實(shí)驗(yàn)四　酵母RNA的提取及組分鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

1.掌握RNA的組分和鑒定方法。

2.學(xué)習(xí)稀堿法提取酵母RNA的原理與操作。

二、實(shí)驗(yàn)原理

由于RNA的來(lái)源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法是用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3～4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀堿法使用稀堿（本實(shí)驗(yàn)用 0.2% NaOH溶液）使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA（本實(shí)驗(yàn)）或調(diào)pH為2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA達(dá) 2.67%～10.0%，而DNA含量?jī)H為 0.03%～0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。

三、器材和試劑

1.器材

干酵母粉（市售），電子天平，100mL燒杯，50mL量筒，10mL量筒，0.5mL移液管，1mL 移液管，2mL 移液管，5mL移液管，離心機(jī)，錐形瓶，研缽，沸水浴裝置等。

2.試劑

（1）0.2%氫氧化鈉溶液　2g NaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000mL。

（2）濃鹽酸（AR）。

（3）95%乙醇。

（4）酸性乙醇（CP）。

（5）氨水（CP）。

（6）10%硫酸溶液　濃硫酸（相對(duì)密度1.84）10mL，緩緩傾于水中，稀釋至100mL。

（7）5%硝酸銀溶液　5g AgNO₃溶于蒸餾水并稀釋至100mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中。

（8）苔黑酚-三氯化鐵試劑　將100mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mg FeCl₃·6H₂O。臨用時(shí)配制。

（9）定磷試劑。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1. RNA的提取

稱取8g干酵母粉于100mL研缽中，干研磨，轉(zhuǎn)入錐形瓶后加入 0.2% NaOH溶液 40mL，沸水浴加熱 30min，經(jīng)常攪拌，冷卻后離心5min（4000r/min）。取上清液，緩慢加入至30mL酸性乙醇中，邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉淀，離心5min（4000r/min），沉淀備用。

向沉淀中加10%硫酸液10mL，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加熱至澄清，將RNA水解，即為水解液，進(jìn)行組分鑒定。

2.鑒定

（1）核糖　取水解液1mL，加苔黑酚-三氯化鐵試劑 1mL，水浴加熱，觀察顏色變化。

（2）嘌呤堿　取水解液1mL，加氨水2mL及硝酸銀溶液1mL，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置幾分鐘）。

（3）磷酸　取水解液1mL、定磷試劑1mL，水浴加熱，觀察顏色變化。

五、結(jié)果與分析

觀察記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的現(xiàn)象，對(duì)其中重要的現(xiàn)象（比如分層、沉淀產(chǎn)生、顏色反應(yīng)等）作分析討論。

六、思考題

1.所得RNA是否是純品？如何進(jìn)一步純化？

2. RNA提取過(guò)程中的關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)有哪些？

3.本法提取的RNA是否具有生物活性？為什么？

七、注意事項(xiàng)

1. RNA水解過(guò)程中，需要邊加熱邊攪拌。

2.鑒定嘌呤堿時(shí)，如果現(xiàn)象不明顯，可適當(dāng)多加1mL氨水，然后加硝酸銀。