分散液相微萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中的苯并咪唑類農藥殘留

韓丹丹^*1，閆宏遠¹，唐保坤²，郭玉潔¹，徐澤華¹

（1．河北大學預防醫學與衛生事業管理系；2．河北大學藥學院，保定 071002）

苯并咪唑類農藥是一種高效、低毒、內吸性廣譜殺菌劑，主要包括多菌靈、噻菌靈、硫菌靈等，該類農藥是水果、蔬菜的生產、貯藏、運輸及保鮮過程中最重要的殺菌劑，可防治水果蔬菜的多種病蟲害。但是由于多菌靈、噻菌靈、硫菌靈在蔬菜上殘留期比較長，對人體健康產生危害^[1-2]。國內外對植物源性食品中苯并咪唑類農藥的最大殘留限量（MRLs）作了規定，最低殘留限量為0.5mg/kg。因此建立高效、快速的檢測蔬菜中的苯并咪唑類農藥殘留具有重要的意義。

由于蔬菜樣品組成復雜，而且目標分析物在樣品中含量通常較低，因此，對樣品進行預富集萃取非常必要。分散液相微萃取是一種新型樣品前處理技術，它克服了傳統萃取的諸多不足，具有無溶劑化、快速、高效等優點，在很多領域得到了廣泛應用^[3-4]。本課題以西紅柿、黃瓜中的多菌靈、噻菌靈、硫菌靈為研究對象，建立了基于分散液相微萃取的樣品前處理技術，并與高效液相色譜技術聯用，為苯并咪唑類農藥檢測提供高靈敏度的檢測方法。

1　實驗部分

1.1　儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；pHS-4型智能酸度計（美國奧豪斯公司）；電子分析天平（美國奧豪斯公司）；離心機（上海手術器械廠）；超聲萃取儀（寧波新芝）；氮吹儀（杭州奧盛）。多菌靈、噻菌靈、硫菌靈標準品（國家標準物質研究中心），均為分析純；氯仿、乙腈、甲醇（安賽生物科技），均為色譜純；實驗用水為去離子水。

1.2　實驗方法

1.2.1　液相色譜分離條件

流動相：甲醇-水（70 : 30，體積比），流速為1.0ml/min；檢測波長280nm；C18色譜柱（日本島津，4.6mm×250mm, 5μm）。

1.2.2　分散液相微萃取方法

取1.0ml的標準混合液（0.01mol/ml的多菌靈、噻菌靈、硫菌靈）于10ml玻璃離心管中，用pH=4.0的水定容到10ml。加入750μl的乙腈，混勻1min，再加入750μl的氯仿，邊振蕩邊混勻5min。以3000r/min離心3min，棄去上層水相，用氮吹儀吹干有機相后，加入500μl甲醇，混勻5min，使殘渣充分溶解，以3000r/min離心3min，使雜質沉淀。取10μl萃取液直接進樣，采用高效液相色譜法測定多菌靈、噻菌靈、硫菌靈的含量。

2　結果與討論

2.1　萃取條件的優化

2.1.1　萃取劑的選擇

萃取劑的選擇對萃取效率以及富集倍數起著重要的作用，萃取劑一般要具備以下特征：① 密度比水大；② 對待測物有較好的萃取效果；③ 水中溶解度小；④ 能形成穩定的兩相系統。本實驗選擇比水密度大的氯仿作為萃取劑，操作簡便，萃取劑用量少，萃取效果較好，滿足同時分離蔬菜中多種農藥殘留的要求。

2.1.2　萃取劑用量對萃取效率的影響

考察了不同體積的氯仿對萃取效率的影響。結果如圖1所示，隨著萃取劑用量的增加，萃取效率逐漸提高，當萃取劑用量達到750μl時，萃取效率達到最高，超過750μl時，對萃取效率影響不大。因此選擇最佳萃取劑用量為750μl。

2.1.3　不同分散劑對萃取效率的影響

分散劑是液相微萃取技術的重要影響因素。分散劑的作用是使萃取劑和水樣溶液的接觸面積最大化，從而使萃取效率最大化。實驗發現無分散劑加入時，萃取劑的萃取效率較低，已有研究選用乙腈、甲醇作為分散劑對其分散效果進行了考察。結果如圖2所示，采用乙腈作為分散劑時藥物的富集倍數都較高。

2.1.4　分散劑用量對萃取效率的影響

考察了乙腈用量對萃取效率的影響。分散劑體積小時很難使萃取劑在水相中形成均一的乳濁液從而影響萃取效率，而較大體積的分散劑則會影響有機相在水中的溶解性。因此，選擇合適體積的分散劑至關重要。結果如圖3所示，隨著分散劑用量的增加，萃取效率提高，當分散劑用量為750μl時，萃取效率達最高值。因此，本實驗選擇分散劑用量為750μl。

2.2　標準曲線和方法檢出限

配制不同濃度的苯并咪唑類農藥標準溶液測定峰面積，以溶液的峰面積為縱坐標，以苯并咪唑類農藥的濃度為橫坐標，對多菌靈、噻菌靈、硫菌靈標準溶液繪制標準曲線，線性回歸方程分別為Y=4×10⁷X?79943，R=0.9986；Y=4×10⁷X?88127，R=0.9999；Y=3×10⁷X?13389，R=0.9999，其中，Y代表峰面積，X代表標準溶液濃度，R代表線性回歸系數。線性范圍為0.005～0.1mg/ml。

對0.001mg/ml的標準溶液依次稀釋2倍，配成不同濃度的標準溶液，對不同濃度試液進行測定，直至信噪比（S/N=3），將此時的峰面積代入標準曲線得到方法的檢出限，多菌靈與噻菌靈的檢出限為31.25ng/ml，硫菌靈的檢出限為62.50ng/ml。

2.3　樣品分析

稱取一定量的西紅柿和黃瓜樣品，榨汁后，減壓抽濾得澄清的西紅柿汁和黃瓜汁，濾液備用。分別移取1.0ml的西紅柿和黃瓜汁于10ml玻璃離心管中，按照1.2.1步驟進行分散液相微萃取，測定西紅柿和黃瓜樣品中的苯并咪唑類農藥殘留含量，并對其進行加標回收率實驗，結果如表 1所示。在西紅柿中檢測出1.42μg/ml的多菌靈，黃瓜中檢測出1.76μg/ml的多菌靈、1.20μg/ml的噻菌靈、0.78μg/ml的硫菌靈。樣品的加標回收率為38%～58.0%，RSD小于5.2%。

3　結論

液相微萃取技術測定蔬菜中的痕量苯并咪唑類農藥，萃取效率較高，萃取劑用量少，準確度高、精密度好，分散液相微萃取技術由于萃取劑和分散劑瞬間與樣品充分接觸，導致其萃取時間比液相微萃取的其他模式更短。通常只需加入微量的萃取劑，使得目標分析物的富集倍數更高，將其與高效液相色譜分析技術相結合，可用于蔬菜中多種農藥的痕量分析檢測。

參考文獻

[1] 劉乾開, 朱國念. 新編農藥使用手冊. 第2版. 上海: 上海科學技術出版社, 1999: 309.

[2] 吳麗明, 黃伯俊. 職業醫學, 1992, 19(1): 11-12.

[3] Huang P, Zhao P, Dai X, et al. J Chromatogr B, 2016, 1011:136-144.

[4] Amoli-Diva M, Taherimaslak Z, Allahyari M, et al. Talanta, 2015, 134: 98-104.

基金項目：河北省自然基金資助項目（B2014201089）和河北省留學人員科技活動項目擇優資助（C201400301）

通信作者：韓丹丹，女，Tel：0312-5079010，E-mail：hdd117@126.com