實驗三　福林-酚試劑法測定蛋白質的濃度

一、實驗目的

1.學習利用呈色反應原理測定蛋白質濃度。

2.掌握福林（Folin）-酚試劑法測定蛋白質濃度的基本原理和操作。

二、實驗原理

蛋白質或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或帶有苯環結構的色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物）。在一定范圍內，藍色的深淺與蛋白質的含量成正比，可用比色法測定。

三、器材和試劑

1.器材

牛血清蛋白片，722型分光光度計，試管×10，移液管0.50mL×4、0.10mL×2、0.20mL×2、5.0mL×1。

2.試劑

（1）福林-酚試劑A　堿性銅溶液。

甲液：取Na₂CO₃ 2g溶于100mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液中。

乙液：取CuSO₄·5H₂O晶體0.5g，溶于1%酒石酸鉀100mL中。

臨用時按甲∶乙=50∶1混合使用。（一日內有效）

（2）福林-酚試劑B　將100g鎢酸鈉、25g鉬酸鈉、700mL蒸餾水、50mL 85%磷酸及100mL濃鹽酸置于1500mL的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回流10h，再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL及液溴數滴，開口煮沸15min，在通風櫥內驅除過量的溴。冷卻，稀釋至1000mL，過濾，濾液呈微綠色，儲存于棕色瓶中。臨用時，用1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑，根據滴定結果，將試劑稀釋至相當于1mol/L的酸。

（3）1mg/mL牛血清蛋白溶液　稱取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化鈉溶液中，并稀釋至1000mL。

（4）未知樣品溶液。

四、實驗內容

1.標準曲線測定

取8支干燥的試管，編號，按表2-1順序加入試劑，混勻，室溫放置10min，各管再加福林-酚試劑B 0.5mL，30min后比色（500nm），記錄各管吸光度數據，每個樣品讀數3次并記錄。

2.樣品測定

取2支干燥試管，編號，按測標準曲線方法（表2-1），依次加入樣品溶液0.5mL，福林-酚試劑A 4.0mL，混勻靜置10min，再加入福林-酚試劑B 0.5mL，混勻，反應30min后，500nm波長下測吸光度并記錄。

五、結果與分析

將所記錄數據填在數據記錄表中（表2-2）。

換算各標準曲線點含蛋白質質量，以蛋白質質量為橫坐標（mg）、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求得標準方程和R²。將樣品蛋白質吸光度代入方程，計算樣品蛋白質含量。

六、思考題

1.說明福林-酚試劑法的優缺點。

2.福林-酚試劑法較雙縮脲法靈敏，為什么？

3.為什么加入福林-酚試劑B后要馬上混勻？

七、注意事項

1.在實驗時，不要將牛血清蛋白和樣液加反。

2.福林-酚試劑B加入后，應立即混勻。

3.一定要注意實驗的時間，因為溶液的吸光光度值是隨著時間延長在不斷增大的，如果時間超過了30min，則測得的吸光光度值就不準確。

4.在使用分光光度計時，拿比色皿時要拿它的毛面，不可以用手接觸它的光滑面，防止自己手上的油污使測量值不準確。

5.在擦拭比色皿時，要順著一個方向擦。

6.在比色皿中裝入的液體量約為比色皿體積的2/3。