→充分研磨→稱取適量樣品→加45ml娃哈哈水→超聲提取30min→4500r/min離心15min→布氏漏斗過濾→取濾液定容到50ml→過0.45μm膜→進(jìn)樣。

黑皮雞樅菌菌粉的處理：稱取適量菌粉→加45ml娃哈哈水→超聲提取30min→4500r/min離心15min→布氏漏斗過濾→取濾液定容到50ml→過0.45μm膜→進(jìn)樣。

1.3.3　色譜條件

流動(dòng)相：A．0.05mol/L KH₂PO₄溶液（pH=6.0）；B．甲醇。流速0.8ml/min，柱溫為室溫，檢測(cè)波長268nm；進(jìn)樣量20μl。梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.3.4　維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限和定量限

取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋成6個(gè)不同濃度值，每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣3次取平均值，以響應(yīng)值峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x作線性方程：y=ax+b，進(jìn)行線性回歸分析。檢出限（LOD）為3倍信噪比，定量限（LOQ）為10倍信噪比。

1.3.5　精密度和回收率

精密度：取20μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來表征方法的精密度。

回收率：實(shí)驗(yàn)采用不含維生素的樣品為基質(zhì)進(jìn)行空白加標(biāo)，分3個(gè)濃度值以外標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率，每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣5次，以加標(biāo)回收率來表征方法的準(zhǔn)確性。

1.4　數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件進(jìn)行處理。所有線性方程、精密度及回收率實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2007處理得出。

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的優(yōu)化

2.1.1　檢測(cè)波長的選擇

通過紫外可見分光光度計(jì)對(duì)7種水溶性維生素標(biāo)品溶液進(jìn)行全波長掃描，最佳吸收波長見表2。

由表2可知7種水溶性維生素的最佳吸收波長雖不一致，但較為接近，在270nm左右均有較高的吸光度，因此本研究確定實(shí)驗(yàn)的最終檢測(cè)波長為268nm。

2.1.2　色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了Hypersil ODS2（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱和Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱對(duì)7種水溶性維生素的分離效果，結(jié)果表明使用Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱時(shí)，7種維生素實(shí)現(xiàn)了良好的分離，分離度大于3且峰形尖銳，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱。

2.1.3　流動(dòng)相pH值的確定

流動(dòng)相的pH值是影響維生素分離的一個(gè)重要因素，實(shí)驗(yàn)研究了不同pH值的流動(dòng)相KH₂PO₄溶液對(duì)7種水溶性維生素的分離效果，結(jié)果表明，當(dāng)pH<6時(shí)維生素B₁和B₆不能完全分離，當(dāng)pH=6時(shí)7種水溶性維生素實(shí)現(xiàn)了良好的分離，當(dāng)pH>6時(shí)7種水溶性維生素雖能分離但峰面積有減少的趨勢(shì)，且部分維生素特別是維生素C在偏中性條件下不穩(wěn)定，綜合考慮最終確定流動(dòng)相的pH=6。在調(diào)節(jié)pH值時(shí)，實(shí)驗(yàn)比較了0.1mol/L NaOH溶液和三乙胺對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明使用三乙胺調(diào)節(jié)pH值時(shí)，操作更簡單且峰形明顯優(yōu)于NaOH溶液。

2.1.4　流速和柱溫的選擇

研究比較了流動(dòng)相的流速對(duì)7種水溶性維生素分離效果的影響，結(jié)果表明，在流速分別選擇0.6ml/min、0.8ml/min和1.0ml/min時(shí)，流速為0.6ml/min 分離時(shí)間較長且出峰時(shí)間靠后；流速為0.8ml/min和1.0ml/min時(shí)，7種維生素均可在22min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離，考慮到流速越大泵壓越高，對(duì)色譜柱和儀器損傷較大，因此最終確定流速為0.8ml/min。改變柱溫發(fā)現(xiàn)除了保留時(shí)間略微縮短之外對(duì)維生素的分離和定性定量分析沒有明顯的影響，因此選擇在室溫條件下操作。

2.1.5　梯度洗脫程序的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)首先研究了在等度洗脫條件下7種維生素的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)有機(jī)相的濃度進(jìn)行等度洗脫不能實(shí)現(xiàn)維生素的良好分離，因此改為梯度洗脫，并通過對(duì)梯度洗脫程序的不斷優(yōu)化最終確定了表1所示的洗脫程序，7種維生素在22min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好分離，且分離度都大于3。

通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，7種維生素實(shí)現(xiàn)了分離和同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

由圖1可知7種維生素均達(dá)到了基線分離，可用于維生素的定性定量分析。

2.2　維生素檢測(cè)方法的建立

2.2.1　維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限和定量限

按照最優(yōu)色譜條件對(duì)各維生素標(biāo)品進(jìn)行HPLC分析，各維生素的線性相關(guān)系數(shù)R²、線性范圍、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）如表3所示。

由表3可知各維生素的線性相關(guān)系數(shù)在0.9996～1.0000之間，表明線性關(guān)系良好，最低檢出限在0.15～1.52μg/ml之間，定量限在0.49～5.08μg/ml之間。

2.2.2　精密度和回收率

以峰面積的RSD來表征方法的精密度，以不含維生素的樣品為基質(zhì)進(jìn)行空白加標(biāo)計(jì)算加標(biāo)回收率的計(jì)算，以加標(biāo)回收率來表征方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果分別見表3和表4。

由表3可知7種維生素的RSD在0.31%～2.17%之間，表明精密度良好^[18-19]。由表4可知7種維生素的加標(biāo)回收率在88.07%～106.01%之間，回收率較高^[20-21]，說明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3　雞樅菌中水溶性維生素含量的測(cè)定

按照1.3.2所述方法對(duì)樣品進(jìn)行處理后，按照所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以保留時(shí)間進(jìn)行定性，以外標(biāo)法進(jìn)行定量，新鮮黑皮雞樅菌及菌腿、菌蓋和菌粉中水溶性維生素含量的檢測(cè)結(jié)果見表5。

由表5可知，新鮮黑皮雞樅菌中檢測(cè)到4種水溶性維生素，菌粉中檢測(cè)到5種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。新鮮黑皮雞樅菌及菌粉中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的86.47%和87.97%，其中維生素C的含量分別占總維生素含量的59.37%和50.62%，維生素C能夠維持免疫功能，保持血管完整，促進(jìn)非血紅素鐵的吸收，同時(shí)維生素C還具有抗氧化、抗自由基、抑制酪氨酸酶的形成等功能，從而達(dá)到美白、淡斑的功效。煙酸的含量分別占總維生素含量的27.10%和37.35%，煙酸有較強(qiáng)的擴(kuò)張周圍血管的能力，能維持消化系統(tǒng)的健康、減輕胃腸道障礙，同時(shí)還可以預(yù)防和緩解嚴(yán)重的偏頭痛且對(duì)緩解皮炎和腹瀉癥狀具有明顯的效果。由此可見多食用以雞樅菌為主要原料的產(chǎn)品對(duì)于維持機(jī)體正常功能、保護(hù)胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。菌粉中葉酸含量占總維生素含量的1.82%，而新鮮黑皮雞樅菌中未檢測(cè)到葉酸考慮可能是由于新鮮黑皮雞樅菌中葉酸含量過低超出了該方法的檢出限。

完整的黑皮雞樅菌主要由菌腿和菌蓋兩部分組成，菌腿和菌蓋也都檢測(cè)到4種水溶性維生素且都以維生素C和煙酸為主。菌腿和菌蓋中維生素C和煙酸總量分別占總維生素含量的88.57%和86.92%，其中維生素C含量分別占總維生素含量的52.90%和64.47%，煙酸含量分別占總維生素含量的35.67%和22.45%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)菌蓋中維生素C的含量是菌腿中維生素C含量的1.48倍，B₂含量是菌腿中B₂含量的3.40倍；菌腿中煙酸含量是菌蓋中煙酸含量的1.31倍，B₁含量是菌蓋中B₁含量的1.22倍。菌蓋中總維生素含量是菌腿中總維生素含量的1.21倍。以上數(shù)據(jù)為黑皮雞樅菌不同部位營養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確并可同時(shí)檢測(cè)7種水溶性維生素的方法，利用此方法對(duì)新鮮黑皮雞樅菌、菌粉、菌腿和菌蓋進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果表明黑皮雞樅菌水溶性維生素含量豐富且以維生素C和煙酸為主，維生素C和煙酸對(duì)于維持機(jī)體正常功能、保護(hù)胃腸道和美白養(yǎng)顏等具有重要作用。檢測(cè)方法的建立和檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果為黑皮雞樅菌的開發(fā)利用和深度加工奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡尚勤, 劉天貴, 李賢柏. 食用菌, 2006, 03: 11-12.

[2] Lu Y Y, Ao Z H, Lu Z M, et al. J Ethnopharmacol, 2008, 120: 432-436.

[3] 張玉金, 白建波, 蒲敏, 等. 食品科學(xué), 2014, 02: 1-7.

[4] Yang F, Xu B, Zhao S J, et al. J Biosci Bioeng, 2012, 114(2): 228-231.

[5] Boaz S M, Champagne C D, Fowler M A, et al. Comp Biochem Physiol, Part A, 2012, 161: 114-121.

[6] 韓春雨, 李雅靜. 輕工科技, 2013, 08: 5-6.

[7] 孫振艷, 趙中一, 郭小慧, 等. 化學(xué)分析計(jì)量, 2006, 15(4): 18-20.

[8] 杜茂昌. 食品科學(xué), 1984, 04: 12-16.

[9] Heudi O, Kilinc T, Fontannaz P. J Chromatogr A, 2005, 1070: 49-56.

[10] Jin P F, Xia L F, Li Z, et al. J Pharm Biomed Anal, 2012, 70: 151-157.

[11] 蔣俊樹, 趙彬. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 635-637.

[12] Márquez-Sillero I, Cárdenas S, Valcárcel M. J Chromatogr A, 2013, 1313: 253-258.

[13] 施渺筱, 李祝, 楊坤耀. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(2): 182-183.

[14] 肖洋, 李祝, 施渺筱. 中國釀造, 2014, 33(4): 142-144.

[15] 肖洋, 李祝, 施渺筱. 中國釀造, 2014, 33(4): 142-144.

[16] 賈林艷, 宋偉新, 莊志萍, 等. 中國林副特產(chǎn), 2003, 02: 36-37.

[17] 王希希, 胡燕, 孫軼卓, 等. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2010, 41(1): 158-161.

[18] 孫翔宇, 杜國榮, 馬婷婷, 等. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(12): 201-209.

[19] 曹蕊, 曹玉華, 李楠, 等. 食品科技, 2007, 11: 157-160.

[20] 田穎, 黃挺, 劉軍, 等. 分析試驗(yàn)室, 2010, 29(11): 52-56.

[21] Chen Z, Chen B, Yao S Z. Analy Chim Acta, 2006, 569: 169-175.

^*通信作者：牟德華，男，教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：dh_mou@163.com