高效液相色譜法檢測不同品種棗果中的白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸

李崇陽，牟德華^*

（河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus Mill.）植物棗樹的子實(shí)，又名大棗或中華大棗，是我國特有的果品之一，主要分布在晉、冀、陜、魯、豫五省以及新疆的阿克蘇地區(qū)。與桃、李、栗、杏并稱為中國古代五果，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“藥食兼用”品種之一，具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值^[1]。紅棗味甘、性溫、無毒，入心、脾、胃經(jīng)，久食或入藥膳有補(bǔ)氣血，益脾胃，通九竅，和百藥，潤膚養(yǎng)顏，強(qiáng)志延年養(yǎng)生保健功效。凡體質(zhì)虛弱或欲抗衰延年者均可食用。民間有諺曰：“一日吃三棗，一輩子不顯老”^[2]。現(xiàn)代研究還表明紅棗具有抗癌、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、保肝護(hù)肝和提高免疫力等功能^[3-5]，這與紅棗中含有大量多糖、黃酮、環(huán)核苷酸和三萜類化合物等活性成分密切相關(guān)。

三萜酸作為一種五環(huán)三萜類化合物因具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝、降脂、降血糖、提高白細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等重要生理功能而成為當(dāng)今社會研究的熱點(diǎn)^[6-9]。紅棗中含有大量的三萜酸類化合物，其中以白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸最為典型，三種三萜酸結(jié)構(gòu)和極性極為相似且具有多種生理功能，其中白樺脂酸可選擇性地殺死人類黑色素瘤細(xì)胞而不殺傷健康細(xì)胞，對HIV-1型感染有抑制作用；齊墩果酸具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用及保護(hù)肝臟、利水滲濕等功效；熊果酸有抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長的作用，對誘癌、致癌物也有一定的抵抗作用，能提高人體免疫力，毒副作用小，安全性高^[10-12]。

資料顯示，大量文獻(xiàn)采用HPLC法對齊墩果酸和熊果酸這一同分異構(gòu)體進(jìn)行分離，且都集中在白花蛇舌草、枇杷、女貞子、圣羅勒等中草藥中^[13-16]，而對于大棗、酸棗和酸棗仁中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸同時(shí)分析檢測的報(bào)道相對較少，高婭等^[17]采用HPLC法測定了不同品種棗果中的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷的含量；王向紅等^[18]同樣采用HPLC法測定了不同品種棗果和一種酸棗中齊墩果酸和熊果酸的含量。本文研究建立了一種同時(shí)檢測不同品種棗果、酸棗和酸棗仁中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的高效液相色譜法，對同一品種不同產(chǎn)地、不同級別以及同一產(chǎn)地不同品種棗果間三種三萜酸含量的差異進(jìn)行了比較，同時(shí)將檢測結(jié)果與種植園新培育的多種新型棗品種進(jìn)行比較，并對不同產(chǎn)地酸棗和酸棗仁中三種三萜酸含量進(jìn)行了比較。對于提高棗果和酸棗的附加值、選育高三萜酸含量的棗品種和充分開發(fā)酸棗仁的剩余利用價(jià)值具有重要意義。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)品均購自艾科試劑公司，甲醇和乙腈均為色譜純，磷酸、三乙胺、乙酸銨、無水乙醇、95%乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水。

所有大棗、酸棗和酸棗仁樣品均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國棗研究中心提供。

1.2　儀器與設(shè)備

SHIMADZU高效液相色譜儀(HPLC)LC-20A，日本島津公司；Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱；Spectrum 756p紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-Ш循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；飛鴿TDL-5-A高速離心機(jī)，廣州航信科學(xué)儀器有限公司；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；九陽料理機(jī)；DELTA320pH 計(jì)、ARI140 型電子分析天平、微孔過濾器等。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1　樣品的處理

將不同品種棗樣品去核后切成薄片置于55℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，然后用高速粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40目篩，粉碎后的棗粉樣品置于密封袋中保存于干燥器中備用。

1.3.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)品各5mg，用甲醇溶解后定容到50ml棕色容量瓶中得到濃度均為100μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取5ml、2ml、1ml、0.5ml和0.2ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇定容到10ml棕色容量瓶中，得到濃度分別為50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，過0.45μm膜后避光保存于4℃冰箱中備用。

1.3.3　供試品溶液的制備

精密稱取1g棗粉加入15ml 70%乙醇，溫度50℃、功率100%的條件下超聲提取30min，然后在4500r/min的條件下離心15min，收集上清液，殘?jiān)侔瓷鲜鰲l件重復(fù)提取兩次后，合并三次提取液定容到50ml容量瓶中，過0.45μm膜后避光保存于4℃冰箱中備用，以保留時(shí)間定性，以外標(biāo)法定量。

1.4　數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件進(jìn)行處理。所有線性方程、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2007處理得出，樣品檢測結(jié)果方差分析通過SPSS17.0分析得出。

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的優(yōu)化

2.1.1　檢測波長的確定

分別配制一定濃度的白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，于紫外可見分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的最佳吸收波長均為210nm左右，參考相應(yīng)的文獻(xiàn)最終確定本實(shí)驗(yàn)的檢測波長為210nm。

2.1.2　色譜柱的選擇

由于白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸三者結(jié)構(gòu)差異較小，分離較為困難，因此色譜柱的微小變化，如粒子填充疏密程度的微小差異等都會導(dǎo)致分離情況的較大變化。本實(shí)驗(yàn)比較了Hypersil ODS2（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱、Inertsil ODS-SP（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱以及Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱對于三種三萜酸分離效果的影響，盡管三種柱子填料不同但都以硅膠為主要成分，且填料粒徑均為5μm，結(jié)果顯示Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱分離效果明顯優(yōu)于另外兩種色譜柱，分離度大于1.5且保留時(shí)間適中。這可能是由于Kromasil C18色譜柱相比于其他兩種柱子含碳量更高、表面極性更小，且Kromasil的表面由獨(dú)特的硅羥基基團(tuán)組成，硅烷的覆蓋率更高，在酸性條件下更穩(wěn)定、更有利于三萜酸這一酸性物質(zhì)的分離。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇Kromasil C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱進(jìn)行分離。

2.1.3　流動相的選擇

不同的流動相系統(tǒng)對于三種三萜酸的分離具有顯著的影響。本實(shí)驗(yàn)研究了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-乙腈-乙酸銨系統(tǒng)對于三種三萜酸分離效果的影響。又由于三種三萜酸均呈弱酸性，在中性條件下易發(fā)生電離，因此實(shí)驗(yàn)比較了磷酸和冰醋酸調(diào)節(jié)流動相pH值對分離效果的影響。結(jié)果顯示乙腈-水系統(tǒng)保留時(shí)間較短且使用磷酸和冰醋酸調(diào)節(jié)pH值均不能實(shí)現(xiàn)良好的分離；使用甲醇-水系統(tǒng)和甲醇-乙腈-乙酸銨系統(tǒng)均能實(shí)現(xiàn)三種三萜酸的基線分離，但甲醇-乙腈-乙酸銨系統(tǒng)保留時(shí)間較長且該系統(tǒng)較為復(fù)雜，對色譜柱污染較大不利于長期使用。因此，實(shí)驗(yàn)選用甲醇-水系統(tǒng)為流動相。并比較了磷酸和冰醋酸對于調(diào)節(jié)pH值的影響，結(jié)果顯示磷酸分離效果明顯優(yōu)于冰醋酸，這可能是由于冰醋酸除了調(diào)節(jié)pH值外本身還具有洗脫能力，不利于三萜酸的分離，因此實(shí)驗(yàn)選用磷酸調(diào)節(jié)流動相pH值。不同的pH值對于峰形和保留時(shí)間也有影響，pH值升高峰形變窄保留時(shí)間變短，pH值降低峰形變寬保留時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)pH=3時(shí)分離效果最好且保留時(shí)間適中。實(shí)驗(yàn)還研究了不同的流動相比例對分離效果和保留時(shí)間的影響，結(jié)果顯示當(dāng)甲醇 : 水=91 : 9時(shí)最為理想。因此本實(shí)驗(yàn)最終確定流動相為甲醇 : 水=91 : 9，磷酸調(diào)節(jié)pH=3。

2.1.4　柱溫的選擇

資料顯示適當(dāng)降低柱溫有助于齊墩果酸和熊果酸這一同分異構(gòu)體的分離。實(shí)驗(yàn)研究了當(dāng)柱溫分別為15℃、20℃、25℃、30℃以及處于室溫條件下對于三種三萜酸分離效果的影響，結(jié)果顯示當(dāng)溫度逐漸降低時(shí)分離度有所提高但變化不是很明顯，因此實(shí)驗(yàn)最終確定在室溫（25℃左右）條件下操作，這樣更有助于系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.1.5　流速的選擇

隨著流速的增加色譜峰保留時(shí)間變短同時(shí)柱壓升高，反之隨著流速的減小色譜峰保留時(shí)間延長同時(shí)柱壓降低。實(shí)驗(yàn)研究了當(dāng)流速分別為0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min和1.0ml/min時(shí)對三種三萜酸分離效果的影響，結(jié)果顯示適當(dāng)降低流速有助于齊墩果酸和熊果酸這一同分異構(gòu)體的分離但同時(shí)保留時(shí)間相對延長，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇流速為0.6ml/min，在此條件下三種三萜酸在25min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好的分離且分離度均大于1.5。

2.1.6　色譜分析

按以上優(yōu)化出的色譜條件分別對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行檢測，色譜圖見圖1。

2.2　三萜酸檢測方法的建立

2.2.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限和定量限

取濃度分別為100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和2μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照最優(yōu)色譜條件每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣三次取平均值，以響應(yīng)值峰面積y對質(zhì)量濃度x作線性方程：y=ax+ b，進(jìn)行線性回歸分析。檢出限（limit of determination，LOD）為3倍信噪比，定量限（LOQ）為10倍信噪比，結(jié)果如表1所示。

2.2.2　精密度試驗(yàn)

取濃度為10μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按最優(yōu)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來表征方法的精密度，RSD分別為2.67%、3.25%和3.29%，表明該方法精密度良好。

2.2.3　穩(wěn)定性試驗(yàn)

以贊皇大棗為樣品按照1.3.3供試品溶液的制備方法制備一份供試品溶液，按照最優(yōu)的色譜條件分別在0h、4h、8h、12h和20h時(shí)測定其中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果顯示RSD分別為4.08%、1.23%和3.26%，表明供試品溶液在20h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.2.4　重復(fù)性試驗(yàn)

以贊皇大棗為樣品按照1.3.3供試品溶液的制備方法分別制備5份供試品溶液，在最優(yōu)色譜條件下測定其中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果顯示RSD分別為5.64%、3.51%和5.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5　回收率試驗(yàn)

精密稱定已知三種三萜酸含量的5份棗粉樣品，準(zhǔn)確加入一定量的白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)品，按照1.3.3供試品溶液的制備方法分別制備5份加標(biāo)溶液，在最優(yōu)色譜條件下測定其中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示，由表2可知該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3　不同品種棗果樣品的檢測

精密稱定不同品種大棗、酸棗和酸棗仁樣品各3份，按照1.3.3供試品溶液的制備方法分別制備 3 份供試品溶液，在最優(yōu)色譜條件下測定其中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，不同品種、不同產(chǎn)地大棗、酸棗和酸棗仁中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸含量均存在顯著性差異。就大棗、酸棗和酸棗仁而言，總?cè)扑岷孔罡叩臑檫|寧產(chǎn)區(qū)小酸棗仁，其含量達(dá)到2921.48μg/g，明顯高于大棗中總?cè)扑岷孔罡叩男陆a(chǎn)區(qū)特級駿棗（1090.28μg/g）和酸棗中總?cè)扑岷孔罡叩谋６óa(chǎn)區(qū)酸棗（1120.68μg/g），且含量之間均存在顯著性差異；白樺脂酸含量再高的為遼寧產(chǎn)區(qū)小酸棗仁（2890.23μg/g），與其他品種間均存在顯著性差異；齊墩果酸含量最高的為延川產(chǎn)區(qū)酸棗（400.95μg/g），與其他品種間均存在顯著性差異；熊果酸含量最高的為白家莊酸棗（538.70μg/g），與其他品種間均存在顯著性差異。酸棗仁中總?cè)扑岷枯^高主要取決于其中白樺脂酸含量較高，占到三種三萜酸含量總和的95%左右，是齊墩果酸和熊果酸總含量的20倍左右，是大棗和酸棗中白樺脂酸含量的6倍左右，可見酸棗仁中白樺脂酸含量極為豐富，為進(jìn)一步開發(fā)酸棗仁中白樺脂酸這一活性物質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)核小肉厚的小酸棗仁中三萜酸含量約是核大肉薄的大酸棗仁中三萜酸含量的2倍，可見不同類型酸棗仁間三萜酸含量差異較大，同一類型不同產(chǎn)地之間差異相對較小但都存在顯著性差異。

不同品種大棗中白樺脂酸含量最高的為新疆特級駿棗（483.97μg/g），除了與無核小棗差異不顯著外與其他品種間均存在顯著性差異；齊墩果酸含量最高的也為新疆特級駿棗（184.03μg/g），除了與一級駿棗和一級阜平大棗差異不顯著外與其他品種間均存在顯著性差異；熊果酸含量最高的同樣為新疆特級駿棗（422.28μg/g），除了與一級駿棗、二級阜平大棗和無核小棗差異不顯著外與其他品種間均存在顯著性差異。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)同一產(chǎn)區(qū)同一品種不同級別的特級駿棗和一級駿棗以及一級阜平大棗和二級阜平大棗之間在總?cè)扑岷可洗嬖陲@著性差異。同一產(chǎn)區(qū)同一級別不同品種的新疆一級駿棗和新疆一級灰棗之間也存在顯著性差異。同一品種同一級別不同產(chǎn)地的三種灰棗，新疆灰棗與庫爾勒灰棗之間不存在顯著性差異但與若羌灰棗之間都存在顯著性差異。

不同產(chǎn)地酸棗中白樺脂酸含量最高的為保定產(chǎn)區(qū)酸棗，含量達(dá)到523.92μg/g；齊墩果酸含量最高的為延川產(chǎn)區(qū)酸棗，含量達(dá)到400.95μg/g；熊果酸含量最高的為白家莊酸棗，含量達(dá)到538.70μg/g，且三種三萜酸含量與其他產(chǎn)區(qū)酸棗間均存在顯著性差異。與上文大棗中三萜酸含量相比可見酸棗中白樺脂酸（523.92μg/g）、齊墩果酸（400.95μg/g）和熊果酸（538.70μg/g）含量均高于大棗中白樺脂酸（483.97μg/g）、齊墩果酸（184.03μg/g）和熊果酸（422.28μg/g）的最高含量。考慮可能是由于相比于大棗，酸棗特殊的生長環(huán)境更有利于白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸這些酸性物質(zhì)在棗果內(nèi)的積累。

育種園新培育的棗品種中白樺脂酸含量最高的為33-jx-8，含量為583.79μg/g；齊墩果酸含量最高的為24-D-48，含量為296.33μg/g；熊果酸含量最高的為49-39，含量為475.93μg/g，均高于大棗中白樺脂酸（483.97μg/g）、齊墩果酸（184.03μg/g）和熊果酸（422.28μg/g）的最高含量，可見新培育的棗品種更加有利于白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的提取，具有很大的開發(fā)價(jià)值。

由上述結(jié)果可知，在大多數(shù)大棗、酸棗和酸棗仁中，三種三萜酸含量的排布規(guī)律是白樺脂酸含量最高，其次是熊果酸，之后是齊墩果酸，這與高婭等^[17]和胡芳等^[19]的檢測結(jié)果一致。

3　結(jié)果與討論

（1）本研究建立了一種簡單、快速、準(zhǔn)確可同時(shí)檢測不同品種大棗、酸棗和酸棗仁中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的HPLC法。結(jié)果顯示白樺脂酸含量再高的為遼寧產(chǎn)區(qū)小酸棗仁（2890.23μg/g）；齊墩果酸含量最高的為延川產(chǎn)區(qū)酸棗（400.95μg/g）；熊果酸含量最高的為白家莊酸棗（538.70μg/g），且不同品種的大棗、酸棗和酸棗仁中三種三萜酸含量存在顯著性差異，為選育高三萜酸含量的棗品種和棗果功能性產(chǎn)品的開發(fā)奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

（2）值得注意的是，酸棗和育種園新培育的棗品種三萜酸含量均高于大棗中三萜酸含量最高的特級駿棗，有必要進(jìn)行深層次的研究討論以開發(fā)新型的功能性產(chǎn)品。另一點(diǎn)值得注意的是酸棗仁中白樺脂酸含量最高達(dá)到2890.23μg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通棗果中白樺脂酸的含量，有很大的市場開發(fā)價(jià)值。

（3）為了保證棗果中的三種三萜酸能夠被完全提取出來，試驗(yàn)比較了不同提取溶劑包括甲醇、無水乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿等對提取效果的影響，結(jié)果顯示甲醇、丙酮和無水乙醇提取效果最佳，但考慮到甲醇和丙酮均為有毒試劑不利于長期使用，實(shí)驗(yàn)最終選擇無水乙醇作為提取溶劑。比較了不同乙醇濃度包括30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%對提取效果的影響，結(jié)果顯示當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取效果最佳。實(shí)驗(yàn)還比較了不同提取方式包括浸泡提取、回流提取、索氏抽提、微波提取和超聲提取對提取效果的影響，結(jié)果顯示超聲提取相比于其他提取方式不但節(jié)省時(shí)間、節(jié)省溶劑而且提取率更高，因此實(shí)驗(yàn)最終選擇超聲作為提取方式。其他條件還有待進(jìn)一步研究討論。

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^*通信作者：牟德華，男，教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dh_mou@163.com