實(shí)驗(yàn)二　蛋白質(zhì)濃度測(cè)定（凱氏定氮法）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

1.學(xué)習(xí)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作技術(shù)。

2.學(xué)會(huì)使用凱氏定氮儀。

二、實(shí)驗(yàn)原理

生物材料的氨基酸含量測(cè)定在生物化學(xué)研究中具有一定的意義，凱氏定氮法是目前常用的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法。該方法是利用蛋白質(zhì)中含氮量約為16%，且相對(duì)恒定，測(cè)出含氮量，從而可推知蛋白質(zhì)含量。實(shí)驗(yàn)分消化和測(cè)定兩個(gè)部分。

消化是有機(jī)物（蛋白質(zhì)）與濃硫酸共熱，使有機(jī)氮全部轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氮——硫酸銨。為加快反應(yīng)，往往在消化時(shí)添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物；前者為催化劑，后者可提高硫酸沸點(diǎn)。以甘氨酸為例，消化過(guò)程可表示如下：

CH₂NH₂COOH+3H₂SO₄ 2CO₂+3SO₂+4H₂O+NH₃

2NH₃+H₂SO₄ （NH₄）₂SO₄

濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來(lái)的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的物質(zhì)的量（相當(dāng)于待測(cè)物中氨的物質(zhì)的量）計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。

本法適用于0.2 ～ 2.0mg的氮量測(cè)定。

三、器材和試劑

1.器材

凱氏定氮燒瓶，凱氏定氮蒸餾裝置，50mL容量瓶，3mL微量滴定管，分析天平，烘箱，電爐，100mL蒸餾燒瓶，小玻璃珠，坩堝鉗，錐形瓶，鐵架臺(tái)等。

2.試劑

（1）濃硫酸　200mL。

（2）粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物　16g（K₂SO₄與CuSO₄·5H₂O以3∶1配比研磨混合）。

（3）30%氫氧化鈉溶液　1000mL 。

（4）2%硼酸溶液　5000mL。

（5）標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液　約0.01mol/L。

（6）混合指示劑（田氏指示劑）　由50mL 0.1%美藍(lán)乙醇溶液與200mL 0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成，儲(chǔ)存于棕色瓶中備用。這種指示劑酸性時(shí)為紫紅色，堿性時(shí)為綠色。變色范圍窄且靈敏。

（7）市售標(biāo)準(zhǔn)面粉和富強(qiáng)粉　各2g。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.樣品處理

固體樣品測(cè)定時(shí)需烘干至恒重。在稱量瓶中稱一定量磨細(xì)的樣品（如0.1g左右的干燥面粉），然后置于105℃的烘箱內(nèi)干燥4h。用坩堝鉗將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1h后，稱重一次，直到兩次稱量數(shù)值不變，即達(dá)恒重。

液體樣品（如血清等），可取一定體積樣品直接消化測(cè)定。

2.消化

取4個(gè)100mL凱氏燒瓶，標(biāo)號(hào)。各加1顆玻璃珠，在1號(hào)及2號(hào)瓶中各加樣品0.1g，催化劑（K₂SO₄-CuSO₄·5H₂O）200mg，消化液（濃硫酸）5mL。在3號(hào)及4號(hào)瓶中各加0.1mL蒸餾水和與1號(hào)及2號(hào)瓶相同量的催化劑和濃硫酸，作為對(duì)照，用以測(cè)定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。每個(gè)瓶口放一漏斗，在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上消化。注意加樣品時(shí)應(yīng)直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶頸上。當(dāng)消化開(kāi)始時(shí)應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶?jī)?nèi)水汽蒸完，硫酸開(kāi)始分解并放出SO₂白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明淡綠色為止。

定容：冷卻后，加蒸餾水約10mL（注意慢加，隨加隨搖），然后將瓶中溶液傾入50mL的容量瓶中，并以蒸餾水洗燒瓶數(shù)次，將洗液并入容量瓶，用水稀釋到刻度，混勻備用。

3.連接和洗滌凱氏定氮儀

按照?qǐng)D2-3連接凱氏定氮儀，在P₁、P₃、P₄位置夾上自由夾后，將其固定在鐵架臺(tái)上，并調(diào)試好。

①接通冷凝水，先向蒸汽發(fā)生器中加入一定量的水（先關(guān)閉進(jìn)水口，以排水口高度為宜），將蒸餾水由加樣室加入反應(yīng)室，用電磁爐將其加熱燒開(kāi)，讓發(fā)生器中蒸汽通過(guò)氣孔進(jìn)入反應(yīng)室。

②將電磁爐移開(kāi)片刻，打開(kāi)自由夾P₃，使冷水進(jìn)入蒸汽發(fā)生器，此時(shí)由于蒸汽發(fā)生器產(chǎn)生負(fù)壓，將反應(yīng)室中蒸餾水吸出，待蒸汽發(fā)生器水位距離反應(yīng)室孔約2cm左右，關(guān)閉自由夾P₃，之后打開(kāi)蒸汽發(fā)生器放水閥P₁，使水位下降到排水口高度。再次將蒸餾水加入到反應(yīng)室中，如此反復(fù)清洗3～5次。

③清洗后在冷凝管下端放一錐形瓶（盛有5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示劑的混合液）。如不變色則表明蒸餾裝置內(nèi)部已洗滌干凈。

4.蒸餾

（1）準(zhǔn)備工作　50mL錐形瓶數(shù)個(gè)，各加入5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示劑，溶液呈淡紫色，用表面皿覆蓋備用。關(guān)閉冷凝水，打開(kāi)自由夾P₄，使蒸汽發(fā)生器與大氣相通。將一個(gè)盛有硼酸和指示劑溶液的錐形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸沒(méi)在液體內(nèi)。

（2）加樣　用移液管取5mL消化液，細(xì)心地通過(guò)加樣室加入反應(yīng)室中，隨后加入30% NaOH溶液5mL，立即關(guān)閉自由夾P₄，在加樣漏斗中加少量蒸餾水做水封。

（3）蒸餾

①打開(kāi)冷凝水（注意不要過(guò)快過(guò)猛，以免水溢出）。

②打開(kāi)電磁爐，蒸餾開(kāi)始，當(dāng)觀察到錐形瓶中的溶液由紫變綠時(shí)（約2～3min），開(kāi)始計(jì)時(shí)，蒸餾3min，移開(kāi)錐形瓶，使冷凝器下端離開(kāi)液面約1cm，同時(shí)用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外側(cè)，繼續(xù)蒸餾1min，取下錐形瓶，用表面皿覆蓋瓶口。

蒸餾完畢后，應(yīng)立即清洗反應(yīng)室，方法如前所述。如此3～5次。最后將自由夾P₁、P₃同時(shí)打開(kāi)，將蒸汽發(fā)生器內(nèi)的全部廢水換掉，繼續(xù)下一次蒸餾。

待樣品和空白消化液均蒸餾完畢，同時(shí)進(jìn)行滴定。

5.滴定

全部蒸餾完畢后，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，硼酸指示劑溶液由綠變淡紫色為滴定終點(diǎn)。記錄滴定現(xiàn)象和數(shù)據(jù)。

五、結(jié)果與分析

樣品總含氮量計(jì)算公式如下：

式中，c為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液物質(zhì)的量濃度，mol/L；V₁為滴定樣品用去的鹽酸溶液平均體積，mL；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；V₂為滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均體積，mL； W為樣品質(zhì)量，g；5為測(cè)定時(shí)消耗的消化液體積，mL；100為換算為每100g樣品中所含有的含氮量。

若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)，則樣品中蛋白質(zhì)含量：

蛋白質(zhì)含量（g/100g）=總氮量×6.25

六、思考題

1.何謂消化？如何判斷消化終點(diǎn)？

2.在實(shí)驗(yàn)中加入粉末硫酸鉀-硫酸銅混合物的作用是什么？

3.固體樣品為什么要烘干？

4.蒸餾時(shí)冷凝管下端為什么要浸沒(méi)在液體中？

5.如何證明蒸餾器洗滌干凈了？本實(shí)驗(yàn)應(yīng)如何避免誤差？

七、注意事項(xiàng)

1.測(cè)定開(kāi)始前，要確保凱氏定氮儀已經(jīng)洗滌干凈。

2.在反應(yīng)室中加入NaOH前，將冷凝管口浸沒(méi)在硼酸指示劑溶液內(nèi)，以確保產(chǎn)生的NH₃被硼酸全部吸收。

3.從觀察到硼酸指示劑溶液變綠色開(kāi)始，繼續(xù)吸收冷凝液3min，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管管口。