葡萄酒中單萜烯類物質GC檢測方法的建立與應用

周立華¹，牟德華¹，李艷^1,2*

（1．河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018；2．河北省發酵工程技術研究中心，石家莊，050018）

在自然界中單萜烯類物質存在極為廣泛，具有特殊的香氣。萜烯類化合物是釀酒葡萄中重要的香氣成分，主要包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等^[1]。葡萄酒中的香氣成分主要以游離態和結合態香氣前體物質的形式存在，結合態物質本身沒有香氣，必須經過分解釋放才能產生香氣^[2]。通常葡萄漿果中以葡萄糖苷鍵形式存在的結合態香氣物質的含量比游離態的呈香物質要豐富^[3]，研究表明，結合態萜烯類香氣糖苷物質是葡萄酒活性香氣成分的預備庫，比它們對應的游離態配基多幾倍，甚至幾十倍^[4]。β-葡萄糖苷酶對葡萄中與糖苷結合的單萜類物質進行水解，從而釋放糖苷及單萜增加葡萄酒的香氣^[5-7]，進而增加葡萄酒的香氣物質含量，提高葡萄酒的感官品質。本研究就是建立一種檢測葡萄酒中存在的13種單萜烯類物質的GC檢測方法，并對分別經過自選高產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母和商品菌SC酵母發酵的2個葡萄品種的葡萄酒中的單萜烯進行了檢測，比較兩種酵母在對葡萄酒香氣的影響效果，驗證自選高產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母在對葡萄酒增香方面的積極作用。

1　實驗部分

1.1　材料和試劑

美樂和赤霞珠釀酒葡萄，2015年采摘于河北沙城產區和昌黎產區，2個品種4個批次；葡萄酒，采用傳統工藝釀造于實驗室^[8]；二氯甲烷，分析純，天津市永大化學試劑有限公司；HE果膠酶，為法國LAFFORT公司生產；SC釀酒酵母和偏重亞硫酸鉀，意大利Esseco公司生產。

菌株：本實驗室于2008年、2009年和2010年分別從河北省沙城葡萄酒產區的葡萄園土壤、葡萄酒廠設備表面、接觸過葡萄酒廠設備的葡萄汁和自然發酵過程中采集菌源樣品，經過分離純化，共篩選出1358株酵母菌，后經過5.8S-ITS 區域RFLP 方法鑒定出270株釀酒酵母，再利用 Interdelta PCR 指紋圖譜法將釀酒酵母區分為16大類^[9]，后又經過高產β-D-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株篩選^[10]，最終得到此釀酒酵母，本實驗室自己命名為亞種16。

1.2　儀器與設備

GC 7820A配有FID檢測器，美國安捷倫公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀，天津亞榮生化儀器廠；DC-12氮吹儀（上海安譜科技儀器有限公司）。

1.3　單萜烯物質標準曲線的建立

以二氯甲烷為溶劑配制濃度分別為α-蒎烯464mg/L、β-蒎烯828mg/L、月桂烯778mg/L、D(+)-樟腦634mg/L、芳樟醇858mg/L、L-薄荷醇748mg/L、α-萜品醇494mg/L、右旋香芹酮558mg/L、香茅醇494mg/L、橙花醇496mg/L、(Z)-香葉基丙酮319mg/L、香葉醇354mg/L和(E)-香葉基丙酮478mg/L的標準混標原液，然后分別稀釋1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍和1000倍，利用這7個梯度稀釋后的溶液建立標準曲線，進行GC-FID分析。以單萜烯物質峰面積作為縱坐標，物質濃度作為橫坐標，使用Origin 8.0完成線性回歸。

1.4　單萜烯物質的萃取^[11]

分別取葡萄果汁和葡萄酒50ml，倒入250ml的分液漏斗中，加入等體積二氯甲烷萃取24h，萃取過程中反復振蕩達到充分混合，靜置分層后分離萃取液和萃余液，萃取液倒入圓底燒瓶中，封口待用。萃余液再分別加入30ml溶劑進行第2次和第3次萃取，均萃取24h。將3次萃取液合并，用旋轉蒸發儀濃縮至3ml左右，轉入5ml試管，再用2ml溶劑洗滌圓底燒瓶，洗液一并倒入試管中，氮吹至1ml以下，溶劑定容至1ml，用0.45μm膜過濾，濾液用于香氣物質檢測，次樣品為濃縮50倍。每個樣品做3個平行。

1.5 GC分析條件

Agilent 7820A GC-FID，色譜柱為HP-INNOWAX（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氮氣，流速1ml/min；升溫程序：初始溫度為50℃，保持10min；以3℃/min升溫至140℃，保持10min；以5℃/min升溫至200℃，保持1min；然后以10℃/min升至250℃，保持1min。

檢測器（FID）溫度280℃；進樣口溫度250℃；尾吹25ml/min；氫氣流量40ml/min，空氣流量400ml/min；1μl樣品不分流進樣。

2　結果與分析

2.1　單萜烯物質標準曲線

以香氣物質峰面積作為縱坐標，香氣物質濃度作為橫坐標，使用Origin 8.0完成線性回歸，得到GC-FID分析結果的線性關系（見表1），13種單萜烯類物質的標準品GC色譜圖如圖1所示。

由圖1可以看出，13種標準品的分離度都大于1.5，符合分離檢測的標準，說明檢測的方法適合對這13種單萜烯類物質進行檢測。

由表1可以看出，13種單萜烯物質的標準曲線的R²在0.9967～0.9993之間，說明線性關系較好，標準方程可以用于物質的定量。

方法的檢出限一般為基線噪聲3倍的該物質濃度，在試驗中可以反映對待測目標物質的靈敏性，測得的檢出限越小，說明儀器方法對所要測得的物質靈敏性比較高，所建方法對目標物質比較適合。表1中的各物質的檢出限在0.58～1.073mg/L之間，相對較小，可以滿足對各種物質的檢測要求，說明所建方法對單萜烯類物質的靈敏性滿足要求，適合對目標物質的檢測。方法的重復性可以用目標物質的相對標準偏差（RSD）來表示，RSD值越小說明重復性比較好，本研究中的RSD都在0.58%～3.18%范圍內，都小于5%，說明了方法的重復性較好。回收率用來評價測定方法的準確度，一般測定方法為向已知物質濃度的樣品中加入純目標物質，利用儀器測定濃度，然后進行分析。回收率計算公式為公式（1）^[12]。

　　（1）

表1中每種物質的回收率都是6種樣品的回收率，所以綜合為一個范圍，13種物質的回收率都在89.98%～107.34%，說明該方法在物質的定性與定量上較為準確，比較適合對單萜烯類物質的檢測。從對所建方法的R²、檢出限、RSD和回收率的檢測與分析可以看出，所建方法適合對樣品中單萜烯類物質的檢測。

2.2　葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質的檢測

本研究使用液液萃取的方法來獲得單萜烯類物質，結合GC-FID進行檢測，通過色譜圖上的保留時間與標準品色譜圖的比較，最終對物質進行定性定量。待測樣品分別包括沙城產區和昌黎產區的美樂葡萄、赤霞珠葡萄、經過SC釀酒酵母發酵過的2種葡萄的干紅葡萄酒和經過自選高產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母發酵過的2種葡萄的干紅葡萄酒，共12個樣品，每個做3個平行，定量去3次測定結果的平均值，物質含量按公式（2）計算。

　　（2）

萜烯及C13-降異戊二烯類物質對葡萄酒品種香氣形成起到了決定關鍵的作用，這類物質通常都具有濃郁的香氣和較低的感官閾值^[13]，這些物質是釀酒葡萄原料中潛在的非常重要的香氣成分，對葡萄酒品質起著舉足輕重的作用。由表2和圖2可以看出，沙城和昌黎產區的美樂葡萄汁、赤霞珠葡萄汁、經過SC酵母發酵后的美樂和赤霞珠干紅葡萄酒、經自選高產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母亞種16發酵后的美樂和赤霞珠干紅葡萄酒中各檢測到6、7、8、9、10、11、4、7、7、7、10和11種單萜烯類物質，經過酵母發酵后葡萄酒中的單萜烯種類和總含量都有明顯的增加，葡萄經過發酵后，由于發酵作用使葡萄酒中的單萜烯類物質總含量普遍存在升高的趨勢，且經自選高產β-葡萄糖苷酶酵母發酵后的葡萄酒中單萜烯類物質的種類數目和含量都要高于經商品菌SC酵母發酵后的葡萄酒。經過自選菌發酵后的赤霞珠干紅葡萄酒中的單萜烯類物質含量在葡萄汁的基礎上總含量的增加量最高，最高達到了308.88%，最低也達到了181.83%，而經過SC發酵后的酒中含量增加最高為90.80%，從增加量上來說高產β-葡萄糖苷酶的自選菌在增香上要優于商品菌，具有很好的增香效果。從總體來看，亞種16在提高單萜烯總含量作用上，對赤霞珠干紅酒的作用要好于對美樂葡萄酒的改善作用。

2.2.1　自選菌對沙城產區葡萄酒中單萜烯含量的影響

沙城產區美樂葡萄經過2種酵母的發酵作用后，單萜烯類物質的含量和種類數都呈現了增加的趨勢，葡萄汁中的總含量為0.502mg/L，經過SC酵母發酵后增長為0.959mg/L，而經過自選酵母亞種16發酵后含量上升為1.416mg/L。芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇和香葉醇在葡萄汁和葡萄酒中都被檢測到，含量有明顯的增加，尤其芳樟醇的含量在亞種16發酵后的葡萄酒中的含量為0.391mg/L，說明了這些物質在葡萄中天然存在一部分游離態，同時也存在結合態，這些結合態物質經過酵母的發酵作用而水解出游離態，導致含量增加；月桂烯和(Z)-香葉基丙酮只在經過亞種16發酵后的葡萄酒中被檢出，說明自選菌發酵過程中釋放的酶可以水解月桂烯和(Z)-香葉基丙酮結合態物質釋放單體，這兩種物質是典型的油脂香型物質。

沙城產區赤霞珠及赤霞珠葡萄酒中單萜烯物質含量要明顯高于美樂品種，葡萄汁中總含量為0.75mg/L，經過對照菌株發酵后總含量上升為1.142mg/L，而經過亞種16發酵后總含量達到最高為2.454mg/L，在果汁的基礎上提高了227.05%。2-莰酮、芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇是葡萄汁和葡萄酒中都具有的，在葡萄汁中芳樟醇的含量最高為0.206mg/L，經過亞種16發酵后含量增加了198%，達到了0.614mg/L，成為沙城產區赤霞珠葡萄酒中含量最高的單萜烯物質，使葡萄酒呈現了濃郁的玫瑰花香和果香^[14]；L-薄荷醇、右旋香芹酮和(E)-香葉基丙酮僅在亞種16發酵葡萄酒中被檢出，說明自選菌在發酵過程中所產生的β-葡萄糖苷酶可以水解這三種物質的結合態，從而釋放游離態單體物質，而SC酵母則不具備對其的水解作用；此外，α-蒎烯、2-莰酮在兩種發酵酒中都被檢測到，而在葡萄汁中則未被檢出，說明這兩種物質是發酵的產物，從含量上來說，亞種16發酵酒中含量要高于商品菌SC。

沙城產區的美樂葡萄和赤霞珠葡萄經過兩種酵母的發酵作用后，單萜烯類物質含量都有所增加，以自選菌亞種16為發酵菌的葡萄酒中的含量顯著增加，尤其赤霞珠干紅酒的含量從葡萄汁中的0.75mg/L增加為葡萄酒中的2.454mg/L，而且種類從6種增加到了11種。通過試驗分析可知，自選高產β-葡萄糖苷酶酵母菌亞種16在對沙城產區的美樂和赤霞珠葡萄酒增香作用上要優于對照菌SC酵母菌。

2.2.2　自選菌對昌黎產區葡萄酒中單萜烯含量的影響

昌黎美樂葡萄及葡萄酒中總共包含了10種單萜烯物質，有4種為3個樣品所共有，分別為芳樟醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇，其中芳樟醇在樣品中含量最高，在亞種16發酵酒中含量最高為0.645mg/L，是葡萄汁中含量的3.12倍，除此之外，香葉醇從葡萄汁經過SC酵母發酵后含量沒有增加，相對的經過亞種16發酵后含量大量增加，從0.093mg/L增加到0.207mg/L，增加了122.58%；月桂烯、L-薄荷醇和(Z)-香葉基丙酮僅在亞種16的發酵酒中被檢測到，總含量為0.074mg/L，這些物質是分別具有香脂香氣、薄荷香氣和香葉氣息^[15]；另外，α-蒎烯、2-莰酮和α-萜品醇是經過酵母發酵后產生，α-蒎烯的含量在SC發酵酒中的含量和亞種16發酵酒中的含量相差不大，說明該物質在昌黎美樂葡萄中的存在形式不是以β-葡萄糖苷酶的水解形式存在的，不會因為β-葡萄糖苷酶的存在而急劇的增加，2-莰酮和α-萜品醇的含量經過亞種16發酵后增加，尤其α-萜品醇SC發酵酒中的含量為0.077mg/L，而經過亞種16發酵后含量急劇增加到了0.318mg/L，這說明β-葡萄糖苷酶可以促進α-萜品醇由結合態水解為游離態。

由圖2可以看出，昌黎產區赤霞珠經過亞種16發酵后單萜烯的含量增加最多，從葡萄汁中的0.698mg/L增加到葡萄酒中的2.855mg/L，增加308.88%，而對照菌株SC酵母的發酵酒中的單萜烯物質含量在葡萄汁的基礎上僅僅增加了58.09%，變化不大。與其他實驗組相似，芳樟醇無論在葡萄汁還是葡萄酒中單萜烯的含量都是最高，在經過亞種16 發酵后的葡萄酒中的含量高達0.825mg/L，是葡萄汁中含量的3.29倍，由于其閾值為25μg/L^[16]，所以芳樟醇對昌黎赤霞珠亞種16發酵酒風味香氣影響較大，使酒體花香比較突出。此外，香茅醇、α-萜品醇和香葉醇在亞種16發酵酒中的含量也較高，僅次于芳樟醇，分別達到了0.617mg/L、0.367mg/L和0.305mg/L，分別是葡萄汁中含量的6.86、11.12和2.40倍，這三種物質使亞種16發酵酒具有花香、果香和青葉油香。α-蒎烯、月桂烯、L-薄荷醇、右旋香芹酮和(E)-香葉基丙酮僅僅存在于亞種16發酵酒中，在果汁和SC發酵酒中未被檢測到，說明這些物質是經過亞種16在發酵過程中釋放的物質水解相對應的結合態物質而最終釋放出；2-莰酮和橙花醇同時存在于葡萄汁和葡萄酒中，含量經過發酵后全部升高，尤其在亞種16中的含量增加明顯。

3　結論

本研究建立了一種同時檢測葡萄汁和葡萄酒中13種單萜烯類物質的方法，先以有機溶劑二氯甲烷進行液液萃取，然后旋轉蒸發、氮吹濃縮，再結合氣相色譜（GC）檢測技術，對兩個產區的兩個葡萄品的葡萄汁和經不同菌種發酵后的共12個樣品進行了檢測，結果顯示：高產β-葡萄糖苷酶的自選釀酒酵母在葡萄酒增香上相對于商品菌SC酵母具有明顯的優勢，對酒中單萜烯類物質含量增加幅度較大，極大地促進了葡萄中結合態的單萜烯前體物質水解成為游離態的單萜烯物質，并且數據顯示赤霞珠干紅酒中的單萜烯含量要高于美樂葡萄酒。此外，由實驗結果可以看出，本研究所建對葡萄酒中13種單萜烯的檢測方法具有簡單、靈敏性高、重復性好等優點，可以對葡萄及葡萄酒中的單萜烯物質進行定性定量的檢測。

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^*通信作者：李艷，女，教授，研究方向：傳統發酵工程創新技術研究、葡萄酒和果酒釀造。