CM-β-CD手性分離非天然氨基酸的研究

田寶娟^*，楊曉丹，李保會

（華北電力大學環境科學與工程學院，保定 071003）

手性物質是互成鏡像，從物質的空間結構上看，對映體之間雖然不能重疊，但分子的組成是相同的^[1-2]。手性化合物的存在是自然界的普遍現象，其應用在藥物化學領域尤為突出。大多數的氨基酸含有手性中心，存在生理活性不同的D型和L型兩種對映異構體^[3-5]。一種手性化合物兩個對映體在藥理學性質上有重大差異，可能具有不同的藥理毒理作用。早在1992年，美國食品與藥物管理局就發布了手性藥物指導原則，要求在新藥的使用說明中必須明確量化各種對映異構體的藥理活性和毒性反應^[6]。因此手性對映體的分離分析就變成為一項非常重要的工作。目前，常用的手性選擇劑包括環糊精、手性冠醚、蛋白質、手性表面活性劑等^[7-8]。針對藥物對映體的分離模式有色譜法、酶分離法、化學法等^[9-11]。色譜法是一種具有良好分離性能的方法，包括高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法（CE）等^[12-14]。CE分離手性對映體是基于在緩沖液中加入手性試劑，依據藥物對映體與手性試劑之間絡合常數的不同，致使電泳淌度差異放大而實現分離^[15-17]。環糊精與其衍生物由于具有良好的拆分效果，而成為常用的手性選擇劑^[18]。

本文主要以CE為研究手段，對三種非天然羧酸類氨基酸包括非天然羧酸類氨基酸包括4-(N-甲基)甲胺-對氟-苯乙酸(±)、4-(N-甲基)甲胺-對甲基-苯乙酸(±)、4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)的手性分離進行研究。通過改變影響分離條件的因素包括pH、CM-β-CD濃度優化分離條件，進而對樣品進行分離。

1　實驗部分

1.1　儀器與設備

TH-2000系列毛細管電泳儀（保定市高新區天惠分離科學研究所）；ACCULAB分析天平（珠海天創儀器有限公司）；PHS-3C型酸度計（上?？祪x儀器廠）；SK3200H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；DRAGON移液槍（大龍醫療設備有限公司，上海）；50μm×60cm未涂層熔硅彈性石英毛細管柱（河北省永年銳灃色譜器件有限公司）。

1.2　藥品與試劑

4-(N-甲基)甲胺-對氟-苯乙酸(±)（中國科學院化學研究所）、4-(N-甲基)甲胺-對甲基-苯乙酸(±)（中國科學院化學研究所）、4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)（中國科學院化學研究所）、氫氧化鈉（天津市華東試劑廠），標準緩沖溶液（天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司），超純水（實驗室自制)。β-CD（上?；瘜W試劑有限公司），CM-β-CD（百靈威化學技術有限公司）。

1.3　實驗步驟

實驗前先對毛細管進行清洗，首先用甲醇溶液沖洗3min，緩沖溶液沖洗10min，高純水沖洗5min，1.0mol/L氫氧化鈉沖洗3min，再用緩沖溶液沖洗2min；每次進樣前用1.0mol/L氫氧化鈉沖洗3min，再用緩沖溶液沖洗2min。樣品溶液是在18kV的分離電壓下進行分離的。

2　結果與討論

2.1　手性試劑對樣品分離的影響

本次實驗首先考察了Me-β-CD、β-CD及CM-β-CD在3種非天然羧酸類樣品分離中的選擇性。實驗結果表明，β-CD和Me-β-CD對于實驗中用到的3種非天然羧酸沒有任何選擇性。然而CM-β-CD對3種樣品表現出了良好的選擇性。另外，只要在緩沖溶液中加入極少量的CM-β-CD即可促使3種樣品發生明顯的分離現象。因此本次實驗選擇了CM-β-CD作為手性分離試劑。

2.2　苯乙羧酸的紫外吸收曲線圖

為了確定樣品的最佳吸收波長，本次實驗用高純水配制樣品待測溶液，用高純水做對照試劑做出樣品的紫外吸收譜圖。圖1和圖2分別是2種樣品的紫外吸收曲線圖。圖1中，曲線1和曲線2是超純水和10mmol/L NaH₂PO₄的紫外吸收曲線，曲線3-8是100μg/ml 4-(N-甲基)甲胺-對甲基-苯乙酸在4.0ml 10mmol/L NaH₂PO₄及不同體積CM-β-CD (10mmol/L)組成的緩沖溶液中的紫外吸收曲線圖。圖2是相同條件下100μg/ml 4-(N-甲基)甲胺-對氟-苯乙酸(±)的紫外吸收曲線圖。從圖1和圖2可以看出，隨著緩沖溶液中CM-β-CD的體積不斷增加，兩種樣品的吸收曲線明顯地變化。

在樣品溶液中逐次增加CM-β-CD的用量時，吸光度逐漸增大，樣品可以與緩沖溶液中的CM-β-CD絡合，則可以選擇CM-β-CD作為手性拆分試劑；隨著紫外光波長增大，樣品吸光度降低。但當波長小于200nm時，無法保證樣品正常出峰，故本次實驗波長確定為214nm。

2.3　緩沖溶液pH對分離度的影響

從圖3可以看出，隨著緩沖溶液pH值從3.5變化到4.5時，4-(N-甲基)甲胺-對甲基-苯乙酸(±)和4-(N-甲基)甲胺-對氟-苯乙酸(±)的分離度也隨之增加且分別在pH值為4.5時達到最大，而4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)此時的分離度為0，隨著緩沖溶液pH值增加到7.5時，前兩種樣品的分離度逐漸降低。而4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)的分離度卻隨著pH值的增大而不斷增大，在pH值為6.5時分離度達到最大。隨后其分離度也隨著pH值的增大而減小。因此后續實驗將在緩沖溶液pH值為4.5及6.5處進行。

2.4 CM-β-CD濃度對分離度的影響

從圖5可以看出，當從1.0mmol/L增加到10.0mmol/L時，4-(N-甲基)甲胺-對甲基-苯乙酸(±)和4-(N-甲基)甲胺-對氟-苯乙酸(±)的分離度隨之增加且在10mmol/L時分離度達到最大；而當CM-β-CD的濃度繼續增加至20mmol/L時，兩者的分離度沒有明顯變化。4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)分離度與CM-β-CD濃度的關系與前兩者類似，但其最適CM-β-CD為5mmol/L。而且從圖4中4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)在不同CM-β-CD濃度下的電泳譜圖中可以看出4-(N-甲基)甲胺-苯乙酸(±)在5mmol/L時，其分離現象最明顯。

2.5　在最優化條件下的電泳譜圖

3　結論

利用CE對手性藥物進行拆分，與經典電泳相比，它克服了由于焦耳熱引起的譜帶寬，柱效較低的缺點，確保引入高的電場強度，改善分離質量，具有分離效率高、速度快和靈敏度高等特點，而且所需樣品少、成本低的優點^[19-22]。實驗表明，緩沖溶液pH及手性分離劑CM-β-CD的濃度會顯著影響樣品分離效果。通過選擇合適的pH值及適當濃度的CM-β-CD即可實現非天然羧酸的分離。通過不斷的優化實驗操作條件，CE可以有效地對手性化合物進行拆分，實驗分離效果明顯。

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基金項目：國家自然科學基金項目（21275053）

通信作者：田寶娟，女，副教授，Tel:13933267585, E-mail: tbj2001@163.com