匹多莫德原料藥中二氯甲烷殘留量檢測的中空纖維膜液相微萃取技術研究

趙健^1*，常健¹，王尹²

（1．遼寧省標準化體系建設工程技術研究中心遼寧省分析科學研究院，沈陽 110015；
2．錦州華光電子管有限公司，錦州 121001）

匹多莫德（pidotimod）是一種新型的化學合成免疫調節劑，可以促進機體的特異和非特異免疫反應，主要用于小兒反復呼吸道和泌尿系統感染、慢性支氣管炎急性發作及腫瘤患者伴發感染的治療和預防。與傳統的免疫調節劑相比，匹多莫德具有安全、使用方便和耐受性好的優點。本方法采用中空纖維膜液相微萃取技術，對匹多莫德原料藥在化學合成過程中二氯甲烷殘留量進行檢測，通過大量實驗總結出一套可行的創新方法，并可以應用于2010年版《中國藥典》二部附錄E中規定的有機溶劑殘留量進行檢測。

單滴液相微萃取（Single Drop Microextraction，SDME）是近年來新發展起來的萃取技術^[1-3]，一些實驗已將它成功應用于水相標本中有機物的萃取。單滴液相微萃取（Single Drop Micr oextraction，SDME）是基于傳統的液液萃取技術，但它只需要幾微升有機溶劑為萃取劑。在該萃取系統中，有機溶劑微液滴（作為萃取劑）懸掛在普通微量注射器的針尖上，浸入到水性標本中進行萃取。盡管單液滴相微萃取技術簡單、廉價、快速，但是它存在微液滴穩定性差、方法靈敏度低的問題。為了解決這些問題，有人使用多孔的聚丙烯中空纖維膜來保護有機溶劑微液滴，將水相和有機溶劑分隔開，避免了兩廂直接混合，水中的待萃取物通過中空纖維膜空壁的微孔進入到有機溶劑中而實現萃取，它是液液萃取的微型化。中空纖維膜液相微萃取技術是單滴液相微萃取的發展，因為纖維膜結構把有機溶劑保護起來。中空纖維膜微萃取技術以其高校、簡單、快速、低價、避免殘留和交叉污染等優點，并可與氣相色譜（GC）、毛細管電泳（EC）和高效液相色譜（HPLC）聯用，是傳統液液萃取方法的有力補充。同時，它集萃取、富集、進樣與一步完成，使樣品前處理更加快速、有效，從而加快樣品分析速度。中空纖維膜液相微萃取技術在水性標本中有機物的萃取上有廣闊的發展前景，在藥物分析、毒物分析、水和土壤中殺蟲劑的殘留等領域都有廣泛的應用。

1　儀器與試劑

（1）環境條件 溫度20℃，相對濕度50%RH。

（2）儀器條件 Agilent7890A氣相色譜儀（FID檢測器），配有頂空瓶；AE-240電子天平；溫控磁力攪拌器。

（3）色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX（30m×0.53mm×1.0μm）；氫火焰離子檢測器（FID），檢測器溫度300℃，進樣口溫度200℃，柱溫50℃。載氣：N₂；載氣流速：3.5ml/min；最小峰面積：500；進樣量1.0μl：理論塔板數按二氯甲烷峰計算應不低于1000。

（4）試劑 所用試劑均為分析純。試驗用水為電阻率為18.5MΩ·cm（25℃）的超純水。中空纖維膜購自天津膜天膜科技有限公司，屬于聚偏氟乙烯（PVDF）新材料，纖維內徑/外徑：0.6mm/1.3mm，膜壁平均孔徑為0.2μm。

2　測定方法

2.1　對照品溶液的制備

精密稱取色譜純二氯甲烷60mg，置100ml容量瓶中，用不含有機雜質的二次水稀釋至刻度，超聲混勻；精密量取10ml置100ml量瓶中，用二次水二次稀釋至刻度，超聲混勻，即得即得儲備液，濃度為60μg/ml；精密量取1.0ml置100ml量瓶中，用二次水稀釋至刻度，超聲混勻，即得對照品溶液，濃度為0.6μg/ml。儲備于4℃冰箱中備用。

2.2　供試品溶液的制備

精密稱取匹多莫德原料藥0.1g置100ml容量瓶中，用不含有機雜質的二次水稀釋至刻度，超聲混勻，儲備于4℃冰箱中備用。

2.3　萃取步驟

2.3.1 LPME-HFM萃取裝置的制備

自制的LPME-HFM萃取裝置是由微量進樣器和中空纖維膜兩部分組成。取2.0cm長度的纖維膜，在異辛烷中超聲清洗1min以除去膜上污物，在自然條件下晾干，放入干凈的玻璃瓶中保存。用微量注射器抽入6μl萃取液，將一段中空纖維膜的一端套在注射器針尖上，然后把萃取溶劑緩慢注入，注入完畢后，另一端熱封口。萃取結束后剪開中空纖維膜封口端，抽取1μl萃取液直接進入GC分析。

2.3.2　供試品溶液二氯甲烷的萃取

精密吸取供試品溶液30ml置于30ml頂空瓶（安捷倫生產），在小瓶中放入磁性轉子，插入LPME-HFM萃取裝置，于室溫下在磁力攪拌器上攪拌20min。萃取結束后剪開中空纖維膜封口端，抽取1μl萃取液直接進入GC分析。

2.3.3　對照品溶液二氯甲烷的萃取

精密吸取對照品溶液30ml置于30ml頂空瓶（安捷倫生產），在小瓶中放入磁性轉子，插入LPME-HFM萃取裝置，于室溫下在磁力攪拌器上攪拌20min。萃取結束后剪開中空纖維膜封口端，抽取1μl萃取液直接進入GC分析。

3　萃取條件的優化

3.1　攪拌速度選擇

增加溶液的攪拌速度，能縮短達到熱力學平衡所需的時間。但超過一定速度，會產生氣泡并增加萃取劑的損失^[4]，使實驗結果受到影響，因此，我們選擇600r/min的攪拌速度。

3.2　萃取溶劑選擇

萃取劑的選擇本著“相似相溶”的原則，在中空纖維膜中理想的萃取劑應該是與纖維相容，在纖維壁中穩定存在，不溶于水，并且在萃取時間內保持足夠的穩定^[4]。我們選擇環己烷、正辛醇、甲苯、二甲苯四種溶劑。在可待因濃度為5μg/ml、加入4ml飽和硼酸鈉溶液、攪拌速度600r/min、萃取時間20min的特定條件下，考察萃取溶劑種類的結果如圖1所示。其中，甲苯的萃取效率最高，依次為二甲苯、環己烷、正辛醇，因此本實驗選取甲苯作為萃取溶劑。

3.3　萃取時間選擇

在二氯甲烷濃度為0.6μg/ml，攪拌速度600r/min，以甲苯為萃取溶劑的條件下，分別攪拌15min、20min、25min、30min、45min。如圖2所示，二氯甲烷的萃取效率隨時間的增加而增加，30min后開始下降。有文獻報道，而且隨著時間的增加，萃取劑的損失也增加^[4,5]，因此，我們從省時和萃取效率綜合考慮，選擇20min作為萃取時間。

3.4　離子強度選擇

分別考察0g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、360g/L NaCl溶液濃度下離子強度對萃取效果的影響。四氯化碳濃度為50μg/L，攪拌速率600r/min，以甲苯為萃取溶劑，萃取時間20min。最初萃取效率隨鹽濃度的增加而增加，NaCl溶液濃度在200g/ml時達到最大值，360g/L時萃取量反而下降^[6,7]。因此，試驗選擇NaCl溶液濃度為200g/L。

3.5　酸堿性

分別考察了pH值在9.5、11.5、12.5、13.5時對萃取效果的影響。四氯化碳質量濃度為50μg/L，攪拌速率600r/min，以甲苯為萃取溶劑，攪拌萃取20min。四氯化碳的萃取效率在pH值為11.5時最高，之后萃取效率隨pH值升高而降低。因此，試驗選擇pH值為11.5。

4　結果

4.1　二氯甲烷色譜分離

圖5是二氯甲烷對照品的色譜圖，色譜峰附近沒有雜質干擾。

4.2　系統適用性試驗

精密吸取供試品溶液二氯甲烷濃度為0.6μg/ml置于30ml頂空瓶，在小瓶中放入磁性轉子，插入LPME-HFM萃取裝置，于室溫下在磁力攪拌器上攪拌20min。萃取結束后剪開中空纖維膜封口端，抽取1μl萃取液直接進入GC分析，進行系統適用性考查。由色譜圖得到表1數據。

4.3　精密度試驗

精密吸取供試品溶液二氯甲烷濃度為0.6μg/ml置于30ml頂空瓶，在小瓶中放入磁性轉子，插入LPME-HFM萃取裝置，于室溫下在磁力攪拌器上攪拌20min。萃取結束后剪開中空纖維膜封口端，抽取1μl萃取液直接進入GC分析，連續5次進樣，考查儀器精密度。由色譜圖得到表2數據。

4.4　線性關系和檢出限試驗

稱取二氯甲烷儲備液適量，見表 3，按照對照品配制方法得到相對應濃度的標準溶液，分別進行萃取，記錄色譜圖，得出二氯甲烷線性回歸方程：y = 13835x ? 29957，R = 0.9885，方法的檢出限（3S/N）為0.2μg/L。

4.5　穩定性試驗

精密吸取供試品溶液30ml，按上述色譜條件，每隔1h進樣一次，結果供試品溶液中二氯甲烷在5h內無明顯變化，相對標準偏差RSD = 3.05%。

4.6　重現性試驗

取批號150901樣品6份，按供試品溶液的制備和上述色譜條件進行測定，測得二氯甲烷的平均含量為0.092%，RSD = 3.01%。

4.7　回收率試驗

取已知含量的匹多莫德原料藥，批號為150901，按2.2項下方法制備供試品溶液和測定，結果平均相對回收率為98.54%，RSD = 2.64%，n = 5。

4.8　樣品測定

取150901、150902、150903三批匹多莫德原料藥，按上述測定方法進行測定，結果見表4。

5　結論

中空纖維膜液相微萃取（LPME-HEM）是近年來發展的先進的樣品前處理技術，它的優點是高效、簡單、快速、低價、避免殘留和交叉污染等，本實驗中使用的中空纖維膜是一種聚偏氟乙烯的材料，它具有化學穩定性好、物理強度高、耐酸堿、抗氧化、抗污染、膜通透量高的特點。中空纖維膜萃取可與氣相色譜、毛細管電泳和高效液相色譜聯用，是傳統液-液萃取的有力補充。

本文采用氣相色譜的方法結合中空纖維膜液相微萃取前處理技術測定匹多莫德原料藥中二氯甲烷殘留量，該方法簡單、靈敏，結果顯示了良好的選擇性、線性和重現性。因此該方法也可以用于原料藥及藥物中有機溶劑殘留量的測定，為藥物分析檢測方法提供了新嘗試。

參考文獻

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^*通信作者：趙健，男，助理研究員，主要從事食品、藥品、化妝品等的檢測與研究。E-mail：65758802@qq.com