中壓制備色譜法分離純化亞麻木酚素

林楠^1,2，王尉^1,2，張經華¹，高峽^1,2*

（1．北京市理化分析測試中心，北京 100094；
2．有機材料檢測技術與質量評價北京市重點實驗室，北京 100094）

植物木酚素（或稱木脂素）是苯丙素類物質代謝產生的天然產物，具有C6-C4-C6的基本骨架^[1]。其種類較多，油料作物和谷類食物是木酚素的重要來源^[2]，尤以亞麻籽和芝麻最為重要。亞麻籽中木酚素為開環異落葉松樹脂素（SECO），主要以開環異落葉松脂素二葡萄糖苷（SDG）結構的形式存在。SDG分子式為C₃₂H₄₆O₁₆，能溶于水、甲醇、含水乙醇和丙酮^[3]。SDG在哺乳動物腸道內，經過腸道菌群的作用代謝產生動物木酚素，能與體內的雌激素受體相結合，表現為雌激素活性和抗刺激素活性。研究表明亞麻木酚素具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗骨質疏松、降低血清膽固醇、增強自身免疫力、延緩衰老、保護心血管、抑制芳香酶活性，尤其在抑制人體乳腺癌細胞生長、減輕婦女絕經期癥狀、預防結腸癌和前列腺癌等方面有良好的效果^[4-6]。

通常使用的快速中壓制備色譜是由中壓恒流泵、檢測器、六通閥、餾分收集器等組成的。中壓制備色譜具備柱效高和分離速度快等特點^[7]，目前快速中壓制備色譜已越來越廣泛用于中藥和天然產物的提取。

1　實驗部分

1.1　儀器和試劑

島津LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；博納艾杰爾CHEETAH MP 200中壓制備柱層析系統（天津博納艾杰爾科技公司）；CR22GIII型高速離心機（日本日立公司）發儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Integral純水/超純水一體化系統（密理博中國有限公司）；BS224S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；1000μl微量可調移液器（Eppendorf）。

甲醇，分析純，北京化工廠；甲醇，色譜純，美國Fisher scientific公司；超純水，實驗室自制。亞麻木酚素對照品（HPLC＞98%），中國食品藥品檢定研究院；亞麻木酚素提取物（SDG含量約為50 %），湖南三為生物科技有限公司。

1.2　亞麻木酚素樣品及對照品的HPLC測定方法

色譜條件：色譜柱 Inertsil ODS-SP C18（5μm, 150mm×4.6mm），0到20min內，乙腈-1%磷酸的濃度由0.1 : 0.9升至0.43 : 0.57梯度洗脫，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長280nm，分析時間20min。

對照品配置：稱取5mg亞麻木酚素對照品，以2ml超純水溶解樣品后，過0.45μm聚醚砜濾膜后放入2ml高效液相色譜儀專用樣品瓶中，以待測定。

樣品提取：稱取20g亞麻木酚素提取物樣品，以100ml超純水溶解該樣品后置于超聲波中提取30min，提取2次，將提取液合并后以5000r/min進行離心10min，得到亞麻木酚素提取物的水提液，取1ml過0.45μm膜后待測備用。根據峰面積歸一化法，確定樣品水提液的純度。

1.3　亞麻木酚素的中壓制備色譜分離純化方法

博納艾杰爾CHEETAH MP200系列中壓制備色譜系統。色譜柱：12g ODS FLASH柱，0→40min，甲醇-水[(10 : 90)→(30 : 70)]梯度洗脫；40→50min，甲醇-水[(30 : 70)→(40 : 60)]梯度洗脫；50→60min，甲醇-水(40 : 60)等度洗脫。將1.2所述的亞麻木酚素提取水提液旋轉蒸發去除溶劑后，稱取100mg，以5ml流動相溶解樣品，用注射器將樣品注入FLASH柱前端進行分離。

2　結果

2.1　亞麻木酚素在樣品水溶液中的純度測定

根據1.2所述的亞麻木酚素的HPLC測定方法對亞麻木酚素對照品和亞麻木酚素提取物的水溶液進行測定如圖1所示。采用峰面積歸一化法進行確定對亞麻木酚素提取物的水溶液純度進行測定，結果顯示其純度為78.47%。

2.2　中壓制備色譜法對亞麻木酚素提取物水溶液成分進行分離純化

將樣品經過1.3所述方法處理后對其進行分離純化，如圖2（a）所示，收集46～52min餾分，去除溶劑，用超純水溶解樣品后過0.45μm膜后，進行高效液相色譜測定，以峰面積歸一化法對其進行純度計算，如圖2（b）所示，測得純化后樣品純度為99.89%。

3　討論

中壓制備色譜技術用于天然產物及中藥有效成分提取，通過適宜的前處理和優化條件可以達到較好的分離純化效果。本研究利用反相中壓制備液相色譜技術分離純化亞麻木酚素提取物，將純度為78.47%的亞麻木酚素樣品提高至99.89%，具有較好的分離效果，且分離速度快、消耗有機溶劑少，為亞麻木酚素分離純化的研究提供了技術依據。

參考文獻

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[2] 崔寶玉, 劉玉, 闞侃, 等. 食品研究與開發, 2010, 31(7): 181-184.

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[6] 葛曉靜, 鄧天, 侯相林. 食品與發酵工業, 2009, 35(7): 174-178.

[7] 李雪瑩, 武永剛. 安徽農業科學, 2012, 40(15): 8477-8479.

^*通信作者：高峽，女，研究員，E-mail: gaoxia@iccas.ac.cn